Onco针对Ther。2018; 11: 5239–5252.
miR-361-5p通过靶向SND1抑制胶质瘤的迁移和侵袭
，1,2,* ，三，* ，三，* ，2,4,5 ，2,4,5 ，2,4,5 ，2,4,5 ，2,4,5 ，2,4,5 ，2,4,5 ，2,4,5 ，1和2,4,5
杨杰（音译）
三天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津300070，中华人民共和国
林宇（Lin Yu）
三天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津300070，中华人民共和国
李伟平
1深圳大学第一附属医院神经外科和深圳市神经外科重点实验室，深圳市第二人民医院，深圳大学医学院，深圳518035，nc.ude.uzz@ilpw
三天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津300070，中华人民共和国
通信地址：中华人民共和国天津市和平区鞍山路154号天津医科大学总医院天津神经研究所神经病理科俞世珠，邮编：300052，电话/传真+86 22 6081 7518，电子邮件moc.361@uhzihsuyjt 李伟平，深圳大学第一附属医院神经外科和深圳市神经外科重点实验室，深圳市第二人民医院，深圳大学医学院福田区孙岗西路3002号，邮编518035，电话/传真+86 755 8335 6952，电子邮件nc.ude.uzz@ilpw *这些作者对这项工作贡献均等
版权所有©2018 Liu等人。本作品由Dove Medical Press Limited出版并授权 摘要
背景
miR-361-5p的下调有助于胶质瘤细胞的上皮-间质转化。然而，miR-361-5p与胶质瘤迁移和侵袭的相关性尚不清楚。
材料和方法
通过原位杂交、免疫组织化学和Western blot分析了120例人脑胶质瘤和8个胶质瘤细胞系中miR-361-5p和SND1表达的关系。采用双荧光素酶报告子分析确定SND1为miR-361-5p的靶点。通过体外实验研究miR-361-5p抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭的机制。
结果
miR-361-5p在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中的表达显著下调，并且与胶质瘤分级呈负相关。然而，SND1表达与胶质瘤分级呈正相关，与miR-361-5p表达呈负相关。miR-361-5p过表达通过靶向SND1并随后降低MMP-2表达来抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。在胶质瘤细胞系中，SND1过度表达可部分逆转miR-361-5p的抗肿瘤作用。
结论
研究结果表明，miR-361-5p直接靶向SND1降解，然后降低MMP-2基因转录，从而抑制胶质瘤的迁移和侵袭。miR-361-5p是一种重要的肿瘤抑制因子和新的胶质瘤诊断生物标志物，miR-361-5p和SND1是恶性胶质瘤潜在的治疗候选药物。
关键词：miR-361-5p，胶质瘤，SND1，迁移，侵袭
介绍
胶质瘤是大脑中最常见的肿瘤，也是最致命的癌症之一。最具侵袭性的胶质瘤，多形性胶质母细胞瘤（GBM）的中位生存期只有15个月。1GBM侵袭性强，预后差，生存率低。2尽管神经外科技术取得了重大进展，并引入了新的化学疗法，但GBM患者的总体预后仍不容乐观。三因此，迫切需要新的治疗GBM的方法。
miRNAs是小的非编码RNA，是转录后基因表达的重要负调控因子，通过直接靶向靶mRNAs的3′-UTR发挥作用。4大量研究表明，miRNA在各种人类恶性肿瘤中异常表达。恶性肿瘤中的抑瘤或致癌miRNA可以破坏正常的调控。5到目前为止，miR-361-5p还没有被描述为致癌miRNA或抑癌miRNA。一项关于前列腺癌的研究报告称，miR-361-5p可以通过靶向STAT6发挥抑癌作用。6然而，在宫颈癌中，它是一种致癌的miRNA，通过介导上皮-间充质转化（EMT）促进其进展。7一些研究还表明，miR-361-5p在人类皮肤鳞癌、胃癌和肺癌中可能发挥重要作用，但其潜在机制尚不十分清楚。8——10最近有报道称，miR-361-5p可以通过靶向Twist1抑制胶质瘤中的EMT。11然而，miR-361-5p与胶质瘤的迁移和侵袭的相关性尚不清楚。
SND1也被命名为Tudor-SN、p100或TSN，是一种转录辅激活子，可与EBNA-2、Pim-1、STAT6和STAT5相互作用，并有助于促进其转录活性。12——15此外，作为RNA诱导沉默复合物的成分之一，SND1与AEG-1相互作用，导致肿瘤抑制mRNA的降解增加，从而对结肠癌、肝癌和乳腺癌产生致癌作用。16——18最近，研究报道SND1也通过参与成熟miRNA前体的加工来调节miRNA的表达。19，20
众所周知，肿瘤细胞分泌的MMP-2蛋白最基本的作用是降解细胞外基质（ECM），从而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。21在胶质瘤中，与低度星形细胞瘤相比，基质金属蛋白酶-2在GBM中的表达最高，基质金属酶-2是胶质瘤细胞侵袭和迁移的最重要因素。22，23
在本研究中，我们首次证实了miR-361-5p下调导致SND1在胶质瘤中过度表达，miR-361-5p上调可能通过直接靶向SND1抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。此外，我们发现SND1可能激活GBM细胞中MMP-2基因的转录，导致细胞运动和ECM的消化增加，从而促进GBM细胞的迁移和侵袭。我们目前的数据表明，miR-361-5p可能是人类恶性胶质瘤的一种新的诊断生物标志物和潜在的治疗靶点。
材料和方法
组织样本和载玻片制备
收集天津医科大学总医院（TMUGH）收治的120例星形胶质细胞瘤和20例非肿瘤脑组织（对照组）的手术标本，并获得所有患者的书面知情同意书。20个非肿瘤脑组织样本是通过对创伤性脑损伤进行减压颅骨切除术获得的。手术切除后，标本立即固定在3.7%的甲醛缓冲溶液中。将福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品储存在室温（RT）下。切取5μm厚的FFPE组织切片进行H&E染色、miR-361-5p原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）检测SND1。根据2016年世界卫生组织（WHO）对中枢神经系统肿瘤的分类，2名神经病理学专家独立进行了病理诊断。24所有胶质瘤组织样本的病理诊断见本研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的，并经TMUGH道德委员会批准。
表1
| 组 | 小计 | 子类型 | 年龄
| 性别
|
|---|
| ≥45 | <45 | 女性 | 男性 |
|---|
| 世界卫生组织II | 40 | 25弥漫性星形细胞瘤 | 9 | 16 | 12 | 13 |
| | 4少星形细胞瘤 | 三 | 1 | 1 | 三 |
| | 11少突胶质细胞瘤 | 5 | 6 | 5 | 6 |
| 世卫组织III | 40 | 间变性星形细胞瘤 | 24 | 16 | 18 | 22 |
| 世界卫生组织IV | 40 | 胶质母细胞瘤 | 31 | 9 | 13 | 27 |
| 总计 | 120 | | | | | |
ISH和IHC
对于ISH检测，用50 nM LNA修饰和地高辛标记的miR-361-5p寡核苷酸探针（Exiqon，Vedbaek，Denmark）在55°C下杂交1小时，用5μg/mL抗地高辛-罗丹明抗体（Roche Applied Science，Penzberg，Germany）在4°C下孵育过夜，RT时，在黑暗中用DAPI染色15分钟。细胞质中的红色荧光显示阳性信号。IHC染色是根据标准ABC方案用小鼠抗人SND1抗体（1:100；英国剑桥Abcam）进行的。细胞质中的棕色信号被认为是阳性结果。标记指数（LI）计算为阳性细胞数占总细胞数的百分比。
细胞系和细胞培养
人脑胶质瘤细胞系U87MG、LN229和U118取自美国类型培养库（ATCC）；U251、SNB19和LN308购自中国科学院细胞库（中华人民共和国上海）。我们还检测了国产人GBM细胞系TJ899和TJ905中miR-361-5p和SND1蛋白的表达，因为它们在一定程度上反映了中国患者的生物学特征。TJ899和TJ905细胞系由TMUGH神经研究所建立。TJ899细胞系取自一名男性颞枕部胶质瘤患者的手术标本，而TJ905细胞系取材于一名男性顶叶胶质瘤患者。两例患者均经组织病理学检查确诊为GBM。还使用了永生化的正常人星形胶质细胞系UC2。它由德克萨斯大学西南医学中心（UTSW）提供。细胞在DMEM（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中培养，37°C，5%CO2。
miR-361-5p模拟物和SND1-过表达pSG5-SND1转染
miR-361-5p模拟物和干扰序列（Scr）的dsRNA寡核苷酸购自Ribobio。转染前，将对数生长期的U87MG和U251细胞株接种到60 mm平板中，直到细胞生长到50%的汇合处。miR-361-5p组和Scr组的U87MG和U251细胞分别使用10μL X-tremeGENE siRNA转染试剂（瑞士巴塞尔Hoffmann-La Roche有限公司）以50 nM的最终浓度转染相应的dsRNA寡核苷酸（2μg）48小时。
如前所述构建SND1过表达质粒pSG5-SND1和对照质粒pSG5。25转染前，将对数生长期的U87MG和U251细胞系接种到60mm平板中，直到细胞生长到90%汇合。然后，使用10μL X-tremeGENE siRNA转染试剂（Hoffmann-La Roche Ltd.）和pSG5（5μg）或pSG5-SND1（5μg）或pSP5-SND1-（5μg/），使用5μL X-stremGENE HP转染试剂，将U87MG和U251细胞系与pSG5-SND1（2μg）或者对照pSG5和miR-361-5p模拟物（1μg）共转染48小时。
定量逆转录PCR（qRT-PCR）
使用TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific）提取每组2个细胞系的总RNA。miR-361-5p用隆起miRNA qRT-PCR检测试剂盒（Ribobio）定量。采用逆转录系统和GoTaq qPCR Master Mix Kit（Promega）对SND1 mRNA进行qRT-PCR检测，U6和GAPDH分别作为miR-361-5p和SND1的内对照。SND1检测的特定引物列于所有反应均在CFX Connect™实时PCR检测系统（Bio-Read）上进行。miR-361-5p和SND1 mRNA水平的倍数变化由2-ΔΔCt方法。
表2
| 底漆 | 顺序 | |
|---|
| 序号1 | 福沃德 | 5′-CTTATCACTCTTGCTTGCAG-3′ |
| 反向 | 5′-AAAAGTGTAGCTTCCTCGCTGA-3′ |
| GAPDH公司 | 福沃德 | 5′-TGCACCACACTCGCTTAGC-3′ |
| 反向 | 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′ |
蛋白质印迹
收集细胞并在RIPA（Solarbio）中进行裂解。用BCA法定量蛋白质浓度，用SDS-PAGE分离每个样品的总蛋白20μg。根据标准程序进行蛋白质印迹。根据制造商的说明，在Western blot分析中使用了针对SND1（Abcam）、MMP-2（Cell Signaling Technology）和β-actin（Boster）的抗体。
荧光素酶质粒的构建
使用TargetScan预测miR-361-5p的候选靶点(http://www.Targetscan.org/). 应用pEZX-MT01荧光素酶miRNA表达报告载体（GeneCopoeia）构建SND1 3′-UTR的野生（p-WT）和突变（p-MT）报告载体。SND1 3′-UTR包含一个预测的高度保守的miR-361-5p靶区。从U87MG总RNA中通过RT-PCR获得了编码SND1全长3′-UTR的cDNA片段，并将SND1的207个3′-URT碱基对插入到pEZX-MT01载体（GeneCopoeia）的相应位点构建p-WT。我们还利用酶切技术构建了SND1 3′-UTR的p-MT缺失。通过DNA测序验证了两种载体中插入物的序列和方向。
双荧光素酶报告分析
转染前，将对数生长期的U87MG和U251细胞系接种到96孔板中，直到细胞生长到90%汇合。然后，使用0.8μL X-tremeGENE siRNA转染试剂（Hoffmann-La Roche Ltd.），用0.15μg p-WT或p-MT和0.08μg miR-361-5p模拟物或Scr共同转染U87MG和U251细胞48小时。通过仅使用上述重组报告载体转染2个细胞系来建立模拟对照。在Synergy 2 Microplate Reader荧光计（BioTek）上使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）检测Renilla和萤火虫荧光素酶的活性。将结果与萤火虫荧光素酶的测量值进行归一化后显示。
井间迁移和侵入分析
分别使用带有或不带有1:4稀释Matrigel（BD Biosciences）涂层的Transwell插入物（24孔，8-μm孔径；EMD Millipore，Billerica，MA，USA）评估细胞的侵袭和迁移能力。GBM细胞以3.5×10的最终密度悬浮4细胞/mL的无血清培养基中，并接种在室的上部孔中。培养箱的下孔含有补充有10%FBS的培养基。24小时后，用棉签去除过滤器上表面的细胞。通过过滤器迁移到下表面的细胞用4%多聚甲醛固定，并用1%结晶紫染色。每个腔室从3个随机选择的区域对细胞进行计数。
基于细胞的划痕分析
对于本试验，1×105每组细胞在6孔板中生长成融合单层，并用移液管尖端均匀划伤。然后用HBSS冲洗细胞两次，并在无血清DMEM中培养0、12和24小时。通过ImageJ程序从显微镜（Olympus）拍摄的缺口伤口区域的3个不同位置的图像中测量伤口面积。测量三个不同部位的伤口面积，并从三个独立实验中求出平均值。
染色质免疫沉淀（ChIP）
根据制造商的协议，使用EZ-Magna-ChIP™-染色质免疫沉淀试剂盒（EMD-Millipore）进行ChIP分析。用抗SND1抗体（8μg；Abcam）和抗IgG抗体（8微克；Sigma，St Louis，MO，USA）进行免疫沉淀。纯化的免疫沉淀DNA样本用于PCR。底漆由Sangon生物技术有限公司（中国上海）合成。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离，并通过溴化乙锭染色进行可视化。qPCR也用于检测纯化的免疫沉淀DNA样品。
SND1救援实验
将培养在6孔板中的U87MG和U251细胞随机分为Scr+pSG5组、miR-361-5p+pSG5+SND1组。如前所述进行细胞转染和蛋白质定量。然后，通过如上所述的transwell室迁移和入侵测定来检测细胞的迁移和入侵能力。
统计分析
所有统计分析均使用SPSS 18.0软件进行。数据以平均值±SD表示。使用Kolmogorov–Smirnov检验估计分布的正态性。样本组之间的差异通过单因素方差分析或Student’s分析t吨-测试。采用Pearson相关分析确定miR-361-5p与SND1蛋白之间的相关性。为了确定miR-361-5p和SND1表达在胶质瘤诊断中的最佳截止水平，进行了受体操作特征（ROC）曲线分析。为了确定最佳截止水平，使用Youden指数（J=敏感性+特异性-1）。获得最高尤登指数的截止值被视为最佳截止水平。与P（P）-值<0.05被认为具有统计学意义。统计显著性在P（P）< 0.05 (*),P（P）< 0.01 (**)，或P（P）< 0.001 (***). 所有细胞系的实验都用三份样品至少进行了三次。
结果
miR-361-5p在胶质瘤中降低并与分级相关
为了确定miR-361-5p在胶质瘤中的表达与组织病理学分级之间的关系，采用LNA修饰探针，通过ISH检测120例胶质瘤和20例非肿瘤对照脑组织的FFPE标本中内源性miR-361-5p水平。我们发现miR-361-5p在胶质瘤中的表达低于对照组(P（P）<0.001），随着胶质瘤分级的增加，表达显著降低，在GBM中最低(P（P）< 0.001;). 低度恶性胶质瘤与高度恶性胶质瘤miR-361-5p表达的ROC曲线显示，ROC曲线下面积为0.9481（95%CI:0.8956-0.9819，P（P）< 0.0001;)表明miR-361-5p在胶质瘤组织中的表达有助于胶质瘤分级。miR-361-5p LI诊断胶质瘤的最佳临界值≤12.78%（敏感性68.75%；特异性97.5%）。
胶质瘤中miR-361-5p下调及其与SND1表达的相关性。(A类)miR-361-5p ISH检测的代表性图像。比例尺，50μm。(B类)120例胶质瘤和20例非肿瘤对照脑组织的FFPE样本中miR-361-5p表达水平（LI，%）组间的比较。用Leica Image Pro Plus 5.0软件根据阳性细胞数占总细胞数的百分比计算每个样本的miR-361-5p LI（%）。中的数据(B类)表示为平均值±SD。***P（P）< 0.001. (C类)SND1 IHC检测的代表性图像。比例尺，50μm。(D类)上述FFPE样本中各组SND1表达水平（LI，%）的比较。每个样品的SND1 LI（%）计算如下：(B类). 中的数据(D类)表示为平均值±SD。***P（P）< 0.001. (E类)上述FFPE样本中SND1和miR-361-5p表达之间的Pearson相关性分析。(F类)qRT-PCR检测8个胶质瘤细胞系和1个永生正常人星形胶质细胞系UC2中miR-361-5p的表达。(G公司和H（H）)如图所示，对细胞中SND1蛋白表达进行Western blot分析。SND1的相对表达水平根据β-肌动蛋白标准化。(我)上述细胞系中miR-361-5p和SND1蛋白表达的Pearson相关分析。所有实验均至少进行了三次(F类和G公司)表示为平均值±SD。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.
缩写：原位杂交；LI，标记指数；FFPE，福尔马林固定，嵌蜡；IHC、免疫组织化学；qRT-PCR，定量逆转录PCR。
ROC曲线确定miR-361-5p和SND1诊断胶质瘤的特异性和敏感性。(A类)miR-361-5p在胶质瘤中的表达。(B类)ROC曲线下面积为0.9388（95%CI:0.8956–0.9819，P（P）< 0.0001). miR-361-5p LI诊断胶质瘤的最佳临界值≤12.78%（敏感性68.75%；特异性97.5%）。(C类)SND1在胶质瘤中的表达。(D类)ROC曲线下面积为0.9225（95%CI:0.8760-0.9690，P（P）< 0.0001). 使用miR-361-5p LI诊断神经胶质瘤的最佳截止值≥33.93%（敏感性681.25%；特异性100%）。
缩写：ROC，接收机工作特性；LI，标记指数；AUC，曲线下面积。
SND1与分级相关，其在胶质瘤中的过度表达与miR-361-5p下调相关
然后，我们通过IHC检测了胶质瘤FFPE标本和对照脑组织中的SND1，发现SND1在胶质瘤中的表达高于对照脑组织(P（P）<0.001），并且随着胶质瘤分级的增加，表达显著增加，在GBM中最高(P（P）< 0.001;). 此外，在胶质瘤中，SND1的表达与miR-361-5p的表达呈负相关(第页= 0.860,P（P）< 0.0001;). 低度恶性胶质瘤和高度恶性胶质瘤SND1表达的ROC曲线显示，ROC曲线下面积为0.9225（95%CI:0.8760-0.9690，P（P）< 0.0001;)表明SND1在胶质瘤组织中的表达有助于胶质瘤分级。miR-361-5p LI诊断胶质瘤的最佳临界值≥33.93%（敏感性681.25%；特异性100%）。
miR-361-5p在胶质瘤细胞系中的表达与SND1的表达呈负相关
我们还分析了miR-361-5p和SND1蛋白在永生化正常人星形胶质细胞细胞系UC2和胶质瘤细胞系LN229、LN308、U118、U251、SNB19、TJ905、TJ899和U87MG中的表达。结果表明，上述8种GBM细胞系中miR-361-5p的表达显著低于永生化正常人星形胶质细胞系UC2(P（P）< 0.001;). 然而，SND1蛋白的表达有相反的趋势(P（P）<0.05–0.001；). Pearson相关分析显示miR-361-5p的表达与SND1蛋白呈负相关(第页= −0.540,P（P）< 0.01;).
SND1是miR-361-5p在人脑胶质瘤细胞中的直接靶点
TargetScan预测显示SND1 mRNA的3′-UTR包含一个保守的靶区，该靶区与miR-361-5p结合(). 为了证实这一预测，我们通过qRT-PCR和Western blot监测了miR-361-5p转染细胞系中miR-361~5p水平和SND1水平的变化。如所示在转染miR-361-5p的细胞株中，SND1的mRNA和蛋白显著降低(P（P）<0.05-0.001），与阴性对照组相比。结果表明，miR-361-5p可能直接靶向GBM细胞中的SND1，并通过诱导其mRNA降解下调SND1蛋白的表达。p-WT转录的重组萤光素酶信使核糖核酸携带在SND1 3′-UTR中预测的miR-361-5p靶区（SND1-3′-UTR-WT），而p-MT转录的信使核糖核酸缺乏预测的靶区（SND1-3′-UTR-MT）(). 双重荧光素酶分析表明，miR-361-5p共转染导致p-WT转染细胞中荧光素素酶活性降低约50%，但p-MT转染细胞无变化(P（P）< 0.01;).
SND1是miR-361-5p的直接靶点。(A类)用TargetScan预测SND1 3′-UTR中miR-361-5p结合位点。由p-WT和p-MT转录的重组荧光素酶mRNA中携带的野生（SND1-3′-UTR-WT）和突变（SND1-3'-UTR-MT）SND13′-UTR(B类和C类)在用p-WT或p-MT（Mock）转染的U87MG和U251细胞中，以及用p-WT或p-MT和Scr或miR-361-5p模拟物共转染的U87MG和U251细胞中进行萤光素酶报告基因测定。(D类)所示细胞SND1 mRNA表达的qRT-PCR分析。它们的相对表达水平根据GAPDH标准化。转染Scr的SND1/GAPDH比率被任意设置为1.0。(E类和F类)如图所示，对细胞中SND1蛋白表达进行Western blot分析。SND1的相对表达水平根据β-肌动蛋白标准化。所有实验均至少进行了三次(B类——F）表示为平均值±SD。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01.
缩写：qRT-PCR，定量逆转录PCR。
miR-361-5p抑制GBM细胞系的迁移和侵袭
经井腔迁移和侵袭实验表明，miR-361-5p转染组的迁移和侵袭能力显著低于相应的对照组(P（P）< 0.05–0.001;). 然后我们用miR-361-5p转染后检测MMP-2蛋白的表达。结果表明，miR-361-5p的过度表达可有效下调MMP-2蛋白的表达(P（P）< 0.001;). 我们还使用基于细胞的划痕试验检测GBM细胞的迁移，并且通过穿孔室迁移试验获得了类似的结果(P（P）< 0.001;). 上述结果表明，miR-361-5p可降低MMP-2的表达，从而抑制GBM细胞的迁移和侵袭。
miR-361-5p抑制胶质母细胞瘤细胞系的迁移和侵袭。(A类和B类)井间迁移和侵入试验。迁移和侵袭能力通过每个微观区域迁移到或侵入膜底面的细胞数量来反映。(C类和D类)如图所示，量化细胞的跨膜迁移和侵袭能力。(E类和F类)所示细胞中MMP-2蛋白表达的Western blot分析。MMP-2的相对表达水平根据β-肌动蛋白标准化。所有实验均至少进行了三次(C类——F类)表示为平均值±SD。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.
基于细胞的划痕分析显示miR-361-5p抑制胶质母细胞瘤细胞系的迁移。(A类和C类)在基于细胞的划痕试验中，与对照组（U87MG-Scr）相比，miR-361-5p处理的U87MG组在12小时和24小时时细胞迁移显著减少。(B类和D类)miR-361-5p处理的U251组在24小时时显示细胞迁移减少。所有实验至少进行了三次(C类和D类)表示为平均值±SD。***P（P）< 0.001.
SND1可通过基因转录激活诱导MMP-2的表达
MMP-2对恶性肿瘤的侵袭起着至关重要的作用。为了进一步确定SND1过度表达是否通过上调MMP-2的表达促进GBM细胞的侵袭，我们使用Western blot检测了U87MG-pSG5、U87MG-pSG5-SND1、U251-pSG5和U251-pSG5-SND2细胞中SND1和MMP-2蛋白的表达。结果表明，SND1的过表达可导致MMP-2表达的相应增加(P（P）< 0.01–0.001;). 然后，我们对上述细胞进行了标准ChIP分析。我们发现MMP-2启动子的SND1结合区域（−493至−471 bp和−251至−219 bp）都与所有细胞中的SND1-蛋白结合。此外，在表达高SND1水平的U87MG-pSG5-SND1和U251-pSG5-SND2细胞中，与表达相对较低SND1的U87MG-pSG5或U251-pSG5细胞相比，与SND1结合的DNA启动子数量增加了2到3倍(P（P）< 0.01;). 总之，我们的研究结果表明，SND1在体内与MMP-2启动子中的SND1-binding位点特异结合。
SND1通过基因转录促进MMP-2表达。(A类和B类)Western blot分析SND1和MMP-2蛋白在细胞中的表达。SND1和MMP-2的相对表达水平根据β-肌动蛋白进行标准化。(C类——F类)使用U87MG-pSG5、U87MG-pSG5-SND1、U251-pSG5和U251-pSG5-SND2细胞进行ChIP分析。用抗SND1抗体或正常IgG免疫沉淀细胞的染色质片段，并进行PCR。(C类和E类)10%的总细胞裂解物在免疫沉淀前进行PCR。(D类和F类)相对带强度计算为沉淀与每个细胞系输入DNA之间的比率。所有实验均至少进行了三次(B类，D类、和F类)表示为平均值±SD。**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.
缩写：ChIP，染色质免疫沉淀。
SND1逆转miR-361-5p的肿瘤抑制作用
为了进一步证明SND1下调是否介导miR-361-5p的抑瘤作用，我们用pSG5或pSG5-SND1的miR-361-5p模拟物转染U87MG和U251细胞，并用Scr和pSG5转染相应的对照组。Western blot结果显示，与Scr+pSG5共转染组相比，miR-361-5p+pSG5联合转染组的SND1和MMP-2蛋白显著降低，并且它们在miR-361-5p+p SG5-SND1联合转染的组中的表达进一步升高，但仍低于Scr+p SG5共转染组(P（P）< 0.05–0.001;). 跨井腔迁移和侵袭实验结果表明，miR-361-5p+pSG5组对抑制肿瘤迁移和侵袭具有积极作用。然而，随着相应的SND1表达恢复到接近对照水平，miR-361-5p对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响在miR-361-5p+pSG5-SND1组中部分减弱(P（P）< 0.05–0.001;). 这些结果表明，miR-361-5p通过沉默SND1至少部分抑制了U87MG和U251细胞的迁移和侵袭。
外源性SND1破坏了miR-361-5p的迁移和侵袭抑制作用。(A类——C类)Western blot分析SND1和MMP-2蛋白在细胞中的表达。SND1和MMP-2的相对表达水平根据β-肌动蛋白进行标准化。(D类——G公司)外源性SND1部分恢复了miR-361-5p+pSG5-SND1组迁移和侵袭的细胞数量。所有实验均至少进行了三次(B类，C类，E类、和G公司)表示为平均值±SD。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.
讨论
先前的报道表明，miR-361-5p可能在不同的肿瘤中起到抑癌或启动子的作用。6——10此外，miR-361-5p下调有助于神经胶质瘤细胞的EMT。11然而，miR-361-5p与胶质瘤迁移和侵袭的相关性尚不清楚。在本研究中，我们确定miR-361-5p是一种抑制星形胶质细胞瘤细胞迁移和侵袭的肿瘤抑制因子。从机制上讲，我们证实SND1是miR-361-5p的直接功能靶点，这有助于我们了解胶质瘤恶性进展的机制。最重要的是，我们发现miR-361-5p和SND1不仅相互关联，而且与胶质瘤分级相关，ROC曲线分析结果强调了miR-361-5p和SND1作为人类胶质瘤新的诊断生物标记物的潜在作用。
在我们当前的研究中，我们观察到miR-361-5p在胶质瘤组织中的表达水平显著低于对照组织，但SND1蛋白的表达水平呈现相反的趋势。我们还通过双核糖核酸酶报告子分析鉴定了miR-361-5p是SND1的一种新的调节因子。此外，上调miR-361-5p水平可以抑制GBM细胞系的迁移和侵袭。本研究首次确定miR-361-5p是一种通过靶向SND1发挥作用的肿瘤抑制miRNA。我们的研究证实了miR-361-5p对SND1在介导胶质瘤迁移和侵袭中的新调节作用。一些研究表明miR-361-5p在不同类型的癌症中异常表达，但有必要进行更多的研究，以更详细地了解miRNA靶向的基因。我们已经知道miR-361-5p在前列腺癌、皮肤鳞癌和肺癌中下调，但在宫颈癌和膀胱癌中上调。6——10，26我们首次发现，miR-361-5p在胶质瘤中显著下调，通过转染模拟物使miR-361~5p过度表达显著下调GBM细胞系的迁移和侵袭。
生物信息学分析预测SND1是miR-361-5p的假定靶点，双核糖核酸酶分析验证了这一预测。我们还验证了用miR-361-5p模拟物转染GBM细胞株后，SND1 mRNA和蛋白的表达降低，这意味着miR-3615p通过降解其mRNA来阻断SND1的表达，前列腺癌、乳腺癌和胶质瘤。27——29SND1在生物事件中发挥的重要功能之一是转录激活。我们的研究表明，SND1可以促进MMP-2基因的转录，从而增强GBM细胞的侵袭和迁移。肿瘤细胞产生的MMP-2在细胞外基质降解和肿瘤细胞侵袭中起着重要作用。21在胶质瘤中，与非侵袭性低度星形细胞瘤和正常大脑相比，MMP-2在高级胶质瘤中的表达最高，这是胶质瘤侵袭的主要介质。22，23在我们目前的研究中，我们还观察到miR-361-5p转染后GBM细胞中SND1蛋白和MMP-2蛋白同步下降，随后它们的迁移和侵袭能力受到抑制；然而，这种现象被SND1转染部分破坏。因此，我们得出结论，miR-361-5p可以通过靶向SND1的mRNA 3′-UTR而导致SND1下调，从而由于转录活性降低而导致MMP-2下调。
总之，我们的发现首次揭示了miR-361-5p和SND1在胶质瘤中的调节之间的重要联系。我们已经证明miR-361-5p可以通过靶向SND1来抑制GBM细胞的迁移和侵袭。SND1下调可进一步降低MMP-2的转录活性。miR-361-5p-SND1-MMP-2轴可能为胶质瘤的迁移和侵袭机制提供了新的见解，恢复miR-361-5p表达可能为未来胶质瘤的治疗提供新的策略。
结论
本研究表明，miR-361-5p在胶质瘤组织中下调，并与SND1表达呈负相关。此外，miR-361-5p和SND1的表达与胶质瘤的程度呈等级依赖性。此外，通过靶向SND1，发现miR-361-5p的过度表达对人脑胶质瘤细胞株具有迁移/侵袭抑制作用。需要进一步研究以探索miR-361-5p在动物模型中的潜在作用。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号81402050、81502166、81672592、31370749和31670759）、中国博士后科学基金（编号2017M622881）、教育部创新团队发展计划（IRT13085）、，天津市科学技术计划项目（编号：15JCYBJC49900、15JCZDJC34600、16JCQNJC13400、17JCYBJ27100）、深圳市科技创新委员会（编号：JCYJ201703070714854）、天津市卫生局项目（编号15KJ147）、，天津医科大学和总医院基金会（No.2015KYZQ11，ZYYFY2014038，ZYYFY2015032）。
工具书类
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