Oncotarget公司。2018年5月18日；9(38): 24950–24969.
由microRNA-146a调节的小胶质细胞SMAD4促进小胶质细胞迁移，支持胶质瘤环境中的肿瘤进展
,1 ,1 ,4,5,6 ,2 ,1 ,三 ,三 ,2,5,7,8 ,1和1
阿帕娜·卡提基扬
1新加坡国立大学林永禄医学院解剖系
卡罗尔·唐
4新加坡国家神经科学研究所研究部
5新加坡Duke-NUS医学院
6新加坡国家癌症中心细胞和分子研究部
Karthik Mallilankaraman公司
2新加坡国立大学林永禄医学院生理学系
Maskomani Silambarasan公司
1新加坡国立大学林永禄医学院解剖系
Beng Ti Ang公司
2新加坡国立大学林永禄医学院生理学系
5新加坡杜克大学新加坡国立大学医学院
7新加坡国家神经科学研究所神经外科
8新加坡临床科学研究所，A*STAR，新加坡
Eng-Ang Ling公司
1新加坡国立大学林永禄医学院解剖系
S.Thameem Dheen公司
1新加坡国立大学林永禄医学院解剖系
1新加坡国立大学林永禄医学院解剖系
2新加坡国立大学林永禄医学院生理学系
三新加坡南洋理工大学生物科学学院
4新加坡国家神经科学研究所研究部
5新加坡Duke-NUS医学院
6新加坡国家癌症中心细胞和分子研究部
7新加坡国家神经科学研究所神经外科
8新加坡临床科学研究所，A*STAR，新加坡
2017年10月5日收到；2018年3月19日验收。
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摘要
胶质瘤肿瘤是小胶质细胞的重要组成部分，已知小胶质细胞支持肿瘤进展。本研究表明，胶质瘤环境中小胶质细胞中的转化生长因子-β（TGFβ）信号通路参与肿瘤的进展和发病机制。研究表明，高级别胶质瘤中TGFβ水平升高，其信号通路通过磷酸化SMAD2和SMAD3调节肿瘤进展，与SMAD4形成复合物调节靶基因转录。在一个在体外在胶质瘤条件培养基（GCM）中培养的小鼠BV2小胶质细胞中，基于细胞系模型的pSMAD2/3、总SMAD2/3和SMAD4蛋白水平升高，表明小胶质细胞TGFβ信号通路激活与胶质瘤环境相关。免疫荧光标记进一步显示SMAD4在人脑胶质母细胞瘤组织的小胶质细胞和非小胶质细胞中的表达体内通过shRNA介导的小胶质细胞SMAD4的稳定敲除进行功能分析，发现基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达下调，MMP9与肿瘤进展和细胞迁移有关。此外，小胶质细胞中SMAD4的敲除减少了小胶质细胞向GCM的迁移，表明SMAD4促进了胶质瘤环境中小胶质细胞的迁移。此外，SMAD4已被证明受microRNA-146a的转录后调控，而在GCM处理的小胶质细胞中，microRNA146a被下调。miR-146a的过度表达导致SMAD4和肿瘤支持基因MMP9在小胶质细胞中的表达降低，随后可能通过调节SMAD4抑制小胶质细胞向GCM的迁移。另一方面，细胞活力测定显示，与用来自对照小胶质细胞的培养基处理的神经胶质瘤细胞相比，当用来源于SMAD4敲低的小胶质细胞或miR-146a过表达的小胶质细胞的条件培养基处理神经胶质瘤细胞时，神经胶质瘤细胞的活力降低。综上所述，本研究表明，受miR-146a表观遗传调控的小胶质细胞SMAD4促进胶质瘤中小胶质细胞的迁移和胶质瘤细胞的存活。
关键词：小胶质细胞、胶质瘤、TGFβ、SMAD4、microRNA-146a
简介
胶质瘤是一种具有广泛临床特征的恶性脑肿瘤。胶质瘤起源于大脑的神经胶质细胞，经过良性阶段（世界卫生组织I级）到高度恶性阶段（世界卫生组织II至IV级）。高级别胶质瘤本质上是异质性的，由肿瘤细胞、胶质样干细胞、广泛的血管系统和免疫细胞组成[1–三]. 小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，在肿瘤的浸润免疫细胞群中占很大比例，在一些高级别肿瘤中占肿瘤质量的三分之一[4,5]. 作为中枢神经系统（CNS）任何损伤、侮辱或感染的第一反应者，小胶质细胞被激活，分泌多种促炎细胞因子，并表现出吞噬活性以清除组织碎片[6]. 随后，小胶质细胞促进中枢神经系统受累区域的修复和再生通过生长因子和抗炎细胞因子的释放[7,8]. 活化的小胶质细胞在神经病理学中具有神经毒性和神经保护作用，根据其功能，小胶质细胞被分为经典（促炎）表型和替代（抗炎）表型[9,10]. 胶质瘤中的小胶质细胞功能是另一种激活形式，其中小胶质细胞分泌细胞因子和趋化因子，这些细胞因子和因子是胶质瘤生成的，并支持肿瘤的生长[11,12]. 然而，最近的研究表明，肿瘤相关小胶质细胞表达的基因与两种激活状态不同[13,14]从而强调了肿瘤相关小胶质细胞的复杂性及其在神经胶质瘤微环境中的作用。胶质瘤中小胶质细胞的这种致瘤性可能归因于微环境中癌细胞释放的信号分子改变的分子和表观遗传途径。
肿瘤内的肿瘤细胞分泌大量可溶性细胞因子、趋化因子和生长因子，影响小胶质细胞的运动、增殖和吞噬作用[15,16]. 胶质瘤微环境中高度富集的一个关键信号分子是转化生长因子β（TGFβ），它激活由SMAD2和3介导的TGFβ途径，SMAD2是TGFβ受体家族的底物。当TGFβ配体与其受体结合时，SMAD2/3复合物被磷酸化，并与共同介质SMAD4偶联，转运到细胞核，在那里复合物调节TGFβ应答基因的转录[17]. TGFβ是已知的细胞周期进展抑制剂[18]因此，在某些癌症的早期阶段起到抑癌作用。相反，TGFβ信号可以通过诱导基因促进胶质瘤进展的致瘤方面，如血管生成，从而促进肿瘤发生[19]，转移[20,21]和上皮-间充质转化[22]. 高活性TGFβ信号与胶质母细胞瘤的某些亚型肿瘤相关，如间充质亚型，并导致肿瘤的侵袭性和患者的不良预后[23–25]. 在TGFβ信号激活的肿瘤中，如肝细胞癌，升高的SMAD4已被证明可以介导肿瘤促进信号[26]而在其他癌症如胰腺癌中，SMAD4的缺失与肿瘤的进展和转移有关[27,28]. 使用TGFβ拮抗剂和编码反义TGFβ2的寡核苷酸的治疗方法已被证明成功逆转TGFβ辅助的胶质瘤免疫抑制[29,30]. 然而，由于TGFβ参与多种细胞信号通路，因此系统性抑制TGFβ通路可能导致不利影响。这使我们研究了TGFβ信号通路被破坏以减弱小胶质细胞支持肿瘤表型的其他特异性机制。此外，对SMAD4在胶质瘤小胶质细胞功能中的作用还知之甚少，因此，本研究旨在了解SMAD4对肿瘤相关小胶质细胞介导肿瘤进展的作用。
除了改变信号通路外，不同神经病学中激活的小胶质细胞还表现出不受调控的表观遗传机制，如染色质修饰、基因特异性组蛋白乙酰化和甲基化的变化以及差异化microRNA（miRNA）表达[31,32]. 特别是，miRNAs已成为转录后调节基因表达的一类核心表观遗传介质[33]. 活化的小胶质细胞中miRNAs的失调被证明有助于神经退行性疾病和脑损伤的发展和进展[33]. 对激活的原代小胶质细胞进行的全球miRNA微阵列分析确定了激活的小胶质细胞中差异表达的几个miRNA。与对照小胶质细胞相比，激活的小胶质细胞中的micro-RNA 146a（miR-146a）上调（未发表数据）。MiR-146a，富含活化的巨噬细胞和小胶质细胞[34]已证明，其靶向并抑制活化小胶质细胞和星形胶质细胞中活化B细胞（NFκB）信号通路的核因子-κ-轻链增强子介导物，从而起到小胶质细胞活化的负反馈调节器的作用[35,36]. 此外，据报道，miR-146a靶向胶质瘤细胞中的Notch1，并通过抑制癌细胞的迁移和增殖进一步抑制胶质瘤形成过程[37]. 此外，我们的生物信息学分析预测miR-146a靶向SMAD4。鉴于miR-146a在小胶质细胞活化和胶质瘤发生中的重要作用及其对SMAD4的假定作用，本研究试图了解miR-146 a及其假定靶点SMAD4在胶质瘤环境中小胶质细胞功能在肿瘤进展中的作用。
据推测，改变的分子和表观遗传机制调节胶质瘤相关小胶质细胞的肿瘤支持行为。在这项研究中，SMAD4是TGFβ信号通路的介体，在接触胶质瘤条件培养液的小胶质细胞中上调，并在与人类胶质母细胞瘤组织相关的小胶质瘤中强烈表达。小胶质细胞中SMAD4的稳定缺失降低了肿瘤启动子MMP9的表达水平，这导致小胶质细胞在transwell迁移分析中的迁移潜力降低。此外，预测靶向SMAD4的miR-146a在接受胶质瘤条件培养基治疗的小胶质细胞中下调，并调节小胶质细胞肿瘤支持基因MMP9的表达水平。总的来说，本研究表明miR-146a-SMAD4在调节胶质瘤小胶质细胞功能中的作用。
结果
胶质瘤条件培养基诱导小胶质细胞SMAD2和SMAD3磷酸化
为了了解胶质瘤微环境对小胶质细胞的影响，将BV2小胶质细胞培养在C6胶质瘤细胞衍生的胶质瘤条件培养基（GCM）中。GCM中TGFβ的浓度被评估为~5ng/ml，而在含有血清的培养基中未检测到TGFβ水平（图). 首先，在GCM处理的小胶质细胞中测定总的和磷酸化的SMAD2/3的表达，其介导TGFβ信号传导。Western blot分析显示，与对照小胶质细胞相比，GCM处理的小胶质细胞中SMAD2和SMAD3的磷酸化水平增加（图). 在SMAD2和SMAD3磷酸化后，该复合物已被证明与SMAD4结合并易位到细胞核[38]. 共焦成像显示，pSMAD2/3与SMAD4在GCM处理的小胶质细胞细胞核中共同定位（图). 此外，免疫细胞化学显示，与对照细胞相比，GCM处理的小胶质细胞中SMAD4和总SMAD2/3的共同定位增加（图)表明GCM处理的小胶质细胞中TGFβ途径被激活。
GCM诱导小胶质细胞TGFβ信号通路ELISA检测定量显示GCM含有约5ng/ml的TGFβ（A）.西式印迹（B）与对照组相比，GCM处理的小胶质细胞中磷酸化形式的pSMAD2/3增加。直方图描述了根据总SMAD2/3表达标准化的pSMAD2/3的密度定量（C）数据代表平均值±SD，（n=4），学生t吨-测试，*第页<0.05,**第页<0.01. 共焦图像显示pSMAD2/3（绿色，D类)，总SMAD2/3表达（绿色，E类)和SMAD4在BV2小胶质细胞中的表达（红色、D、E）(用箭头表示). 细胞核用DAPI（蓝色）标记。与对照细胞（D）相比，GCM增加了pSMAD2/3的免疫荧光强度。pSMAD2/3、总SMAD2/3和SMAD4的免疫共定位显示，在GCM（D，E）治疗的小胶质细胞中，pSMAD3/3和总SMAD2/3与SMAD4共定位。比例尺=30μm。
GCM治疗的小胶质细胞SMAD4和肿瘤支持基因表达增加
由于SMAD2/3与SMAD4形成复合物以调节TGFβ反应基因，因此通过western blot和免疫细胞化学检测胶质瘤微环境对小胶质瘤中SMAD4表达的影响。与对照组相比，经GCM处理的小胶质细胞SMAD4蛋白表达上调明显（图). 同时，GCM处理的小胶质细胞显示TGFβ信号通路相关蛋白的上调，如基质金属蛋白酶9（MMP9）和血管内皮生长因子（VEGFa）（图)提示胶质瘤相关小胶质细胞表达上调的肿瘤支持因子。
SMAD4和肿瘤支持基因MMP9和VEGFa在胶质瘤相关小胶质细胞中上调Western blot分析显示GCM治疗后BV2小胶质细胞中SMAD4蛋白水平和肿瘤支持基因、VEGFa和MMP9增加（A）直方图描述了接触GCM的小胶质细胞中SMAD4、VEGFa和MMP9蛋白水平的密度定量（B）数据代表平均值±标准差（n=3-5），学生t吨-测试，*第页<0.05.
SMAD4在与人类胶质母细胞瘤样本相关的小胶质细胞中表达
根据上述结果，我们试图验证SMAD4在人类胶质母细胞瘤组织中的表达，以更好地了解其在胶质瘤发病机制中的作用。使用Oncomine软件对the Cancer Genome Atlas数据库中胶质母细胞瘤样本的表达谱数据进行分析后发现，胶质母细胞癌组织中SMAD4（Reporter ID:202527_s_at）mRNA的表达显著增加（3.271倍）（n=542）与数据库中可用的非恶性脑组织样本进行比较（图) [39].
SMAD4在与人类胶质母细胞瘤样本相关的小胶质细胞中表达TCGA分析数据显示，与正常非恶性组织相比，脑胶质母细胞瘤组织中SMAD4 mRNA水平显著增加（A）图中显示了SMAD4在人类胶质母细胞瘤肿瘤组织中的表达（GB 34）（B）注意，在Iba1阳性小胶质细胞（绿色）中有明显的SMAD4（红色）表达。细胞核用DAPI（蓝色）标记。刻度=30μm(低倍率)，刻度=10μm(高倍率). 表显示了每个肿瘤中Iba1阳性小胶质细胞的百分比（C）.
在本研究中，进行双重免疫荧光分析以确定SMAD4蛋白在胶质母细胞瘤组织中的表达（图). 共焦成像显示，SMAD4在Iba1阳性小胶质细胞以及不同组织样本中的非小胶质细胞中表达（图). Iba1-免疫活性细胞似乎是变形虫或圆形表型，表明该细胞类型处于激活状态。高倍图像显示在Iba1阳性小胶质细胞中SMAD4的核表达明显（图). 对Iba1阳性细胞体的定量分析显示，肿瘤样本中的小胶质细胞比例很高（图).
SMAD4调节肿瘤支持因子MMP9的表达
为了确定SMAD4在小胶质细胞中的作用，通过小病毒夹RNA（shRNA）转导，对小胶质细胞的SMAD4进行稳定的敲除Smad4公司基因。ShRNA-介导的Smad4公司该基因导致肿瘤细胞mRNA水平下降90%Smad4公司（图)SMAD4的蛋白质水平下降80%（图). 与作为阴性对照的空载体转导的细胞相比，SMAD4敲除后，小胶质细胞中MMP9在mRNA和蛋白质水平下调（图). 这表明SMAD4调节小胶质细胞中肿瘤支持因子MMP9的表达。
SMAD4调节肿瘤支持因子MMP9在小胶质细胞中的表达定量RT-PCR和western blot分析显示，与阴性对照组相比，shSMAD4 BV2细胞中SMAD4的mRNA和蛋白表达降低（A、C）数据代表平均值±标准偏差，（n=3），学生t吨-测试，***第页<0.001. 定量RT-PCR和蛋白质印迹分析表明，shRNA介导的SMAD4敲低导致MMP9的mRNA和蛋白表达减少（B、C）平均值±标准偏差，（n=4），学生t吨-测试，*第页<0.05.
ShRNA-介导的SMAD4沉默抑制小胶质细胞向胶质瘤条件培养基迁移
进行跨孔迁移分析，将小胶质细胞接种在跨孔插入物上腔的无血清培养基中，并允许其向含有GCM或化学吸引剂（如TGFβ和EGF）的下腔迁移，以评估小胶质细胞向GCM的迁移潜力（图). 向GCM迁移的小胶质细胞数量显著增加（图)与迁移到含血清培养基中的小胶质细胞数量相比（图). 此外，小胶质细胞向含有可溶性TGFβ和EGF的细胞室的迁移增加（图)与对照组相比。
shRNA介导的SMAD4基因敲除抑制小胶质细胞迁移跨膜图像显示迁移的小胶质细胞数量增加(紫色)接触GCM后（B），转化生长因子β（C）和EGF（D）与暴露于含血清培养基的细胞相比（A）直方图显示了与对照组相比，暴露于GCM、TGFβ和EGF的迁移细胞的折叠变化（E）数据表示平均值±SD，*第页<0.05,**第页<0.01（n=3）。迁移的shSMAD4小胶质细胞数量减少(紫色)对GCM和含血清培养基的反应（I、G）与接触GCM和含血清培养基的阴性对照（Neg-Cont）小胶质细胞相比（H、F）直方图描述了迁移细胞的折叠变化（J）数据表示平均值±SD，（n=3），*第页<0.05,**第页<0.01.
此外，还研究了SMAD4在小胶质细胞向GCM迁移中的作用。与转染空载体的对照细胞相比，移向下腔含血清培养基的shSMAD4细胞数量显著减少（图). 这表明SMAD4在小胶质细胞的迁移潜能中起着重要作用。另一方面，与对照组和shSMAD4小胶质细胞相比，接触GCM后，迁移的对照组和小胶质细胞的数量分别增加。然而，接触GCM的shSMAD4小胶质细胞的迁移增加明显少于接触GCM对照小胶质细胞（图). 此外，GCM诱导的对照和shSMAD4小胶质细胞的迁移指数似乎具有可比性（图)，表明GCM中存在的涉及TGFβ通路的因素可能在小胶质细胞的迁移中发挥作用。
shSMAD4细胞的小胶质细胞条件培养液抑制胶质瘤活性
研究表明，小胶质细胞通过分泌有助于肿瘤生长的因子来促进胶质瘤的进展。在本研究中，使用MTS试验和阿拉玛蓝试验评估胶质瘤细胞对小胶质细胞条件培养液的反应能力。结果表明，细胞活力显著增加（图)胶质瘤细胞经24、48和72h的培养基处理后，证实小胶质细胞分泌促进胶质瘤细胞生长的因子。为了确定小胶质细胞中SMAD4的敲除对胶质瘤细胞活性的影响，用shSMAD4小胶质细胞衍生的条件培养基处理胶质瘤细胞。结果表明，当用SMAD4敲除的小胶质细胞培养基处理胶质瘤细胞时，胶质瘤细胞的活性降低（图)这表明小胶质细胞中SMAD4的抑制降低了胶质瘤细胞的生存能力。阿拉玛蓝试验进一步证实了这一点，在该试验中观察到阿拉玛蓝的还原性显著降低在体外用来源于shSMAD4小胶质细胞的培养基处理胶质瘤细胞后，与相应的对照组进行比较（图).
shSMAD4敲除小胶质细胞条件培养基对胶质瘤细胞活性的影响直方图描述了使用小胶质细胞衍生的条件培养基治疗胶质瘤细胞后24、48和72小时的MTS分析吸光度值。用小胶质细胞条件培养液治疗后，在所有时间点均观察到胶质瘤存活率显著增加（A）通过阿拉玛蓝活性测定进一步证实了这一点，在用小胶质细胞条件培养液处理的胶质瘤细胞中，阿拉玛蓝的还原率在所有时间点都增加了%（B）直方图进一步显示了用来自shSMAD4小胶质细胞的条件培养基处理胶质瘤细胞24、48和72小时时的MTS测定吸光度值（C）吸光度值的降低表明，与阴性对照培养基（C）处理的胶质瘤细胞相比，用shSMAD4细胞的条件培养基处理后，胶质瘤细胞的活性降低。此外，阿拉玛蓝检测结果（D）与阴性对照培养基处理的胶质瘤细胞相比，用shSMAD4小胶质细胞培养基处理胶质瘤细胞的阿拉玛蓝减少百分比降低。数据表示平均值±SD，（n=4），***第页<0.001,****第页<0.0001.
MiR-146a调节GCM处理的小胶质细胞SMAD4的表达
为了阐明调节胶质瘤相关小胶质细胞SMAD4表达的表观遗传机制，我们检测了胶质瘤相关的小胶质细胞的3'UTRSmad4公司mRNA序列确定miRNA结合位点。TargetScan算法软件(http://www.targetscan.org/mmu_71/)揭示了miR-146a在3'UTR中的假定互补结合位点Smad4公司（图). miR-146a在小胶质细胞活化中的作用[36,40,41]，确定其在小胶质细胞支持肿瘤表型中的作用。定量RT-PCR分析显示，与对照细胞相比，脑胶质瘤相关小胶质细胞中miR-146a-5p的表达水平显著降低（图). 这与SMAD4的mRNA和蛋白质水平增加同时发生（图,)表明小胶质细胞中miR-146a和SMAD4之间存在反向关系。
在GCM治疗的小胶质细胞中MiR-146a下调，靶向SMAD4TargetScan软件预测miR-146a可能与SMAD4 mRNA的3'UTR结合（A）直方图显示，在GCM治疗的小胶质细胞中，miR-146a水平显著降低，SMAD4 mRNA水平显著增加，表明SMAD4和miR-146 a之间呈负相关（B）直方图显示，与干扰对照miRNA和荧光素酶载体共同转染的细胞相比，miR-146a模拟物和荧光素酶载体共同转基因的细胞中荧光素素酶活性显著降低，表明miR-146 a靶向SMAD4（C）数据代表平均值±SD，（n=3），学生t吨-测试，*第页<0.05. 使用qRT-PCR验证MiRNA模拟物和抑制剂转染效率。直方图显示模拟转染后小胶质细胞中miR-146a水平增加约400倍，抑制剂转染后miR-146a水平降低约50%（D）数据代表平均值±SD，（n=3），学生t吨-测试，*第页<0.05. 直方图显示，当miR-146a过度表达时，SMAD4的mRNA水平降低，反之，当miR 146a被抑制时，SMAD的mRNA增加（E）数据代表平均值±SD，（n=3），学生t吨-测试，*第页<0.05. 蛋白质印迹（F）和密度分析（G）证实与扰频探针转染细胞相比，miR-146a的过度表达抑制SMAD4蛋白水平，而miR-146 a的抑制增加了SMAD4蛋白质水平。数据代表平均值±SD，（n=3），学生t吨-测试，*第页<0.05,**第页<0.01. MiR-146a OE-MiR-146a过表达；MiR-146a KD-MiR-146a击倒。
此外，进行3'UTR荧光素酶分析以确认SMAD4是miR-146a的靶点。用含有小鼠3'UTR的荧光素酶载体转染BV2小胶质细胞Smad4公司基因和miR-146a过表达（模拟）或干扰探针。模拟物和荧光素酶载体联合转染后，观察到BV2小胶质细胞中荧光素素酶活性显著降低，表明miR-146a与3'UTR结合Smad4公司荧光素酶载体（图). 通过检测模拟物和抑制剂转染后小胶质细胞中miR-146a的水平来确定miRNA过度表达和抑制的转染效率。miR-146a模拟物的过度表达使小胶质细胞中的miR-146α水平增加了近400倍，而抑制miR-146b导致miR-146a水平降低约50%（图). 分析过表达和抑制miR-146a后SMAD4的mRNA表达。MiR-146a模拟转染导致SMAD4的mRNA和蛋白质表达水平降低，相反，抑制miRNA功能导致SMAD4mRNA和蛋白水平增加（图)表明miR-146a直接靶向小胶质细胞中的SMAD4。
为了了解miR-146a和SMAD4在GCM诱导的小胶质细胞中的功能关系，进行了功能丧失和获得实验。western blot检测发现，在GCM处理的小胶质细胞中，MiR-146a过表达在蛋白水平上显著降低SMAD4的表达（图). 相反，如western blot分析所示，抑制miR-146a导致GCM处理的小胶质细胞中SMAD4的蛋白水平略有增加（图). 免疫细胞化学分析还显示，与用打乱探针转染的小胶质细胞相比，用模拟物过度表达miR-146a会降低用或不用GCM处理的小胶质瘤中SMAD4的表达（图). 这表明miR-146a调节胶质瘤相关小胶质细胞中SMAD4的表达。
MiR-146a在GCM治疗的小胶质细胞中调节SMAD4Western blot分析表明，miR-146a模拟物转染小胶质细胞可抑制GCM诱导的SMAD4蛋白诱导（A、C）数据表示平均值±SD，（n=3），*第页<0.05. western blot分析和密度测定定量显示，在GCM处理小胶质细胞后，MiR-146a抑制增加SMAD4的蛋白水平（B、D）数据表示平均值±SD，（n=5），*第页<0.05. 免疫荧光标记显示，与用打乱miRNA（Neg-Cont）探针转染的细胞相比，在GCM处理或不处理的情况下，miR-146a过表达减弱了BV2小胶质细胞核中SMAD4的表达（红色）（E）DAPI细胞核染色，蓝色。比例尺=30μm。MiR-146a OE-MiR-146a过表达；MiR-146a KD-MiR-146a击倒。
MiR-146a调节小胶质细胞MMP9的表达并抑制小胶质细胞向GCM的迁移
GCM处理的小胶质细胞显示肿瘤启动子基因MMP9的诱导，同时SMAD4水平增加。为了确定miR-146a是否调节小胶质细胞中肿瘤支持基因的表达，分析了MMP9在miR-146 a过度表达和敲除后的表达。小胶质细胞中miR-146a的过度表达导致MMP9蛋白表达的显著抑制，而抑制miR-146 a则会增加MMP9的表达（图). 此外，在跨孔迁移分析中，小胶质细胞中miR-146a的过度表达导致小胶质细胞向GCM迁移的显著减少（图)表明miR-146a通过调节SMAD4及其下游基因MMP9抑制小胶质细胞迁移。
MiR-146a改变胶质瘤相关小胶质细胞中肿瘤支持基因MMP9的表达并抑制小胶质细胞向GCM的迁移免疫印迹和密度分析显示，miR-146a的过度表达抑制了MMP9在蛋白水平的表达，相反，抑制小胶质细胞中的miR-146 a可以增加MMP9的水平（A、B）数据代表平均值±SD，（n=3），学生t吨-测试，*第页<0.05. 图像面板显示迁移的小胶质细胞数量减少(紫色)与Neg-Cont细胞相比，GCM对miR-146a过度表达后（C-F）直方图描述了迁移细胞的折叠变化（G）数据表示平均值±SD，（n=3），**第页<0.01. MiR-146a OE-MiR-146a过表达；MiR-146a KD-MiR-146a击倒。
小胶质细胞中miR-146a过度表达抑制胶质瘤生存和生长
为了确定小胶质细胞中miR-146a过度表达对胶质瘤细胞活性的影响，用来自miR-146 a过度表达的小胶质细胞的条件培养液处理胶质瘤细胞。MTS结果表明，与混乱对照转染的细胞相比，用miR-146a过表达的小胶质细胞衍生培养基处理后，神经胶质瘤细胞在不同时间点的生存能力降低（图). 阿拉玛蓝试验进一步证实了这一点，在该试验中观察到阿拉玛蓝减少显著减少在体外用miR-146a过度表达的小胶质细胞培养基处理胶质瘤细胞后（图)表明小胶质细胞中miR-146a的过度表达降低了胶质瘤细胞的生存能力。
小胶质细胞miR-146a过表达条件培养基对胶质瘤细胞活性的影响直方图描述了使用来自小胶质细胞中miR-146a过度表达的条件培养基处理胶质瘤细胞24、48和72小时后的MTS分析吸光度值。所有时间点的吸光度值降低表明，与阴性对照（干扰miRNA）转染培养基处理的胶质瘤细胞相比，使用miR-146a过表达细胞培养基处理后，胶质瘤细胞的活性受到抑制（A）此外，与用干扰对照转染培养基处理的胶质瘤细胞相比，用miR-146a过度表达的小胶质细胞培养基处理胶质瘤细胞后，阿拉玛蓝减少的百分比降低，表明胶质瘤细胞活性受到抑制（B）数据表示平均值±SD，（n=4），**第页<0.01,****第页<0.0001.
讨论
大量文献表明，小胶质细胞在中枢神经系统病理过程中发挥着不同的作用，无论是有害的还是有益的[6]. 在正常健康的大脑中，小胶质细胞监测大脑微环境中的病原体和损伤，并参与诸如神经元突触形成、维持和修剪等功能[42–44]. 激活后，具有突起的小胶质细胞迅速转化为变形体表型，并参与吞噬脑实质中的碎片[45]. 在本研究中，胶质瘤内的小胶质细胞主要表现出变形虫样表型，这表明它们被激活，可能是对胶质瘤分泌组的反应，该分泌组由肿瘤和非肿瘤细胞（如血管内皮细胞）释放的信号分子组成，肿瘤的星形胶质细胞和肿瘤干细胞位于小胶质细胞的空间附近。最近的实验证据证实了这一点，实验表明小胶质细胞暴露于胶质瘤条件培养液中在体外在小鼠模型中与胶质瘤相关的小胶质细胞体内表现出以激活状态为特征的变形虫表型[46–48]. 此外，本研究中分析的胶质瘤显示Iba1阳性小胶质细胞的比例很高，某些胶质母细胞瘤肿瘤中的小胶质细胞约占肿瘤体积的25%-50%。肿瘤中小胶质细胞的高频率可能是由于脑实质中的小胶质细胞对胶质瘤细胞释放的因子的反应而迁移，如在体外迁移分析。一些研究表明，EGF等可溶性因子[49,50]和转化生长因子β[51]如本研究所观察到的，它是肿瘤中强有力的趋化因子，可能促进小胶质细胞向肿瘤迁移。
除了作为化学引诱剂的作用外，TGFβ配体激活小胶质细胞中的抗炎信号通路，对众所周知对脑组织具有神经毒性的促炎信号发挥相反的作用[52,53]. TGFβ已被证明以自分泌方式作用于小胶质细胞并维持小胶质细胞静止[54]. 也有研究表明，小胶质细胞衍生的TGFβ增强了胶质瘤细胞的侵袭性和致瘤性，siRNA介导的胶质瘤细胞中TGFβ受体II的敲除破坏了TGFβ的促瘤作用[30]. 本研究表明，GCM治疗后，小胶质细胞中总蛋白和pSMAD2/3水平升高，pSMAD2/3介导TGFβ信号通路在体外SMAD2/3在小胶质细胞中的作用已被广泛研究[55,56]SMAD4在小胶质细胞激活中的作用，特别是在TGFβ信号传导的背景下，尚不清楚。有证据表明SMAD4在LPS激活的小胶质细胞中上调，并作为NFκB的负反馈抑制剂发挥作用，NF-κB是激活小胶质细胞的一种促炎信号反应[57]. 在本研究中，胶质瘤相关小胶质细胞在人类胶质母细胞瘤肿瘤中表达SMAD4体内接触GCM的小胶质细胞SMAD4表达增加在体外癌症基因组图谱中的数据分析进一步支持了这一观点，该图谱显示，与正常大脑样本相比，胶质母细胞瘤肿瘤中的SMAD4水平上调。此外，小胶质细胞中shRNA介导的SMAD4沉默与MMP9（一种细胞外基质金属蛋白酶）表达减少和小胶质细胞迁移抑制有关。这已在肝细胞癌中得到证实，其中SMAD4的敲除降低了癌细胞的迁移能力和集落形成能力[26]. SMAD4还被证明通过调节细胞外基质模拟酶MMP9和MMP14来控制胚胎发育期间的内胚层细胞迁移[58]. 此外，胰腺肿瘤细胞和角质形成细胞中SMAD4的沉默已被证明可以消除TGFβ诱导的迁移[59]因此，强调了SMAD4在小胶质细胞迁移中的重要作用。
小胶质细胞在自然界中具有高度分泌性。在本研究中，发现条件培养基中的小胶质细胞衍生生长因子可促进胶质瘤细胞的存活在体外这是一个重要的发现，因为它可能导致一种新的治疗策略，该策略可能侧重于抑制小胶质细胞介导的肿瘤发生。此外，本研究表明，神经胶质瘤相关的小胶质细胞通过SMAD4的表达促进肿瘤发生，因为用来源于shSMAD4小胶质细胞的条件培养基处理的神经胶质瘤细胞显示出生存能力降低。胶质瘤细胞的活性降低也是可能的通过SMAD4诱导小胶质细胞NF-κB通路的负调控，因为最近的研究表明，SMAD4在小胶质细胞中的敲低诱导了炎症前细胞因子IL-6，其表达方式依赖于NFκB[57]. 总之，这些结果表明，胶质瘤相关小胶质细胞中SMAD4和NF-κB之间可能的相互作用可能决定肿瘤的进展。
研究了SMAD4的表观遗传调控，因为这些机制提供了额外的转录后控制层。在本研究中，发现小胶质细胞中的miR-146a以SMAD4为靶点。MiR-146a是一种富含免疫细胞的miRNA，已知在感染等病理条件下激活的小胶质细胞和巨噬细胞中上调[41]，缺血性中风[60]和阿尔茨海默病[40,61]. 几项研究表明，miR-146a通过调节促炎转录因子NFκB调节活化的小胶质细胞的先天免疫反应[41,62]. 最近，与miR-146a序列相似的miRNA-146b被证明可以抑制胶质瘤生长在体外通过调节其目标EGFR[63]. 本研究中观察到胶质瘤相关小胶质细胞中miR-146a的下调可能通过增加参与肿瘤进展的SMAD4及其下游基因的表达而有利于肿瘤的发生。这也表明，胶质瘤相关小胶质细胞没有表现出在其他神经病理学如阿尔茨海默病和中风中观察到的活化小胶质细胞表型。功能研究进一步证实miR-146a是小胶质细胞致瘤基因表达的负调控因子通过其靶点SMAD4，因为其在小胶质细胞中的过度表达导致MMP9的抑制，MMP9是一种致瘤因子，可促进小胶质细胞向GCM迁移并提高胶质瘤的生存能力在体外.
小胶质细胞作为脑的免疫细胞，在脑肿瘤中表现出复杂的表型，不排斥或吞噬肿瘤细胞。相反，它们在肿瘤核心内聚集并支持肿瘤的进展。因此，在不同的胶质母细胞瘤分子和遗传亚型的背景下研究小胶质细胞的功能势在必行。在这方面，这项研究显示SMAD4在胶质母细胞瘤肿瘤和胶质瘤相关小胶质细胞中的稳健表达。研究还表明，经miR-146a转录后调控的SMAD4能够调节小胶质细胞对胶质瘤条件培养液的迁移。本研究进一步证实miR-146a通过其靶点SMAD4抑制胶质瘤相关小胶质细胞中的致瘤基因MMP9和胶质瘤细胞活性（图). 进一步体内需要研究评估miR-146a和SMAD4对胶质瘤生长和进展的治疗效果。
受microRNA-146a调控的SMAD4促进胶质瘤环境中小胶质细胞迁移和肿瘤进展胶质瘤细胞分泌包括TGFβ在内的多种因子（A）激活与胶质瘤相关的小胶质细胞中的TGFβ途径。发现胶质瘤条件培养基可诱导SMAD2/3复合物磷酸化并增加SMAD4水平（B）小胶质细胞。同时，发现靶向SMAD4的miR-146a在胶质瘤相关小胶质细胞中下调（C）胶质瘤相关小胶质细胞中miR-146a的下调增加了肿瘤支持因子的水平（D）包括促进胶质瘤进展和小胶质细胞迁移的SMAD4和MMP9。
材料和方法
人体组织样本
分级脑瘤标本是在获得书面知情同意的情况下获得的，作为新加坡卫生中心机构审查委员会a和国家卫生集团领域特定审查委员会a批准的研究方案的一部分（表). 所有方案均由新加坡国立大学机构审查委员会批准。新加坡国立大学机构审查委员会（NUS-IRB参考代码：B-16-049E）审查并批准了胶质母细胞瘤人体组织的使用。
表1
肿瘤样本等级和类型
| 样品名称 | 肿瘤类型 | 肿瘤等级 |
|---|
| GB-21标准 | 胶质母细胞瘤 | 四级 |
| GB-22标准 | 胶质母细胞瘤 | 四级 |
| GBO-24标准 | 少突胶质成分胶质母细胞瘤 | 四级 |
| GB-25标准 | 胶质母细胞瘤 | 四级 |
| GBO-26标准 | 胶质母细胞瘤伴少突胶质瘤 | 四级 |
| GB-28标准 | 胶质母细胞瘤 | 四级 |
| GB-34标准 | 胶质母细胞瘤 | 四级 |
免疫荧光
将人肿瘤切片固定、冷冻、切片（7μm厚）并安装在载玻片上。组织切片在含有0.3%Triton-X（TX）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的3%牛血清白蛋白（BSA）溶液中封闭。针对全长人类SMAD4蛋白的一级抗体是新加坡南洋理工大学的卢磊博士赠送的礼物。在4°C的温度下，将切片与1%的BSA中的一级抗体孵育过夜，浓度如下：SMAD4-1:300，Iba1-1:50（Abcam，ab5076）。此外，用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:5000）对切片进行染色，并用荧光固定介质固定。使用共焦显微镜（Olympus，FV1000 Fluoview）拍摄荧光图像。在肿瘤切片的4个区域手动计数Iba1阳性细胞体，显示明确的DAPI染色细胞核，并绘制为DAPI细胞核总数的百分比。
细胞培养
在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM中培养BV2小鼠小胶质细胞和C6大鼠星形细胞瘤细胞。细胞保持在5%的CO中237°C培养箱，定期用胰蛋白酶-EDTA溶液传代，以使细胞健康生长。
胶质瘤条件培养基（GCM）的制备
模拟胶质瘤微环境在体外，用C6细胞系的条件培养液处理小胶质细胞BV2[64,65]. 简单地说，C6细胞以2×10的密度接种在10cm培养皿中6细胞。让细胞过夜沉淀，第二天将补充有10%FBS的DMEM添加到培养物中。48小时后收集培养上清液，并通过0.22μm过滤器过滤以去除细胞碎片。GCM储存在-80°C下，并将冻融循环降至最低。
小胶质细胞中SMAD4敲除稳定细胞的产生
慢病毒介导的BV2小胶质细胞SMAD4特异性shRNA转导可实现SMAD4的稳定敲除。利用4个针对SMAD4基因的shRNA个体克隆（Dharmacon，GE Healthcare）转导小胶质细胞（登录号：NM_008540）。在用浓度为2μg/ml的嘌呤霉素转导后48小时施加选择压力。将细胞在含有嘌呤霉素的培养基中维持6-10天并扩增[66]. western blotting分析证实了小胶质细胞的敲除效率，并选择诱导最大敲除的shSMAD4克隆shSMAD4_2进行进一步分析(补充图1).
RNA提取、cDNA转换和定量实时PCR（miRNA）
转染或处理后，按照制造商的说明，使用miRNeasy Mini Kit（Qiagen，目录号：217004）从BV2细胞中分离RNA。使用通用cDNA合成试剂盒II（Exiqon，分类号：203301），使用RNA分离物（10ng）将miRNA转化为cDNA。使用ExiLENT SYBR对对照组和GCM治疗组的miRNA表达进行量化®绿色主混合料（Exiqon，分类号：203421）。miRNA实时PCR使用LNA修饰的miR-146a-5p引物（Exiqon，分类号：204688）和小核U6 RNA引物（Exciqon（分类号：203907）。
cDNA转换和定量实时PCR（mRNA）
使用由M-MLV逆转录酶（Promega，Cat No:M170A）、M-MLV逆转录酶5X反应缓冲液（Promega，Cat No:M531A）、dNTP（Promega，Cat No:U1511）和RNasin组成的主混合物将总RNA（2000ng）转化为cDNA用于基因表达分析®核糖核酸酶抑制剂（Promega，分类号：N2111），反应体积为25μl。基因表达的qRT-PCR使用Fast SYBR Green Master Mix（ThermoFisher Scientific，目录号：4385614）进行，cDNA在无核酸水中以1:10的比例稀释。PCR反应的引物序列如表所示。对照组和实验组之间的折叠变化按2计算-ΔΔCt方法[67]. 所有PCR反应均在实时Applied Biosystems PCR系统（Life Technologies，型号：7900HT）中进行。
表2
引物序列
| 基因 | 正向底漆 | 反向底漆 |
|---|
| 座椅模块组件4 | TCCAACCCGCCAAGTAAT公司 | GCTGGCTGAGCAGTAATCC公司 |
| 基质金属蛋白酶9 | GCGTGTCTGGAGATTCGACTT公司 | TATCACGCGCT公司 |
| β-肌动蛋白 | GGATTCCATACCAAGAAGA公司 | GGATTCCATACCAAGAAGA公司 |
迁移分析
采用Transwell迁移实验评估小胶质细胞向GCM、TGFβ和EGF的迁移潜力。40000个小胶质细胞接种在Transwell迁移插入物（Corning，分类号：3422）的上腔中，并放置在含有胶质瘤条件培养基和含有TGFβ（PeproTech，分类号100-21C）和人重组EGF（Life Technologies，PHG0311）的培养基的下腔中。细胞迁移15小时。将插入物固定在100%甲醇中10分钟，并使用0.5%甲酚紫溶液进行染色以进行可视化。用棉签去除插入物上膜上的细胞。对来自3个生物复制品的5个随机场进行量化，并将结果绘制为治疗组和对照组之间的倍数变化。
miRNA模拟物和抑制剂的转染
BV2细胞以2×10的密度接种5在6孔板中，使用miRNA模拟物（Ambion，分类号：4464066）和miRNA抑制剂（Exiqon，分类编号：4100679-001）进行miR-146a-5p的获得和丧失功能研究。BV2细胞也转染了打乱的模拟物（Ambion，分类号：4464058）或抑制剂（Exiqon，分类编号：199006-001）作为阴性对照。使用X-tremeGENE siRNA转染试剂（Roche，分类号：04476093001）在Opti-MEM培养基中分别以20和40nM的浓度制备用于转染的模拟物和抑制剂复合物。分别在转染后48小时和72小时进行RNA和蛋白质分析。
蛋白质印迹
使用M-PER鸡尾酒从BV2小胶质细胞中提取蛋白质™哺乳动物蛋白质提取试剂（ThermoFisher Scientific，分类号：78501），暂停™蛋白酶抑制剂（ThermoFisher Scientific，产品目录号：78430）和磷酸酶抑制剂（Thermal Fisher科学，产品目录编号：78427）。蛋白质定量采用Bradford分析法，使用生物试剂盒（生物试剂盒，分类号：5000001）。总蛋白裂解物（30μg）在95°C下变性10分钟。将蛋白质加载到10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳装置上，并转移到膜上（Bio-Rad，分类号：162-0177）。使用5%牛奶或牛血清白蛋白（BSA）阻断膜上的非特异性位点。膜在4°C下与一级抗体孵育过夜，抗体如下：SMAD4-1:1000（细胞信号技术，分类号：9515）、VEGFa-1:500（SantaCruz，分类号为sc-152）和MMP9-1:2000（EMD Millipore，分类号AB19016）随后与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体（ThermoFisher Scientific，分类号：31430，分类号：31460）孵育1h。使用Pico化学发光底物（ThermoFisher Scientific，分类号：37070）制备印迹，并用密度计定量蛋白质表达水平（Bio-Read Quantity One®1-D分析软件，分类号：1709600）。
荧光素酶检测
进行荧光素酶分析以验证miR-146a是否靶向SMAD4 mRNA。将BV2小胶质细胞以20000个细胞的密度放置在24孔板中。含有SMAD4 3`UTR的荧光素酶载体从GeneCopoeia（分类号：MmiT027594）商业购买。用模拟物和打乱探针（30nm）和荧光素酶载体（1000ng）共同转染细胞，24h收集含有分泌荧光素素酶的培养基。使用分泌对双发光检测试剂盒（GeneCopoeia分类号：SPDA-D010）测定分泌型高斯（Gaussia）荧光素酶（GLuc）。第二位报告人，分泌型碱性磷酸酶（SEAP），作为内部控制。测定GLuc/SEAP比值以测量转染样品的发光输出。
免疫细胞化学
BV2小胶质细胞生长在聚赖氨酸涂层盖玻片上。转染和/或处理后，细胞在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟。使用含有0.1%Triton-X的PBS实现细胞膜的渗透。然后，使用5%的正常山羊血清封闭载玻片，并在4°C下与以下抗体孵育过夜-SMAD4-1:100（Santa Cruz，sc-7966），pSMAD2/3-1:200（细胞信号技术，分类号：8828）和SMAD2/3-1:200（细胞信号技术，分类号：8685）。随后，用荧光标记的二级抗体培养细胞：抗兔Cy3（Sigma，分类号：c2306）、抗鼠Cy3。用DAPI对细胞核进行复染以进行可视化。使用共焦显微镜（Olympus，FV1000 Fluoview）拍摄荧光图像。
基于ELISA的GCM中TGFβ的定量
按照制造商的说明，使用Quantikine ELISA试剂盒（RND系统，MB100B）对C6胶质瘤条件培养液（GCM）中的TGFβ进行定量。简单地说，通过向100μl GCM中添加20μl 1M HCl，将潜在TGFβ1激活为其免疫反应形式，然后通过添加20μl 1.2N NaOH中和。使用试剂盒中提供的稀释液对TGFβ1标准品进行重新配制和连续稀释。将50μl GCM和TGFβ1标准样品添加到TGF-β1抗体预涂ELISA板中并孵育2h。随后，丢弃样品，并使用洗涤缓冲液彻底清洗微孔。接下来，向每个孔中添加100μl TGFβ1共轭物并孵育2h。清洗后，用底物溶液孵育平板，并使用试剂盒中提供的停止溶液停止反应。使用平板阅读器在450nm处测量光密度。
MTS和阿拉玛蓝细胞活性测定
为了评估小胶质细胞中SMAD4敲低对神经胶质瘤细胞活力的影响，进行了MTS和阿拉玛蓝测定。从对照小胶质细胞（小胶质细胞CM）和敲除SMAD4（shSMAD4-CM）或miR-146a过度表达（miR-146a OE-CM）后的小胶质细胞收集条件培养液。用空载体（阴性对照CM（稳定））转导的小胶质细胞条件培养基和打乱的探针（阴性对照CM（miRNA））作为对照。将约10000个C6胶质瘤细胞接种在96周板中，并用不同组的条件培养液处理。处理24、48和72小时后，将20μl MTS试剂（Promega，目录号G358C）添加到细胞中，并在37°C下孵育2小时。随后，在96孔板读取器中读取490nm处的吸光度。用条件培养基处理后，向细胞中添加10μl阿拉玛蓝试剂（ThermoFisher Scientific，分类号DAL1100），进行阿拉玛蓝检测。在570 nm处读取吸光度，并根据600 nm处的吸光度进行标准化。结果以阿拉玛蓝还原百分比绘制。
统计分析
使用GraphPad Prism和Microsoft Excel软件分析至少三个生物复制品的数据，并用平均值±S.D表示。在比较两个实验组时，学生的t吨-使用了测试。使用单向或双向方差分析测试对多个组进行分析，然后事后的，事后的Tukey和Sidak的测试。数据集在第页<0.05.
致谢
作者谨感谢Ashwini Karanth女士在该项目中提供的一些技术援助。
脚注
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
基金
作者想感谢NUS医学战略拨款（记忆网络计划WBS:R-185-000-271-646）和学术研究基金（AcRF）一级拨款（WBS编号：R-181-000-153-112）提供的资金。阿帕娜·卡提基安女士获得了新加坡国立大学研究奖学金的支持。C Tang和BT Ang由新加坡卫生部国家医学研究委员会根据其转化和临床研究旗舰计划（Tier 1）（项目编号：NMRC/TCR/016-NNI/2016）提供支持。
参考文献
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