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Oncotarget公司。2017年12月19日；8(67): 110785–110796.
2017年11月28日在线发布。 数字对象标识：10.18632/目标22720
预防性维修识别码：下午5762284
PMID：29340016

MiR-19通过β-catenin/Tcf-4信号通路调控RUNX3对胶质瘤的增殖和侵袭

孙季奎,1,* 贾志凡,2,* 李班（Banban Li）,三，* 张安玲（Anling Zhang）,2 王广秀,2 裴玉浦,2 陈志娟,2 王增光,2和杨卫东2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

积累的数据表明，微RNA靶基因的网络失调与胶质瘤有关。我们之前发现miR-19a/b在胶质瘤细胞系和不同肿瘤等级的标本中过度表达。然而，miR-19a/b在胶质瘤中的作用及其调控机制尚未见报道。在本研究中，基于我们之前的研究数据，我们首先确定了miR-19（miR-19a和miR-19b）与RUNX3之间的反向关系，RUNX3也通过实时PCR和IHC确定在肿瘤组织中的表达降低。荧光素酶报告分析和western blot分析表明RUNX3是miR-19的直接靶点。miR-19的下调显著抑制增殖、侵袭并诱导细胞周期G1阻滞和凋亡，至少部分是通过RUNX3的上调实现的。此外，机制研究表明，miR-19的敲低抑制了β-catenin/TCF4转录活性。总之，我们的研究证实了miR-19在胶质瘤中的致病作用，并建立了涉及miR-19/RUNX3/β-catenin的潜在调节和信号传导，也表明miR-19可能是胶质瘤的候选治疗靶点。

关键词：miR-19、RUNX3、β-catenin、TCF4、胶质瘤

简介

胶质母细胞瘤是最恶性、最难治愈的原发性脑肿瘤，尽管在外科技术、放射治疗和化学治疗方面取得了进展，但预后较差[1]. 胶质母细胞瘤还具有多种遗传改变的特征，如表皮生长因子受体（EGFR）扩增、PTEN突变以及各种信号通路，包括PI3K/AKT/mTOR通路、Wnt/β-catenin通路和P53信号通路[2,三]. 尽管有越来越多的证据表明胶质母细胞瘤的分子病理学，但这还不足以使个体化和靶向治疗取得重大进展。因此，有必要进一步了解参与发展和进展的分子机制，为具体的治疗策略提供见解。

微RNA是一种内源性表达的调节性非编码RNA，通过直接与靶mRNA的3′非翻译区（3′UTR）结合，在转录后负调控基因表达[4]. 积累的数据表明，microRNA活性的失调已被证明在肿瘤的发生和发展中起着关键作用，包括胶质瘤的发生[5,6]. 例如，miR-21是首次证实恶性胶质瘤中致癌microRNA，通过靶向P53、TGF-β和线粒体凋亡途径的抗肿瘤基因参与细胞增殖、凋亡和侵袭性[7,8]. 每一个microRNA都可能调节相当多的mRNA靶点，并作为致癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用[9]. 我们之前的研究表明，由miR-19a和miR-19b组成的miR-19在不同恶性程度的胶质瘤细胞系和组织样本中过度表达，这已通过实时PCR和原位杂交证实[10]. 然而，其生物学作用和胶质瘤发生的分子机制尚不清楚。

RUNX3基因位于1p36，这是一个在包括胶质母细胞瘤在内的多种人类癌症中经常发生基因组丢失的区域[11,12]. 据报道，RUNX3是原发性胶质母细胞瘤，其过表达导致细胞侵袭和迁移能力显著受到抑制[13]. 然而，没有报道表明胶质瘤中涉及miR-19/RUNX3的潜在调控和信号通路。

在本研究中，我们首先确定了miR-19和RUNX3之间的反相关性。此外，我们还通过实时PCR和IHC检测了切除组织标本中RUNX3的减少表达，这与之前的结果一致。此外，我们的数据表明，RUNX3是miR-19的直接靶点，抑制miR-19至少部分通过RUNX3抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和诱导凋亡，随后阻断Wnt/β-catenin信号通路。因此，我们探索了涉及miR-19/RUNX3/β-catenin的潜在途径，试图阐明胶质瘤的相关机制，也表明miR-19可能是一种值得进一步评估的GBM诊断治疗方法。

结果

miR-19和RUNX3的表达与肿瘤分级的关系

首先，我们根据WHO分类方案分析了不同肿瘤分级的miR19和RUNX3表达的关系。我们之前的研究表明，miR-19在恶性胶质瘤细胞系和组织标本中过度表达，结果发表在Pathol上。昂科尔。决议（2013年）。此外，我们的数据还表明，分别用qRT-PCR、western blot和免疫组织化学染色，RUNX3在胶质瘤细胞系和组织标本中经常下调（数据未显示）。根据最近的结果，miR-19和RUNX3的表达与肿瘤分级的关系如图所示​图1A第1页和​和1B，1B年表明miR-19与肿瘤分级呈正相关，而RUNX3在正常脑组织中高表达，与肿瘤分级呈负相关。除了组织微阵列外，为了验证RUNX3的表达，我们使用实时PCR和免疫组织化学染色来检测临床43个切除的神经胶质瘤组织样本。图​图1C1摄氏度和​和1D一维表明RUNX3在正常脑组织中较胶质瘤标本，尤其是高级别胶质瘤显著过度表达。

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基于组织芯片先前数据的miR-19与RUNX3表达的负相关

(一个)miR-19表达与WHO分级肿瘤分级的关系。(B类)RUNX3表达与WHO肿瘤分级的关系。(C类)实时PCR检测RUNX3在不同级别胶质瘤标本和正常脑组织中的表达。(D类)用免疫组织化学染色法检测切除的胶质瘤标本中RUNX3的表达（×200）。*<0.05。

RUNX3是miR-19的直接靶基因

为了探索miR-19和RUNX3之间的详细相关性，通过Targetscan、Pictar和miRanda搜索miRNA靶点预测数据库。发现RUNX3的3′UTR含有高度保守的miR-19a/b结合位点（图​（图2A）。2安培). 测试miR-19a/b是否调节RUNX3表达在体外，我们使用AS-miR-19a/b（miR-19a/b反义寡核苷酸）来降低胶质瘤LN229和U87细胞系中miR19a/b的表达水平。我们的结果表明，通过实时PCR，AS-miR-19a/b可以显著降低miR-19a/b的表达，这在与AS-miR-19a和AS-miR 19b共转染的细胞系中很明显（图​（图2B）。2B型). 转染AS-miR-19a/b后48小时，RUNX3蛋白表达水平下降（图​（图2C）。2摄氏度). 为了进一步验证RUNX3是miR-19a/b的直接靶基因，我们构建了含有RUNX33的3′UTR的pEZX-RUNX3-质粒，并进行了报告基因检测。如图所示​图2D，二维报告者分析显示，miR-19a/b的减少导致pEZX-WT-RUNX3与AS-miR-19a/b转染细胞联合使用时荧光素酶活性显著增加，而miR-C（miR-control）转染细胞的突变型pEZX-MUT-RUNX3中荧光素酶活性没有变化。这些证据表明，miR-19a/b通过与RUNX3的3′UTR结合直接调控RUNX3的表达。

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RUNX3是胶质瘤细胞miR-19a/b的直接靶点

(一个)含有RUNX 3′UTR的报告基因和miR-19a/b的种子序列的示意图与RUNX3的3′UTR相匹配。(B类)转染48小时后，AS-miR-19a/b通过实时PCR阻断miR-19a/b的表达。(C类)转染miR-C/miR-19a/b抑制剂48小时后RUNX3表达的Western blot。GAPDH蛋白作为内源性正常化因子。(D类)如图所示，与RUNX3和AS-miR-19a/b的宽型或突变型3′UTR共转染后，在LN229和U87细胞中检测荧光素酶报告子。数据表示三个重复的表达中的折叠变化（平均值±SE）。*第页与miR-C组相比<0.05。

miR-19下调抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭，并诱导部分依赖于RUNX3基因的凋亡在体外

我们的结果表明，AS-miR-19a/b可以显著上调RUNX3的表达。为了探索RUNX3在LN229和U87细胞系中通过AS-miR-19a/b对神经胶质瘤恶性表型的作用，我们使用小干扰RNA来敲低RUNX3水平。与未转染AS-miR-19的细胞相比，随着时间的推移，低miR-19a/b表达的胶质瘤细胞的细胞活力显著下降，MTT分析结果显示，转染AS-miR-19a/b的细胞中RUNX3的敲除部分消除了AS-miR-19a/b对细胞增殖的影响（图​（图3A）。3A级). 接下来，为了分析miR-19a/b抑制导致细胞生长停滞的机制，我们评估了转染miR-19a/b抑制剂或对照寡核苷酸的胶质瘤细胞的细胞周期分布，以及as-miR19a/b和RUNX3 siRNA的联合转染，而RUNX3 siRNA的转染也消除了AS-miR-19a/b对细胞周期停滞的影响（图​（图3B）。3B公司). 这些观察结果表明，miR-19a/b缺失抑制胶质瘤细胞的增殖，部分依赖于LN229和U87细胞系中的RUNX3。

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MiR-19a/b抑制可抑制增殖、侵袭、诱导细胞周期G0/G1阻滞和促进细胞凋亡，而这些作用可通过下调LN229和U87细胞系中靶基因RUNX3的表达而部分逆转

(一个)采用MTT法检测转染AS-miR19a/b和联合转染RUNX3 siRNA的细胞的存活率，与干扰组相比，联合转染的RUNX3-siRNA降低了RUNX3的表达。(B类)流式细胞术数据代表细胞周期分布。与干扰组相比，转染AS-miR19a/b 48 h后观察到G0/G1期阻滞，而RUNX3 siRNA的联合转染部分消除了miR-19a/b抑制G0/G2期阻滞的效果。(C类)通过Annexin V染色分析打乱和转染LN229和U87细胞的凋亡指数（AI）。(D类)通过transwell分析评估侵袭能力，显示RUNX3药物AS-miR19a/b抑制凋亡。数据表示为至少三个独立实验的三份样品的平均值±标准偏差。*第页<0.05。

我们分别采用跨孔分析和Annexin-V-PI染色的流式细胞术分析，对转染AS-miR-19a/b和联合转染RUNX3 siRNA的LN229和U87细胞进行侵袭能力检测和凋亡检测。在这两种细胞系中，与打乱相比，miR-19a/b抑制显著增加了平均凋亡细胞分数（早期凋亡+凋亡），而转染AS-miR-19a/b后肿瘤细胞的侵袭能力显著降低，通过联合转染RUNX3 siRNA，AS-miR-19a/b对侵袭和凋亡诱导的抑制作用被部分明显减弱，该siRNA下调了RUNX3的表达（图3C、3D).

RUNX3部分恢复了胶质瘤细胞miR-19a/b抑制的表型效应

为了进一步探讨RUNX3对miR-19a/b药物细胞生物学的抗肿瘤作用，我们检测了经RUNX3重组腺病毒（rAd-RUNX3）和miR-19a/b模拟物联合rAd-RUNX3处理的LN229和U87细胞的增殖、细胞周期分布、凋亡和侵袭性。实时PCR和western blot分析证实转染rAd-RUNX3后RUNX3过度表达（图4A、4B). 与之前的结果一致，增殖、细胞周期分布、跨阱和凋亡分析表明，RUNX3修复在LN229和U87细胞系中建立了与miR-19a/b抑制表型相似的显著抗肿瘤作用。然而，miR-19a/b模拟物和RUNX3在细胞中的联合转染部分逆转了RUNX3诱导的抗肿瘤作用（图4C至4F). 这些结果表明，RUNX3下调部分促进了miR-19a/b的致癌作用。

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RUNX3修复部分逆转miR-19a/b的致瘤作用

与对照组相比，转染RUNX3重组advirus的细胞增殖和侵袭减少，凋亡增加，细胞周期G0/G1停滞。(一个,B类)通过实时PCR和Western blot检测转染RUNX3重组腺病毒的U87和LN229细胞中RUNX3mRNA和蛋白的表达水平。(C类–F类)代表性图表显示了RUNX3上调和共转染联合miR-19a/b模拟物处理的LN229和U87细胞的MTT检查、细胞周期分布、凋亡和跨孔分析。数据表明RUNX3表达的恢复抵消了miR19a/b对LN229和U87细胞的影响。*第页<0.05。

MiR-19a/b消除抑制β-catenin/Tcf-4信号通路

我们的实验数据已经证实RUNX3可以抑制Wnt/β-catenin信号通路，这一点尚未发表。结合miR-19a/b对RUNX3的调控，我们提出miR-19b/b可以调控Wnt/β-catenin通路的假设。为了测试它，在miR-19a/b缺失或RUNX3表达恢复的细胞中使用Top/Fop闪光荧光素酶分析。在LN229和U87细胞中，AS-miR-19a/b或RUNX3降低了TOP，Fop闪光荧光素酶活性没有明显变化（图​（图5A）。5A级). 此外，western blot分析表明，miR-19a/b缺失或RUNX3过度表达降低了细胞核中β-catenin的表达（图​（图5B第5页).

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MiR-19a/b的消除抑制β-连环蛋白/Tcf-4的转录活性

(一个)用Top/Fop和miR-19a/b抑制剂或RUNX3联合转染LN229和U87细胞，然后进行荧光素酶报告分析。(B类)转染AS-miR19a/b和RUNX3后48小时，在两种细胞系中检测β-catenin的Western blot。(C类,D类)AS-miR19a/b转染LN229和U87细胞48 h后，实时PCR和western blot检测TCF4、C-MYC、CyclinD1、AKT1和VEGF。*第页与对照组相比<0.05。

实时PCR和western blot分析证实了β-catenin/Tcf-4通路作为miR-19a/b介导物的重要作用，表明在miR-19a/b表达低的细胞中TCF4、CyclinD1、C-MYC、AKT1和VEGF的相对表达降低（图5C、5D). 这些数据表明，miR-19a/b至少在LN229和U87细胞中通过RUNX3调节β-catenin/Tcf-4转录活性。

AS-miR-19a/b抑制肿瘤生长体内

AS-miR-19a/b抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和对RUNX3的靶向调节在体外，我们进一步研究了其对肿瘤生长的影响体内生物发光成像用于评估裸鼠颅内移植稳定表达荧光素酶和miR-19a/b抑制剂的U87细胞时的肿瘤形成。As-miR19a/b处理的U87细胞显示肿瘤明显减少（图6A、6B). 为了分析两组之间的生存时间，我们生成了Kaplan-Meier生存曲线，这表明AS-miR19a/b显著延长了生存期（图​（图6C）。6摄氏度). 此外，经IHC分析证实，AS-miR19a/b组的RUNX3表达增加，β-catenin和CyclinD1表达减少（图​（图6D）。第6天). 此外，经TUNEL评估证实，AS-miR19a/b组有更多凋亡细胞核（图​（图6E第六版).

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miR-19a/b表达下调抑制U87肿瘤生长体内

(一个)将含有荧光素酶报告子的慢病毒预处理的U87细胞或miR-19a/b抑制剂的共转染细胞植入裸鼠右前脑，并通过生物发光成像分析其致瘤性。在肿瘤植入后第4、10、23天检查通过生物发光信号评估的肿瘤形成。(B类)分析肿瘤生长曲线。数据描述为平均值±SD。*第页< 0.05. (C类)通过Kaplan-Meier分析确定总生存率，并使用log-rank检验评估差异的统计数据。(D类)实验结束时，采用免疫组化方法检测对照组和AS-miR-19a/b组肿瘤组织中RUNX3、β-catenin和CyclinD1的表达。(E类)颅内肿瘤切片的TUNEL分析表明，与对照组相比，凋亡细胞更多。*第页<0.05。

讨论

我们之前的研究已经证实miR-19a/b在不同级别的胶质瘤细胞系和组织标本中过度表达（Pathol.Oncol.Res.（2013）19:847-853）。同时，我们还证明RUNX3在GBM细胞系和胶质瘤组织中表达下调（数据未显示）。基于我们对组织芯片的数据研究，在本研究中，我们首先显示了miR-19a/b和RUNX3的表达分别与WHO分级之间的关系，表明miR-19a/b和RUNX3均呈负相关。此外，我们分析了43个经实时PCR和IHC验证的切除组织标本，这也表明RUNX3在组织标本中的表达减少，并与分级呈负相关。我们的数据表明，miR-19和RUNX3分别被认为是胶质瘤中的癌基因因子和肿瘤抑制因子，但它们的功能作用以及它们之间的潜在关系尚不清楚。

微RNA越来越多地被显示为调节转录后基因表达的癌基因或抗肿瘤基因[14,15]. 最近的研究表明，microRNA-19a通过抑制膜结合受体酪氨酸激酶（RTKs）的泛负调节因子LRIG1促进胶质瘤细胞生长[16]. 我们之前的数据也证实了PTEN是miR-19a/b的一个直接靶基因，这与乳腺癌和T细胞淋巴瘤的结果一致[10,17,18]. 使用四种算法（TargetScan、PicTar、miRanda、miRbase Target），我们容易预测miR-19a/b直接与RUNX3的3′UTR结合。此外，我们进行了3′UTR荧光素酶检测，并观察到miR-19a/b抑制剂和含有靶序列的3′UTR-载体联合转染后荧光素酶活性显著增加。转染miR-19a/b抑制剂的LN229和U87细胞中RUNX3蛋白水平也显著上调，这表明RUNX3是miR-19b/b的直接靶点。

RUNX3已被确定为多种实体瘤中的肿瘤抑制基因，包括胃癌、乳腺癌、肝细胞癌和口腔鳞癌[19–22]. 米勒等。据报道，胶质母细胞瘤中RUNX3通过高甲基化下调[12]. 有关于miRNA药物灭活RUNX3的相关报道，如胃癌中的miR-532-5p和胶质瘤中的miR4295[23,24]. 我们的数据表明，miR-19a/b药物调控RUNX3是其失活的另一个潜在机制。

在我们的研究中，我们首次全面分析了miR-19a/b抑制对胶质瘤恶性表型的作用。我们的结果表明，miR-19a/b的低表达抑制细胞增殖、侵袭并诱导细胞周期G0/G1阻滞。miR-19a/b抑制后，细胞凋亡也显著增加。此外，RUNX3的沉默实际上可以逆转miR-19a/b抑制剂的抑制作用。上调miR-19a/b也可以部分消除RUNX3的抑制作用。我们的体内致瘤实验研究表明，抑制miR19a/b对治疗有益。这些结果表明，抑制miR-19a/b可以抑制胶质瘤细胞的生长在体外和体内至少部分上调了RUNX3。

据报道，RUNX3与β-catenin/TCF4形成三元复合物，并在肠道肿瘤发生中减弱Wnt信号活性[25]. 通过TOP/FOP闪光荧光素酶分析，我们确定miR-19a/b的敲除或RUNX3的恢复均显著抑制β-catenin/TCF4转录活性。此外，β-catenin/TCF4通路的多个下游靶点，如cyclinD1、c-MYC、VEGF和AKT1，在miR-19a/b被击倒的细胞中均被减少。因此，这些数据支持miR-19a/b通过调节RUNX3对β-caterin/TCF4转录的抑制来调节胶质瘤细胞的存活。

总之，我们的研究为miR-19a/b在人脑胶质瘤中的作用提供了新的见解，并证实miR-19能够通过直接结合RUNX3的3′UTR区域来抑制RUNX3的表达水平，该区域用于抑制β-catenin/TCF4转录。基于多靶点和信号通路的调节，抑制miR-19a/b表达可能是胶质母细胞瘤的一个新的治疗靶点。

材料和方法

组织样本和临床数据

检测miR-19a/b表达的组织微阵列是由超颖生物技术公司（中国山西）制备的，具体信息在已发表的论文中进行了描述[10]. RUNX3表达的组织芯片包含59个不同等级的胶质瘤样本，包括9个一级样本、20个二级样本、17个三级样本和13个四级样本（表​（表1）。1). 在手术时征得患者同意后，收集了43份新切除的星形胶质瘤样本，并根据2007年世界卫生组织分类。样本包括12例WHO I-II级肿瘤、15例WHO III级肿瘤和16例WHO IV级肿瘤（表​（表2）。2). 新鲜切除的组织立即在液氮中冷冻，以便随后提取总RNA。在知情同意的情况下，从接受严重创伤性脑损伤（TBI）创伤后手术的患者处获得了五个正常成人脑组织标本。

表1

59例胶质瘤组织芯片病理学及临床分型
不。年龄性别病理学（WHO）不。年龄性别病理学（WHO）
0147M（M）星形细胞瘤I3159M（M）胶质母细胞瘤III
0235M（M）星形细胞瘤I3264F类胶质母细胞瘤III
0319F类星形细胞瘤I3341F类胶质母细胞瘤III
0421M（M）星形细胞瘤I3440F类胶质母细胞瘤III
0512M（M）星形细胞瘤I3549M（M）胶质母细胞瘤III
0641F类星形细胞瘤I3618F类胶质母细胞瘤III
0732F类星形细胞瘤I3735F类胶质母细胞瘤III
0842M（M）星形细胞瘤I3843M（M）胶质母细胞瘤III
0951F类星形细胞瘤II3933M（M）胶质母细胞瘤III
1052M（M）星形细胞瘤II4067M（M）胶质母细胞瘤III
1140F类星形细胞瘤II4142M（M）胶质母细胞瘤III
1250M（M）星形细胞瘤II4259M（M）胶质母细胞瘤III
1337M（M）星形细胞瘤II4333M（M）胶质母细胞瘤III
1451M（M）星形细胞瘤II4465F类GBM四
1542F类星形细胞瘤II4554M（M）胶质母细胞瘤III
1627F类星形细胞瘤II4663M（M）GBM静脉注射
1756M（M）星形细胞瘤II4739M（M）GBM四
1857F类星形细胞瘤II489M（M）GBM四
1953M（M）星形细胞瘤I4937M（M）GBM四
2050M（M）星形细胞瘤II5034M（M）GBM四
2171M（M）星形细胞瘤II5147F类胶质母细胞瘤III
2245F类星形细胞瘤II5233F类GBM四
2337F类星形细胞瘤II5361F类GBM四
2440F类星形细胞瘤II5476M（M）胶质母细胞瘤III
2566M（M）星形细胞瘤II5540F类GBM四
2646M（M）星形细胞瘤II5623M（M）GBM四
2749F类星形细胞瘤II5764M（M）GBM四
2849M（M）星形细胞瘤III5822M（M）GBM四
2910M（M）星形细胞瘤III5943M（M）GBM四
3032M（M）星形细胞瘤II

表2

43例胶质瘤标本的临床病理参数
不。年龄性别病原体（WHO）不。年龄性别病原体（WHO）
0136M（M）星形细胞瘤I2330M（M）星形细胞瘤III
0248F类星形细胞瘤I2447M（M）少突胶质瘤III
0335M（M）星形细胞瘤I2527M（M）星形细胞瘤III
048M（M）星形细胞瘤II269F类少突胶质瘤III
0517F类星形细胞瘤II2754M（M）星形细胞瘤III
06三M（M）星形细胞瘤II2831M（M）GBM四
0723M（M）星形细胞瘤II292F类星形细胞瘤IV
0833F类星形细胞瘤II306F类星形细胞瘤IV
0912M（M）少突胶质瘤II3124M（M）星形细胞瘤IV
107M（M）少突胶质瘤II3251M（M）GBM四
1110M（M）少突胶质瘤II3332F类GBM四
1242M（M）少突胶质瘤II3422F类GBM四
135M（M）星形细胞瘤III3525M（M）GBM四
1449F类星形细胞瘤III3620F类GBM四
154M（M）星形细胞瘤III3744F类GBM四
1650F类少突胶质瘤III3846F类GBM四
1713M（M）星形细胞瘤III3926M（M）GBM四
1853M（M）星形细胞瘤III4040F类GBM四
1941M（M）星形细胞瘤III4129M（M）GBM四
2018M（M）星形细胞瘤III4216M（M）GBM四
2138M（M）星形细胞瘤III4321M（M）GBM四
2214M（M）星形细胞瘤III

细胞培养和转染

人脑胶质瘤细胞（U87和LN229）取自中国上海中国科学院细胞库，在添加10%热灭活胎牛血清（FBS，Hyclone）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。将细胞保存在37°C、5%CO2的增湿大气中。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，USA）转染细胞。

寡核苷酸与腺病毒感染

Has-miR-19a/b抑制剂和模拟物通过高效液相色谱法进行化学合成和纯化（GenePharma，中国上海）。miR-19a抑制剂为5′-UCAGUUUUGCAUAGAUUUGCACA-3′。miR-19b抑制剂为5′-UCAGUUUUGCAUGGAUUUGCACA-3′。含有RUNX3 cDNA的腺病毒（rAd-RUNX3）来自Genesil（中国武汉）。我们使用RUNX3 siRNA（美国细胞信号技术）来敲低RUNX3的表达。

实时PCR

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从组织和细胞中分离出总RNA，用于mRNA分析。根据手册，使用TaqMan逆转录试剂和SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行qRT-PCR反应。对U6微小RNA水平进行标准化。使用TaqMan miRNA分析（Applied Biosystems）和GAPDH（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）作为RUNX3 mRNA内部对照，对miRNA进行qRT-PCR检测。

增殖试验

U87和LN229细胞分别以4000个细胞/孔的速度接种到96-well板中。如上所述转染后，在连续7天的每一天，向每个孔中加入20mL 3-4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基-2-氢四唑溴化盐（MTT）（5mg/mL），并将细胞在37μC下再孵育4小时，并丢弃上清液。所有增殖试验均作为独立实验重复至少两次。

细胞周期分析

U87和LN229电池（1×105细胞）置于60 mm培养板中。2天后，对细胞进行胰蛋白酶化，用75%乙醇固定，用PBS洗涤，然后在RNase A（Sigma-Aldrich）存在下用碘化丙啶（Sigma-Aldrich）标记30分钟。样品在FACScan流式细胞仪上运行（Becton-Dickinson，FL，NJ，USA），并使用Modifit软件分析细胞周期每个阶段内的细胞百分比。

体外入侵检测

使用涂有Matrigel（BD Biosciences，San Jose，CA）的Transwell膜分析GBM细胞的侵袭活性。(1 × 105)将100μl无血清DMEM加入培养箱上部，用U87和LN229制备的200μl条件培养基作为引诱剂，置于底部培养箱中。在37°C下培养24小时后，将培养基从上部培养箱中取出。用棉签刮去插入式过滤器上表面的非侵入细胞。迁移到插入式过滤器下表面的细胞用甲醇固定。使用三个随机选择的视野计算侵入基质凝胶的细胞数量。

荧光素酶报告试验

将含有推测miR-19a/b结合位点的人RUNX3 3′UTR片段克隆到双核糖核酸酶质粒载体（pEZX-MT01）中。转染后48小时，对细胞进行裂解，并使用双荧光素酶分析（GeneCopoeia，USA）测量萤火虫荧光素瘤酶活性与Renilla荧光素酶活性的比率。

为了评估β-catenin/Tcf-4转录活性，我们使用了TOP-FLASH和FOP-FLASH（Upstate）荧光素酶报告子结构。将TOP-FLASH（具有3个Tcf-结合位点重复）或FOP-FLASH（具有3次突变的Tcf-连接位点重复）质粒转染到Ad-RUNX3处理的细胞中。培养48小时后，使用双荧光素酶报告系统（Promega）测量荧光素素酶活性。转染双荧光素酶报告分析系统48小时后测量荧光素素酶活性。Renilla荧光素酶活性用作内部控制。

细胞凋亡分析

转染48小时后，用膜联蛋白V标记定量细胞凋亡。对于膜联蛋白V试验，根据制造商的方案使用膜联蛋白V-FITC标记的凋亡检测试剂盒（Abcam），并使用TUNEL试验检测肿瘤标本中的凋亡[26].

Western blot和免疫组织化学染色

如前所述进行Western blot和IHC分析。IHC评分采用半定量5类评分系统[27,28].

颅内裸鼠模型

4周龄BALB/c-A裸鼠购自中国医学科学院肿瘤研究所动物中心。建立颅内胶质瘤，5×105立体定向植入经AS-miR-19a/b或载体预处理的U87胶质母细胞瘤细胞[29]. 生物发光成像用于使用IVIS成像系统（卡尺生命科学）检测颅内肿瘤生长[30].

统计分析

使用SPSS Graduate Pack 16.0版统计软件（SPSS）进行统计。使用描述性统计，包括平均值和SE以及单因素方差分析，以确定具有统计学意义的差异。根据Kaplan-Meier方法绘制总体生存曲线。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

脚注

利益冲突

没有披露潜在的利益冲突。

基金

这项工作得到了国家高技术研究和中国国家自然科学基金（81101915、30872985和81301018）以及中国奖学金委员会（CSC）的部分支持。

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