MicroRNA-26a抑制恶性黑色素瘤的生长和侵袭性，并直接靶向MITF公司基因

MiR-26a和let-7a抑制细胞迁移和侵袭

我们进一步研究了miR-26a对伤口愈合试验检测到的细胞迁移能力的影响。与未处理的细胞或用阴性对照模拟物转染的细胞相比，用50或100nM miR-26a转染的SKMEL-28黑色素瘤细胞显示出闭合伤口的能力降低，这表明miR-26a显著抑制了细胞迁移(图2a和b). 100 nM的microRNA let-7a对细胞迁移也显示出强烈的抑制作用(补充图1).

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图2

MiR-26a抑制细胞迁移和侵袭。(一和b条)在最终浓度为50或100 nM的SKMEL-28细胞中转染阴性对照microRNA mimics或miR-26a mimics 48小时后，按照材料和方法一节中的描述进行细胞迁移分析。在显微镜下（×100）评估伤口面积，并使用Image J软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）进行测定。用以下公式测量细胞迁移抑制率：愈合面积百分比=（0小时伤口面积-24小时伤口面积）/（0小时创伤面积）。SKMEL-28型(c（c）)和WM1552C(天)将miR-26a或let-7a以100 nM的浓度转染48小时后，将黑色素瘤细胞接种到无血清培养基培养箱中h.将培养箱插入含有FBS的培养基的24孔板中，培养24h后通过显微镜（×400）观察培养箱底部的细胞数量来检测细胞侵袭能力的降低。各组的相对侵袭指数以条形图表示(e（电子）). 实验独立重复三次，结果显示为平均值±S。D.星号表示显著差异(P（P）<0.05）。

此外，使用Transwell分析检测了miR-26a和let-7a对细胞侵袭能力的影响，细胞侵袭能力是恶性肿瘤的标志。MiR-26a和let-7a显著(P（P）<0.05）降低SKMEL-28和WM1552C黑色素瘤细胞系的细胞侵袭性(图2). MiR-26a和let-7a（100 nM）分别抑制SKMEL-28细胞侵袭57%和61%(图2c). 在WM1552C细胞系中，miR-26a和let-7a分别抑制44%和51%的细胞侵袭(图2d). 因此，miR-26a和let-7a均显著抑制黑色素瘤细胞的迁移和侵袭性。

MiR-26a和let-7a导致细胞周期在G处停止₁/G公司₀阶段

我们假设miR-26a和let-7a通过诱导细胞周期阻滞来抑制细胞增殖。在SKMEL-28中(图3a)和WM1552C细胞系(图3b)miR-26a或let-7a模拟物转染后，G细胞中的细胞百分比显著增加₁/G公司₀与对照组和阴性对照组相比，S期细胞百分比同时减少。结果表明，miR-26a和let-7a可能通过诱导黑色素瘤细胞在G₁阶段。

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图3

在SKMEL-28中通过流式细胞术测量细胞周期扰动(一)和WM1552C(b条)黑色素瘤细胞。用miR-26a或let-7a（100 nM）转染细胞后，用PI（50μg/ml），流式细胞仪分析。G中的细胞百分比₀/G公司₁、S和G₂/M期使用C Flow Plus分析软件（Accuri Cytometers Inc.，美国密歇根州安阿伯）进行计算，并汇总在表中。直方图代表了三个独立的实验。星号表示显著差异(P（P）<0.05）。

MiR-26a诱导细胞凋亡

细胞周期长时间阻滞可导致细胞凋亡，这可能是miR-26a细胞毒性的重要因素。我们发现，在50或100 nM的浓度下转染miR-26a可显著增加SKMEL-28中Annexin V阳性细胞的百分比(图4a)和WM1552C(图4b)表明miR-26a在两种黑色素瘤细胞系中均诱导凋亡。

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图4

MiR-26a诱导SKMEL-28细胞凋亡(一)和WM1552C(b条)黑色素瘤细胞。用50或100 nM的miR-26a、阴性对照microRNA或单独转染试剂转染细胞48 h。然后用Annexin V-FITC和PI对细胞进行染色，并用流式细胞仪测量荧光强度。星号表示显著差异(P（P）<0.05）。

miR-26a抑制黑色素瘤细胞系中的MITF

使用三种microRNA靶点搜索算法（Targetscan、miRDB和microRNA.org）来确定人类恶性黑色素瘤中miR-26a的假设基因靶点。在所有预测的靶基因中，丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3（MAP4K3）和MITF被选为miR-26a最可能的靶基因。结果表明，miR-26a模拟物显著降低了SKMEL-28中MITF和MAP4K3的表达(图5a)和WM1552C黑色素瘤细胞系(图5b).

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图5

MiR-26a通过直接靶向MITF公司基因。用miR-26a（100 nM）或阴性对照转染细胞48小时，MITF公司和地图4K3在SKMEL-28中通过western blot检测到(一)和WM1552C(b条)黑色素瘤细胞系。利用microRNA.org预测miR-26a在MITF 3′-UTR序列上的结合位点(c（c）). 使用含有MITF 3′-UTR的萤光素酶报告载体或空载体。与含有MITF 3′-UTR的报告载体的阴性对照相比，miR-26a联合转染的相对荧光素酶活性显著降低，但空载体的相对荧光素酶活性没有降低(天). SEAP发光用于归一化。误差条代表三个重复的S.D(P（P）-值<0.01）。(e（电子）–克)敲除MITF可降低细胞存活率并诱导细胞凋亡。(e（电子）)用siMITF-a或siMITF-b（40 nM）或阴性对照转染SKMEL-28和WM1552C 72 h，并对全细胞提取物进行western blot。(（f）)用浓度为40或80nM的siMITF-a或siMITF-b转染细胞72小时，并通过MTT测定检测细胞活力。星号表示与对照组相比存在显著差异(P（P）<0.05). (克)用siMITF（40 nM）或阴性对照转染细胞72 h，然后用Annexin V-FITC和PI染色，并用流式细胞仪测定荧光强度(P（P）<0.05).

MiR-26a直接瞄准MITF的3′-UTR

为了进一步调查MITF公司基因是黑色素瘤中miR-26a的直接靶点，使用Secrete-Pair Dual Luminescence assay Kit（Genecopoeia Biotechnology Co.，Rockville，MD，USA）进行荧光素酶报告分析。将miRNA模拟物和质粒载体联合转染到两种恶性黑色素瘤细胞系中后，测量发光。共转染48小时后，阴性对照microRNA没有降低荧光素酶活性。同时，miR-26a模拟物的转染并未降低无MITF 3′-UTR序列的阴性对照载体产生的荧光素酶活性。然而，与对照组和阴性对照组相比，转染miR-26a模拟物和MITF 3′-UTR载体的细胞的荧光素酶活性显著降低(图5d). 分泌对双荧光检测（Genecopoeia Biotechnology Co.）表明，miR-26a直接结合MITF公司导致Gaussia荧光素酶的低表达。因此，经验证，MITF是一种真诚地miR-26a靶点。

敲除MITF可降低黑色素瘤细胞系的细胞活性并诱导细胞凋亡

为了测试miR-26a靶向MITF是否导致miR-26a-模拟物中观察到的细胞活性降低，我们敲除了MITF公司使用siRNAs在SKMEL-28和WM1552C黑色素瘤细胞系中的基因表达。用针对MITF的siRNA（40nM）处理细胞系72小时，并进行蛋白质印迹、MTT和凋亡测定。siMITF-a和siMIFT-b都成功地减少了MITF的表达(图5e). 此外，两种抗MIFT的siRNA均显著降低SKMEL-28和WM1552C黑色素瘤细胞系的细胞活力(图5f). 转染siMITF-a或siMITF-b（40 nM）可显著增加SKMEL-28和WM1552C黑色素瘤细胞中的Annexin V阳性细胞群，表明MIFT的敲除可诱导两种细胞系的凋亡(图5g). 因此，siMITF治疗后的细胞活力测定和凋亡测定结果与miR-26a治疗的结果基本一致。

微小RNA的分离和定量RT-PCR

按照制造商的说明，使用mirVana miRNA分离试剂盒（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）转染48小时后，从WM1552C和SKMEL-28人类黑色素瘤细胞系中分离出总microRNA。使用NanoDrop 2000C分光光度计（Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）评估分离的microRNA的质量并测量其浓度。使用通用cDNA合成试剂盒（Exiqon，Woburn，MA，USA，分别。U6 snRNA作为内源性对照。

细胞活力测定

将miR-26a-mimics、let-7a-mimic和阴性对照mimics接种到96-well板中后立即以最终浓度50和100 nM转染细胞（美国马萨诸塞州剑桥市科宁科斯塔）。48小时潜伏期后，10μ将1 MTT（3，（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化铵）试剂（Trevigen，Gaithersburg，MD，USA）添加到每个孔中，2小时后应用洗涤剂溶液溶解不溶性紫色甲酰胺。溶解染料的吸光度由微板阅读器（美国弗吉尼亚州威诺斯基市BioTek仪器公司）在570 nm处测量。进行了六个独立实验，结果报告为平均值±S。D。

伤口愈合分析

细胞转染48小时后进行胰蛋白酶处理，并接种到24孔板中（美国马萨诸塞州剑桥市科宁科斯塔），90%融合。用200μl移液管尖端（Fisherbrand，Pittsburgh，PA，USA）位于汇合细胞单层的中心。使用PBS溶液冲洗每个孔中的细胞碎片，并将细胞再培养24 h。在倒置相差显微镜（×40）下评估各组伤口的闭合情况。

细胞侵袭试验

电池（1×10⁵)在400中μl无血清培养基被镀入24孔Transwell嵌件（美国纽约州科宁市科宁公司）的顶部腔室，该嵌件具有8-μm孔。在底室中，在正常培养基中添加10%的FBS作为化学引诱剂。培养24小时后，将MTT试剂涂在每个孔上，用于细胞染色。用棉签去除培养箱顶部的细胞，用倒置显微镜评估膜底部的侵袭细胞。对于比色定量，孔中填充了200μl二甲基亚砜在黑暗中放置20分钟，以溶解甲霜。然后，将DMSO中溶解的染料移到96 well板上，并在570 nm处使用微孔板阅读器测量吸光度。

细胞周期分析

转染后48小时收集细胞，用冷PBS洗涤，并在室温下用90%冰镇乙醇固定1小时。然后用冷PBS清洗细胞，并在100×克5分钟后再悬浮500分钟μ碘化丙啶（PI，50μg/ml）。1小时后，用100μl核糖核酸酶（100μg/ml）在37°C下再搅拌30分钟，然后使用Accuri C6流式细胞仪系统（Accuri Cytometer Inc.，Ann Arbor，MI，USA）测量DNA含量。G中的种群₀/G公司₁、S和G₂/M期显示为总门控细胞的百分比。测量由三个独立的实验进行。

流式细胞术检测细胞凋亡

使用Annexin V-FITC-PI双重染色试剂盒（Biolegend，San Diego，CA，USA）检测细胞凋亡，然后按照制造商的说明进行流式细胞术分析。简单地说，用miR-26a模拟物（50或100）转染SKMEL-28和WM1552C细胞μM） 或阴性对照microRNA模拟48小时后，通过胰蛋白酶消化收集，用冰镇PBS洗涤，并以1×10的密度重新悬浮在结合缓冲液中⁶细胞悬液用Annexin V和PI染色，并用Accuri C6流式细胞仪系统进行分析。

蛋白质印迹分析

转染48小时后，将细胞胰蛋白酶化并用PBS洗涤三次，然后在冰上的裂解缓冲液中裂解30分钟。然后将蛋白质在AnyKD SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）上电泳，然后转移到硝化纤维素膜（Bio-Rad）上，并在室温下用TBST中的5%脱脂乳在振荡下封闭2小时。用兔抗GAPDH、抗MITF和抗MAP4K3（Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）的一级抗体在4°C下分别稀释1:1000、1:1000和1:1000过夜，对膜进行免疫印迹。使用HRP连接的二级抗体（1:10000）和Clarity Western ECL底物（Bio-Rad）开发信号。信号强度由FluorChem E系统（Protein Simple，Santa Clara，CA，USA）测定。

质粒构建和双重发光分析

采用分泌物对双荧光检测（Genecopoeia Biotechnology Co.）研究miR-26a是否直接调节两种恶性黑色素瘤细胞系中MITF的表达。含有含有miR-26a结合位点的MITF 3′-UTR的重组MITF载体购自GeneCopoeia（美国马里兰州Rockville）。使用不含MITF 3′-UTR的重组对照载体作为阴性对照载体。最终浓度为100 nM的MiR-26a模拟物或阴性对照模拟物与MITF载体或阴性对照载体（1μ克/μl） 将TransIT-X2动态递送系统（美国威斯康星州麦迪逊）导入SKMEL-28和WM1552C黑色素瘤细胞。转染48小时后，根据制造商的说明，对细胞进行胰蛋白酶化，并使用Secrete-Pair Dual luminescence assay Kit（Genecopoeia Biotechnology Co.）进行发光分析。发光活性由微板阅读器测量。

体内肿瘤生长模型

所有动物实验方案均由恩波利亚州立大学动物护理和使用委员会批准。6周龄雄性C57BL/6小鼠取自美国印第安纳州印第安纳波利斯市哈兰实验室有限公司（Harlan Laboratories Inc.），饲养在控制动物设施中，进行12小时的光-暗循环，并允许随意获取啮齿动物颗粒和新鲜自来水。共32只小鼠被随机分为四组（每组八只）。用浓度为50或100 nM的miR-26a或AllStars阴性对照siRNA转染细胞48小时⁵将转染后的细胞皮下植入小鼠后腹部产生肿瘤。每3天测量一次肿瘤大小，持续16天。肿瘤体积计算为（宽度）²×长度/2。

该项目得到了国立卫生研究院国家普通医学科学研究所颁发的机构发展奖（IDeA）的支持，授予号为P20 GM103418，并获得了恩波利亚州立大学教师研究与创新奖（PI:YY）。