HTLV-1 HBZ蛋白的细胞质定位：HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性瘫痪（HAM/TSP）的生物标志物

摘要

作者摘要

介绍

HTLV-1是一种致癌人类逆转录病毒，其感染影响全球至少1000万人[1]. HTLV-1是一种严重白血病/淋巴瘤的病原体，被称为成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL），其特征是CD4+T细胞的恶性转化[2]以及一种严重的神经系统疾病，命名为HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性截瘫（HAM/TSP），这是一种慢性进行性神经脊髓病，以痉挛性截肢、感觉功能障碍和括约肌功能缺陷为特征[三,4]. 与其他逆转录病毒一样，HTLV-1产生结构蛋白Gag、Pol和Env，由病毒基因组的正链编码[5]. HTLV-1基因组表达主要受两种调控蛋白Tax-1和Rex的影响，这两种调控蛋白由病毒基因组的3'区编码环境价值和3'LTR[5]. 病毒蛋白Tax-1对前病毒的转录及其致癌潜能很重要[6,7]. 病毒基因组的负链编码一个转录物，其蛋白产物被指定为HTLV-1 bZIP因子（HBZ）[8]. 值得注意的是，虽然Tax-1仅在40%的ATL患者细胞中表达，但HBZ转录物在所有ATL细胞中持续存在[5,9,10]. 这反映出HBZ对传染性和持久性也很重要体内[11]. HBZ包含一个bZIP域、一个激活（N末端）和一个中心域[8]. 这种蛋白质有两种不同的亚型：一种是含有206个氨基酸的拼接形式，另一种是含209个氨基酸的非拼接形式，导致蛋白质在其N端AD结构域中只有7个氨基酸不同[12,13]. 剪接形式比未剪接形式更丰富，几乎在所有ATL患者中都存在[14]. HBZ被描述为一种核蛋白，以斑点状结构出现[15]. 核定位与分子的基本区域和DNA结合域中存在的几个核定位信号有关[16]. 然而，在细胞系中进行的定位研究通常不能代表HTVL-1感染的真正靶点和编码基因转染后HBZ的过度表达。使用标记HBZ转染细胞的实验表明，HBZ通过其bZIP结构域与CREB-2相互作用，从而强烈抑制CREB-2/Tax-1相互作用，该相互作用工具可激活HTLV-1 LTR[8]. 除了对病毒基因组转录的抑制作用外，一系列研究表明，HBZ还能够与大量细胞转录因子相互作用，以正或负的方式调节其对细胞内环境稳定的生物活性[17]. 同样，这些研究大多是在HBZ转染细胞上进行的，这增加了获得的结果可能具有有限的生化和功能相关性的可能性。直到最近，通过使用我们实验室首次报道的抗HBZ单克隆抗体4D4-F3，才有可能首次研究内源性HBZ在HTLV-1慢性感染细胞、ATL细胞系和，最重要的是ATL患者的新鲜PBMC[18]. 尽管缺乏HBZ转染细胞中常见的聚集物，但内源性HBZ确实以位于细胞核的斑点状结构表达[8,19]. 通过对内源性HBZ的仔细量化，我们可以表明病毒蛋白的表达范围为每细胞18.000–40.000个分子，比HBZ转染细胞中的表达量少20–50倍。在慢性感染细胞和ATL中，HBZ相互作用体内与p300和JunD共定位，并且仅部分共定位，取决于HBZ的表达量，不仅与p300、JunD，还与CBP和CREB2共定位[18].

本研究旨在确定我们是否可以通过共焦显微镜检测和定义内源性HBZ在其他主要HTLV-1相关病理学HAM/TSP中的亚细胞定位。此外，该分析还扩展到其他ATL病例以及感染的无症状携带者（AC）。有趣且出乎意料的是，对四名不同的HAM/TSP患者的PBMC的分析明确显示HBZ蛋白仅位于细胞质中。相反，在绝大多数ATL患者的新鲜PBMC中证实了HBZ的核定位，而我们无法在AC细胞中检测到HBZ。在HAM/TSP中，HBZ阳性PBMC细胞的百分比在0,4%到11%之间。其中四分之三的患者在PBMC中检测到Tax-1，其百分比在1%至20%之间。有趣的是，在同一细胞中没有发现HBZ和Tax-1的共同表达。在ATL患者的细胞中未检测到Tax-1。

这些结果在HTLV-1相关疾病发病机制的现有知识框架内进行了讨论。

结果

HAM/TSP患者PBMC中HTLV-1 HBZ蛋白的细胞学定位

为了确定内源性HBZ在HAM/TSP中的亚细胞定位，采用免疫荧光和共聚焦显微镜分析了4例HAM/TSP患者的PBMC，即PH1485、PH1593、PH1601和PH1624。与ATL中HBZ核定位形成鲜明对比[18]在所有4例HAM/TSP患者中，HBZ定位局限于细胞质(图1A). DRAQ5（核标记）和波形蛋白（细胞质标记）的平行染色证实了唯一的HBZ细胞质定位。HBZ表现为离散点，形状与ATL患者PBMC中发现的核斑点相似。在所分析的四名患者中，有三名患者的HBZ阳性细胞占PBMC总数的4%至11%，但只有0.4%HBZ阳性的PH1601患者除外(表1). 然后分析HAM/TSP患者PBMC中Tax-1蛋白的表达和亚细胞定位。Tax-1分别在PH1601、PH1485和PH1624患者的1%、14%和20%的PBMC中表达(表1). 在PH1593 PBMC中未检测到Tax-1。患者PH1485 Tax-1定位于细胞核中的点状结构(图1B).这些细胞的一部分也在细胞质中表达Tax-1。在PH1624患者中，Tax-1定位在细胞核中，其中大部分细胞也在细胞质中表达Tax-1。重要的是，没有发现细胞同时表达HBZ和Tax-1，如图1C对于PH1624患者的PBMC，HBZ+（9%）和Tax-1+（20%）细胞的百分比都很高（另请参见表1).

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图1

HAM/TSP患者PBMC内源性HBZ和Tax-1的亚细胞定位。

（A） 四名HAM/TSP患者（PH1485、PH1593、PH1601和PH1624）的PBMC分别用4D4-F3抗-HBZ单克隆抗体、Alexa Fluor 546结合山羊抗小鼠IgG1抗体（红色）和（B）A51-2抗Tax-1单克隆抗体以及Alexa Fuor 488结合山羊抗鼠IgG2a抗体（绿色）进行染色，并用共聚焦显微镜进行分析。通过使用DRAQ5荧光探针检测细胞核和抗波形蛋白兔多克隆抗体，然后结合Alexa Fluor 488（绿色，A组）或Alexa Fluor 546（红色，B组）的山羊抗兔IgG，对细胞核或细胞质室进行特异性反染。至少分析了300个细胞；每个患者都有HBZ或Tax-1染色的代表性细胞。（C） 低倍视野显示PH1624患者PBMC中细胞质HBZ和Tax-1表达相互排斥的细胞共存。用4D4-F3抗HBZ单克隆抗体和A51-2抗Tax-1单克隆抗体对细胞进行联合染色，然后按（A）和（B）所述进行特异性二级抗体染色。

表1

HTLV-1相关病理中HBZ+和Tax-1+PBMC的百分比和亚细胞分布。

病人	抗体滴度*	病理	HBZ+细胞（%）			Tax-1+细胞（%）
			总计	核	细胞	总计	核	细胞
PH1485电话	640	HAM/TSP公司	11	0	11	14	14	5^
电话1593	2560	HAM/TSP公司	4	0	4	0	-	-
电话1601	2560	HAM/TSP公司	0,4	0	0,4	1	1	0
PH1624电话	2560	火腿/茶匙	9	0	9	20	20	12^
电话1393	320	ATL公司	83	83	0	0	-	-
电话1505	1280	ATL公司	80	83	0	0	-	-
PH1614电话	640	自动控制	0	-	-	11	11	5^
电话1619	640	自动控制	0	-	-	1	1	0
电话1621	1024	自动控制	0	-	-	6	6	2^

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*材料和方法中规定的抗HTLV-1抗体的反向稀释值。

^细胞质和细胞核中Tax-1定位的细胞百分比。Tax-1从未单独定位于细胞质

为了扩大我们之前对ATL患者的研究，我们用免疫荧光和共聚焦显微镜对另外两名患者（PH1393和PH1505）的PBMC进行了研究。在这两名患者的PBMC中，80%和83%的细胞HBZ阳性(表1). HBZ定位于细胞核中的斑点状结构(图2)以与之前描述的PH961患者非常相似的方式[18]. 核标记DRAQ5和细胞质标记波形蛋白的平行染色证实了HBZ的唯一核定位。还分析了两名ATL患者的PBMC是否存在Tax-1蛋白；没有一个对这种病毒蛋白呈阳性(表1).

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图2

ATL患者PBMC内源性HBZ和Tax-1的亚细胞定位。

用抗HBZ 4D4-F3单克隆抗体对2例ATL患者（PH1393和PH1505）的PBMC进行染色，然后用Alexa Fluor 546结合羊抗鼠IgG1抗体检测HBZ蛋白，并用共聚焦显微镜进行分析。使用DRAQ5荧光探针或抗波形蛋白抗体对细胞核或细胞质隔室进行特异性反染，如图例所述图1.至少分析了300个细胞；每个患者都有一个HBZ染色的代表性细胞。两名患者PBMC的Tax-1蛋白表达均为阴性。

有趣的是，分析的三个无症状携带者（PH1614、PH1619和PH1621）的PBMC对HBZ没有任何阳性反应(图3A)尽管他们在一小部分但独特的细胞中表达Tax-1（分别为11%、1%和6%），表1)优先但非排他性的核本地化(图3B).综上所述，这些结果首次确立了HAM/TSP患者与ATL患者HBZ蛋白亚细胞定位的显著差异，显示了HAM/TSP患者HBZ前所未有的排他性细胞质定位。

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图3

HTLV-1阳性无症状携带者PBMC中缺乏内源性HBZ，但未检测到Tax-1。

（A） 三个HTLV-1阳性无症状携带者（PH1614、PH1619和PH1621）的PBMC用抗HBZ 4D4-F3和（B）抗Tax-1 A51-2单克隆抗体染色，然后用Alexa Fluor 546结合的山羊抗小鼠IgG1抗体检测HBZ蛋白（红色），或用Alexa-Fluor 488-结合的山羊-抗小鼠Ig G2a检测Tax-1（绿色），并用共焦显微镜进行分析。通过使用DRAQ5荧光探针检测细胞核和抗波形蛋白兔多克隆抗体，然后结合Alexa Fluor 488（绿色，A组）或Alexa Fluor 546（红色，B组）的山羊抗兔IgG，对细胞核或细胞质室进行特异性反染。至少分析了300个细胞；为每个患者显示一个代表性单元格。

HAM/TSP中的HBZ稳定地存在于细胞质中，不往返于细胞核

为了评估HBZ在HAM/TSP患者PBMC中的细胞质定位是否是由细胞核中蛋白质的快速循环引起的稳定特征或动态事件，PH1624患者的PBMC用核输出抑制剂Leptomycin B（LMB）处理，并通过免疫荧光和共聚焦显微镜进行分析。结果清楚地表明，LMB处理不影响HAM/TSP PBMC中HBZ的细胞质定位(图4A). 相反，正如我们之前展示的那样[20]这种处理导致转染Tax-1编码cDNA的293T细胞中Tax-1蛋白的核保留显著(图4B).从这些结果中，我们得出结论，在HAM/TSP患者中，HBZ特异性地滞留在细胞质中，并且不会穿梭到细胞核中。

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图4

HBZ是一种常驻细胞质蛋白，在HAM/TSP中不会穿梭到细胞核。

（A） HAM/TSP患者PH1624的PBMC在用抗HBZ 4D4-F3单克隆抗体和Alexa Fluor 546结合的山羊抗鼠IgG1抗体（红色）固定和染色之前，用核输出抑制剂LMB治疗（+LMB）或未治疗（-LMB）。（B） 作为LMB抑制核输出的对照，转染Tax-1病毒蛋白质粒的293T细胞用LMB（+LMB）处理或不处理（-LMB）。细胞固定并用A51-2抗Tax-1单克隆抗体染色，然后用Alexa Fluor 488-共轭羊抗鼠IgG2a（绿色）染色，并用共焦显微镜进行分析。DIC表示差分干涉对比度图像。

HAM/TSP代表性PH1624患者的HBZ阳性细胞存在于CD4+/CD25-T细胞亚群中

为了确定在HAM/TSP患者中表达细胞质HBZ蛋白的细胞亚群，我们详细分析了PH1624患者的PBMC，其中HBZ阳性细胞数量最多（9%）。免疫荧光和流式细胞术对相关细胞表面标志物的初步分析(图5和表2)显示该患者在88%、63%和27%的PBMC中表达CD3、CD4和CD8标记物。该表型与正常供体PBMC的表型非常相似。有趣的是，已知在活化和调节性T（Treg）细胞中表达的T细胞标记物CD25在PH1624 PBMC中未被检测到，而在正常PBMC的4-5%中表达量较低。根据CD19标记物的存在评估，B细胞隔室的PH1624（10%）的比例几乎相等CD16标记评估的NK细胞占PH1624 PBMC的4%，占正常PBMC的10%。HLAⅠ类在PH1624和正常PBMC中均表达，HLAⅡ类在PH1485和正常PBMC中分别表达15%和18%。

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图5

HAM/TSP患者PH1624和健康对照PBMC中细胞表面标记物的表达。

通过免疫荧光和流式细胞术检测TSP/HAM患者PH1624和健康对照者PBMC上HLAⅠ类、HLAⅡ类DR、CD3、CD4、CD8、CD25、CD19和CD16表面分子的表达，并用各种标记物特异性抗体进行检测。结果表示为细胞的相对数量（纵坐标）与任意单位的平均荧光强度（横坐标）。在每个直方图中，通过用适当的同种匹配抗体染色细胞而获得的阴性对照物用虚线表示。

表2

HAM/TSP PH1624患者PBMC亚群中HBZ阳性细胞的百分比。

CD4（63%）*	CD8（27%）	CD25（0%）	CD19（10%）	CD16（4%）
15^	< 1	0	0	0

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*括号中的值表示阳性细胞占所分析PBMC总数的百分比，通过免疫荧光和FACS分析进行评估。

^每个特定亚群中HBZ+细胞的百分比。

随后，进行共焦显微镜分析。在很大比例的CD4+细胞中可以清楚地检测到细胞质HBZ(图6A、扩展字段、顶部面板和关注单个单元格、底部面板）。事实上，大约15%的CD4+T细胞也是HBZ+(表2). 考虑到PH1624患者9%的PBMC中检测到了细胞质HBZ，并且CD4+T细胞约占该患者PBMC的63%，因此得出几乎所有HBZ+细胞都包含在CD4+T细胞室中。事实上，在PH1624患者的CD8+PBMC中几乎未检测到HBZ+细胞质细胞(图6B、顶部面板、扩展字段）。在仔细分析了100多个CD8+T细胞后，事实上只有一个细胞在其细胞质中共同表达HBZ(图6B中面板，扩展视野，聚焦于单个阳性细胞，下面板）。对PH1624患者PBMC中CD25表达的共聚焦分析证实，该标记物的细胞为阴性(图7，左上面板）。同样，CD19+B细胞和CD16+NK细胞均未表达胞质HBZ(表2). 因此，在表现出HBZ阳性细胞高百分比的典型HAM/TSP患者中，细胞质HBZ几乎只存在于CD4中⁺T细胞和这些细胞不共同表达CD25标记。

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图6

HBZ优先在HAM/TSP患者PH1624的CD4+T细胞中表达。

HAM/TSP患者PH1624 PBMC的共焦显微镜分析。（A） 4D4-F3抗-HBZ单克隆抗体与Alexa Fluor 546结合的山羊抗鼠IgG1抗体（红色）共染色，抗CD4单克隆抗体和Alexa Fuor 488结合的山羊-兔IgG抗体（绿色）共染色；上部面板，扩展场；下面板，放大的视野聚焦于左上面板正方形中所示的单个细胞，CD4和HBZ均为阳性。（B） 与4D4-F3抗-HBZ单克隆抗体、Alexa Fluor 546结合的山羊抗小鼠IgG1抗体（红色）以及与Alexa Fluor 647直接结合的抗CD8兔单克隆抗体（蓝色）共同染色；上部面板显示了HBZ阴性CD8+细胞的扩展场；中间面板，扩展视野，许多CD8+细胞为HBZ阴性，单个CD8+/HBZ+细胞（方形）；下部面板，单个CD8+/HBZ+细胞上的放大视野。

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图7

通过共焦显微镜评估PH1624患者PBMC中缺乏CD25+细胞。

HAM/TSP患者PH1624和健康对照者的PBMC分别与抗HBZ 4D4-F3单克隆抗体、Alexa Fluor 546结合的山羊抗鼠IgG1抗体（红色）和直接与Alexa Fluor 488结合的抗CD25单克隆抗体（绿色）共染色，并用共聚焦显微镜进行分析。左上角显示PH1624患者CD25染色阴性，与健康对照组PBMC（PBMC，右下角）相同标记物的阳性细胞相比

讨论

HTLV-1感染通常会导致无症状携带者状态，可能会持续一生。然而，在3-7%的个体中，感染可导致非常严重的白血病/淋巴瘤、ATL或慢性进行性神经疾病。其他不太常见的疾病也与某些高流行地区的HTLV-1感染有关，如日本的葡萄膜炎和南美洲、非洲和加勒比的感染性皮炎。导致ATL的致癌进展主要归因于病毒转录激活因子Tax-1，它劫持了细胞内环境稳定控制的基本机制[21]. 然而，只有40%的ATL患者能够表达Tax-1，而所有患者都表达HBZ，这一事件被解释为Tax-1参与致癌过程的第一阶段，HBZ参与维持白血病状态[11,22]. 虽然最近的数据已明确证明内源性HBZ在ATL细胞和慢性感染细胞系中的核定位[18]，没有关于HAM/TSP患者HBZ内源性表达和亚细胞定位的数据。在本研究中，我们证明四名HAM/TSP患者的PBMC中有高达11%的离散百分比表达HBZ，并且这种表达仅限于细胞质。细胞质HBZ呈点状分布，类似于ATL患者白血病细胞中观察到的核斑点状结构([18]和这项研究），有时分散在细胞质中，有时集中在细胞质的一个有限区域。

HAM/TSP患者中其他数值正常的PBMC中表达HBZ的细胞百分比相对较低，而且研究中患者仅有少量PBMC样本，这妨碍了对HBZ在细胞质中滞留的分子基础进行生化分析。未来的研究将集中在这一关键方面，同时对HBZ所在的亚细胞质区室进行更精细的表征。在这个框架内，在亚细胞水平的生化和共聚焦分析中，一定需要对选定的患者进行白细胞分离以获得更多的细胞。然而，可以提出几个假设来帮助解释我们的发现并指导未来的研究。例如，已经描述了由不同的mRNA衍生的两种不同形式的HBZ，剪接的和非剪接的[12——14]. 拼接和未拼接HBZ显示出超过95%的序列同源性，并且仅在前七个N端氨基酸中存在差异。未剪接和剪接HBZ都应该存在于HAM/TSP中，并且至少在mRNA水平上已经发现[23]. 虽然以前的研究表明，未分裂和拼接的HBZ都定位于细胞核[13,15]尤其是在ATL细胞中，不能排除两种HBZ形式中的一种优先分布在HAM/TSP细胞质区域的另一种可能性。本研究中使用的4D4-F3抗HBZ单克隆抗体是针对该蛋白的剪接形式提出的；然而，抗体识别的表位应该存在于拼接和未拼接的HBZ中，因为它位于BR1区域，介于aa 97–135之间[18]. 因此，4D4-F3单抗可能不是解决此问题的合适工具。最近有报道称，在无症状携带者和HAM/TSP患者中，HBZ蛋白中存在氨基酸变异。这些变异在激活域和核定位信号序列中被识别[24]. 因此，HBZ序列的变异可能会影响蛋白质的亚细胞定位。在这方面，重要的是要强调的是，在HAM/TSP患者PBMC中HBZ的细胞质定位并没有因使用Leptomycin B（一种阻断CRM1依赖的核-细胞质穿梭蛋白的药物）治疗细胞而改变，这强烈表明HBZ是细胞质常驻者，HAM/TSP中的非迁移蛋白。应该强调的是，我们无法在本研究分析的无症状携带者的PBMC中检测到HBZ阳性细胞。这可能是由于HBZ的表达水平低于我们方法的可检测阈值，或者由于在AC中确实没有HBZ表达。虽然不能完全排除抗体无法检测到的特定亚细胞细胞质和/或核结构中的HBZ分区似乎不太可能先验的未来的研究将阐明这一方面。

本研究中另一个有趣的发现涉及HTLV-1 Tax-1在单细胞水平的表达和定位。在HAM/TSP患者的PBMC中，当检测到Tax-1时，Tax-1总是定位在细胞核中，并且在细胞核和细胞质中的细胞比例可变。重要的是，它从未在表达HBZ的同一细胞中表达。而Tax-1和HBZ表达的解耦联在ATL患者中相当常见[5,9,10,14]HBZ或Tax-1蛋白在单细胞水平上的互斥表达尚未见报道。目前尚不清楚HAM/TSP患者细胞中这一事件的分子基础，这肯定将是我们未来研究的重点。很容易推测，这一发现可能与功能水平有关，特别是与HTLV-1感染细胞的免疫识别有关。HBZ细胞质定位（可能位于胞外隔室）可能不适合生成能有效结合MHC I类分子以供细胞毒性T细胞（CTL）呈现和检测的肽。这可能解释了HAM/TSP中HBZ特异性CTL水平相对较低的原因[25,26]与HBZ特异性CTL在Tax-1特异性CTLs的强识别和裂解效率方面的不满意的裂解效率相结合[27].

对具有代表性的HAM/TSP患者PH1624的PBMC进行的额外共聚焦显微镜分析清楚地表明，HBZ+细胞的主要亚群（如果不是唯一的）是由CD4+细胞代表的。事实上，约15%的CD4+细胞表达细胞质HBZ。相反，在对大量CD8+PH1624细胞（超过100个细胞）进行计数后，只发现1个细胞与细胞质HBZ共表达。因此，如果从一个侧面来看，这一结果表明CD8+细胞可以被HTLV-1感染，并且在HAM/TSP患者中表达HBZ，那么与HBZ+/CD4+细胞的频率相比，这一事件极为罕见。在B细胞和NK细胞中也没有HBZ蛋白表达。通过FACS和共聚焦分析，HAM/TSP患者PH1624的PBMC均未显示CD25+T细胞的存在。通过共聚焦分析的进一步细化证实了CD4+/CD25+T细胞的缺失，CD4+/CD25+T细胞是包括调节性T细胞（Treg）的亚群。虽然CD4+/CD25+Tregs可以被HTLV-1感染，但HAM/TSP患者已被证明有大量CD4+/CD25+的Tregs功能受损（参见[28])以及与ATL中观察到的HBZ mRNA表达水平相当的HBZ mRNA表达水平[29]本文的结果表明，在HAM/TSP患者中，HBZ蛋白很容易在CD4+T细胞中表达，而不显示Treg细胞的典型表型。当然还需要进一步的研究来详细说明HAM/TSP患者中表达HBZ蛋白的CD4+T细胞的表型和功能相关性，以及其他受HTLV-1感染的细胞（如单核细胞/巨噬细胞）可能在其细胞质中表达HBZ蛋白的可能性。

总之，基于本文的结果，我们提出HBZ细胞质定位可以被认为是真诚地HTLV-1衍生HAM/TSP病理学的生物标志物。未来的研究将致力于评估HTLV-1感染期间的HBZ细胞质定位，以及在感染者获得明确的病理学体征之前对其进行随访，以可能确定HBZ胞质定位不仅作为生物标记物，而且作为HAM/TSP发展的预测因素。

材料和方法

致谢

资金筹措表

这项工作得到了Insubia大学2014-2016年授予RSA和GT的FAR号校内拨款的支持(www.uninsubria.it网站); 作者：Fondazione Anna Villa和Felice Rusconi(网址：www.fodazione-rusconi.it)为GUR提供博士奖学金；EC第七框架计划HepaVAC拨款编号602893(网址：www.hepavac.eu). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

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