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公共科学图书馆一号。2016; 11（3）：e0152607。
2016年3月31日在线发布。 数字对象标识：10.1371/新闻稿.0152607
预防性维修识别码：项目经理4816327
PMID：27030982

人类多能干细胞和衍生神经祖细胞对BH3模拟物ABT-263、WEHI-539和ABT-199的敏感性不同

卡罗琳娜·保拉·加西亚,# 吉列尔莫·阿古斯丁·维德拉·理查森,# 尼科拉斯·亚历克西斯·迪莫普洛斯, 达米安·达里奥·费尔南德斯·埃斯皮诺萨, 圣地亚哥·加布里埃尔·米利乌卡, 古斯塔沃·埃米利奥·塞夫勒夫, 莱昂纳多·罗莫里尼,和玛丽亚·埃利达·斯卡萨*
Yiqun G.Shellman，编辑器
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摘要

人类胚胎干细胞（Human embryonic stem cells，hESCs）对遗传毒性应激非常敏感，相对于其分化的后代，其生存能力较低。在此，我们试图通过比较拓扑异构酶I抑制剂喜树碱在hESCs、人诱导多能干细胞（hiPSCs）和hESCs衍生的神经原细胞（NP）中引发的DNA损伤反应来研究这种差异的来源。我们观察到，与分化细胞相比，喜树碱暴露后，多能干细胞的凋亡速度更快，速度更快。然而，包括共济失调-扩张症突变激酶激活和丝氨酸15和丝氨酸46上的p53磷酸化在内的细胞反应在上述细胞类型中非常相似。重要的是，我们观察到hESCs和hiPSCs表达的抗凋亡蛋白Bcl-2水平低于NP。为了评估Bcl-2丰度是否可以解释这种差异反应，我们用ABT-263、WEHI-539和ABT-199处理细胞，优先靶向Bcl-xL和/或Bcl-2的BH3-结合囊的小分子，并降低其隔离促凋亡因子的能力。我们发现，在没有应激刺激的情况下，NP对ABT-263和WEHI-539的敏感性高于hESCs和hiPSCs。相反，所有受试细胞类型似乎都对Bcl-2特异性抑制剂ABT-199高度耐药。然而，在所有病例中，我们确定ABT-263或WEHI-539治疗加剧了喜树碱诱导的细胞凋亡。重要的是，在siRNA介导的Bcl-xL或Bcl-2下调后观察到类似的反应。综上所述，我们的结果表明，Bcl-xL与Bcl-2相反，有助于确保细胞存活，并在多能干细胞和衍生NP细胞中作为DNA双链阻断诱导凋亡的主要抑制物。多能干细胞和祖细胞对Bcl-2和Bcl-xL活性的相对依赖性的新知识可能有助于预测细胞反应，并在不久的将来可能将这些细胞用于治疗目的。

介绍

细胞在应激条件下激活生存和/或死亡信号通路。程序性细胞死亡或凋亡信号经常汇聚在线粒体上，这一过程由促凋亡和抗凋亡B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）家族成员的活性控制[1–三].

Bcl-2家族成员可分为三个主要亚类，这三个亚类部分由四个保守区内的同源性决定。这些被称为Bcl-2同源（BH）1-4结构域的区域对应于α-具有决定蛋白质结构和功能的类似序列的螺旋。一般来说，抗凋亡成员（如Bcl-2、Bcl-xL、Bclw-1和Mcl-1）在所有四个BH结构域中显示序列同源性，而促凋亡成员（例如Bax和Bak）具有同源的BH1-3结构域[4]. 一大组促凋亡蛋白（例如Bid、Bad、Bik、Bim、Bmf、Puma、Noxa和Hrk/DP5）仅包含BH3结构域。仅BH3的蛋白质根据功能进一步细分为两类：“激活剂”（例如Bid、Bim和Puma）和“敏化剂”（如Bad、Bik和Noxa）[5,6].

凋亡过程中的一个关键的初始步骤是通过一个Bax或Bak分子的BH3结构域与另一个Bax或Bak的疏水沟槽结合形成二聚体来激活Bax或Bak[7]. Bax和Bak低聚物参与线粒体外膜孔的形成，并促进线粒体因子的释放，这些因子介导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活和凋亡的特征。这种寡聚反应可以由许多信号诱导，例如p53诱导的BH3-only蛋白或p53本身[8,9].

生存前Bcl-2家族成员通过隔离多域促凋亡蛋白和仅BH3蛋白的BH3结构域来对抗凋亡。激活物BH3-only蛋白结合并抑制抗凋亡成员（如Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1），还直接与Bax和Bak相互作用，导致其在线粒体上寡聚[1]. 相反，仅敏化剂BH3蛋白只能与抗凋亡因子结合，从而释放激活剂和促凋亡蛋白，驱动线粒体外膜通透性[5,10,11].

当BH3-only蛋白被激活以响应应激信号时，促生存蛋白的BH3-binding囊袋饱和，Bax或Bak的激活就可以继续进行下去[12]. 模拟BH3基序的小分子有望通过与抗凋亡Bcl-2成员的疏水沟槽结合并取代结合的活化剂BH3蛋白来诱导凋亡。

人类胚胎干细胞（hESCs）来源于植入前胚泡的内细胞团，而诱导多能干细胞（hiPSC[13,14]. 这两种细胞类型都有可能在人类成年生物体中产生几乎任何类型的细胞，因此，人们认为维持其基因组完整性至关重要。

与分化后的细胞相比，多能干细胞对外源性应激源（如DNA损伤剂）特别敏感，并迅速发生凋亡，而不是试图修复受损的基因组[15]. 目前，这种易凋亡状态背后的机制尚不清楚。最近，刘和同事们[16]据报道，人胚胎干细胞发生凋亡的敏感性可能与其较高的线粒体启动状态有关，线粒体启动是基于促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡而降低的细胞内生凋亡阈值。

来源于人胚胎干细胞的神经前体细胞（NP）已被开发成为研究神经发育和神经毒性的模型。这些NP能够自我更新并分化为神经谱系细胞。了解NP的基本生物学对于生成功能性分化细胞是必要的，这些细胞可以同时用作在体外并最终替换功能失调或退化的神经元。

涉及Bcl-2家族蛋白的程序性细胞死亡是发育中的神经系统用来清除多余或受损神经元的基本机制[17]. 然而，程序性细胞死亡在各种神经退行性疾病中也会异常激活，因此，它仍然是对抗这些疾病的重要治疗靶点[18]. 因此，对NP易受有害DNA损伤（包括DNA双链断裂（DSB））影响的研究结果相关，这些损伤可能由自然发生的代谢产物或外源性应激源的影响引起[19].

在此，为了进一步了解经历神经分化的hESCs、hiPSCs和hESCs如何保护基因组完整性免受潜在致死性DSB的影响，我们比较了它们对拓扑异构酶I抑制剂喜树碱（CPT）的反应[20]. 我们发现，DNA损伤反应，主要涉及共济失调毛细血管扩张症突变（ATM）信号和丝氨酸15和46处的p53磷酸化，在多能干细胞类型和未成熟分化后代（NP）中相似。我们确定，尽管CPT诱导多能干细胞和人胚胎干细胞衍生的NP中caspase-9和-3活化、聚ADP-核糖聚合酶（PARP）裂解和凋亡特征不同，但其程度和动力学不同。此外，我们发现，Pifithrin-μ（PFT-μ）对线粒体p53易位的特异性抑制降低了CPT在hiPSCs中触发的凋亡反应，但在NP中没有，突显了p53线粒体程序在多能干细胞凋亡调控中的重要性。

为了深入了解控制hESCs、hiPSCs和hESCs衍生的NP命运决定对DSB的反应机制，我们通过使用模拟BH3基序的小分子ABT-263、WEHI-539和ABT-199来减弱其抗凋亡活性。ABT-263优先靶向Bcl-2和Bcl-xL的BH3-结合囊，而WEHI-539仅靶向Bcl-xL，ABT-199选择性抑制Bcl-2[21–23]. 使用这些试剂，我们研究了Bcl-xL和/或Bcl-2抑制在干细胞和祖细胞存活中的作用。我们还确定ABT-263或WEHI-539治疗加剧了CPT引发的细胞凋亡。本研究设想了一种模型，其中Bcl-xL调节细胞存活，并作为DSBs诱导的受试细胞类型中细胞死亡的主要抑制物。

材料和方法

本研究符合2013年10月《赫尔辛基宣言》，并已由生物医学研究伦理委员会“基金会生物研究委员会”批准并从每个组织用于该项目的患者那里获得书面知情同意书。

细胞培养

hESC系WA09（H9）在低传代（p15至p20）时购自WiCell研究所（WI）[13]. hiPSC系FN2.1由人包皮成纤维细胞产生。如前所述，用STEMCCA慢病毒感染对细胞进行重新编程[24,25].

hESC和hiPSC细胞系保存在灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）饲养层上，饲养层由Dulbecco改良Eagle's培养基/火腿F12（DMEM/F12）组成，补充20%敲除血清替代物（KSR）、2 mM非必需氨基酸、2 mM-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、50μg/ml链霉素、，0.1 mMβ-巯基乙醇和4 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。所有这些试剂均来自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。用1 mg/ml胶原酶IV（Invitrogen，CA，USA）将多能干细胞转移到无饲料稀释（1/40）Matrigel中™（BD Bioscience，San Jose，CA，USA）含有iMEF条件培养基的涂布皿。用于调节介质，3×106将灭活的MEF与25 ml DMEM/F12培养基培养24 h，补充5%KSR和2 ng/ml bFGF（以及上述其他补充物），并保存在-20°C下。解冻后，将新鲜的KSR和bFGF等分样品添加到培养基中，使最终浓度分别达到20%和4 ng/ml。

手术后尽快从新鲜获得的人包皮中制备人包皮成纤维细胞（HF）作为原代培养物。根据抗击小儿神经疾病基金会伦理委员会制定的指南，获得患者的书面知情同意。简单地说，在去除脂肪和松散的筋膜后，用无菌手术刀将外科废弃组织修剪成条状（约0.5 cm×1.5 cm）。切下的组织用dispase进行通宵消化，然后小心地去除表皮。将剩下的真皮置于高糖DMEM中，10%FBS（vol/vol），置于组织培养板上，并在37°C，5%CO中培养2，90%湿度培养箱。在7-10天内，成纤维细胞出现了生长。然后将分离的成纤维细胞膨胀、冷冻并按其他说明保存。

神经祖细胞的产生

通过用针将H9菌落切成小块，将其从饲养层上分离，并在添加20%KSR、2mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、50μg/ml链霉素、，0.1 mMβ-巯基乙醇4天。然后用神经诱导培养基替换培养基（补充有N-2补充剂、2 mM非必需氨基酸和1μg/ml肝素的DMEM/F12培养基）。为了诱导神经花环形成，将6天大的EB接种在20μg/ml层粘连蛋白涂层（Sigma-Aldrich，MO，USA）培养皿上，并在神经诱导培养基中培养15天。在层粘连蛋白涂层表面培养EB的过程中，观察到神经玫瑰花结，并手动从周围的扁平细胞中去除。接下来，在立体显微镜下使用无菌玻璃移液管将玫瑰花结切成小块，并将其铺在层粘连蛋白包被的培养皿上，并在神经增殖培养基中培养，该培养基由补充有B27、N-2、2mM L-谷氨酰胺、2mM非必需氨基酸、50U/ml青霉素/链霉素的神经基底培养基组成，20 ng/ml bFGF、20 ng/ml表皮生长因子（均购自美国加利福尼亚州Invitrogen）、20μg/ml牛胰腺胰岛素和75μg/ml低内毒素牛血清白蛋白（美国密苏里州西格玛）。在初始分化持续21天后，使用accutase（Invitrogen，CA，USA）分离NP 5分钟，以300 x g离心5分钟，用神经增殖培养基重新悬浮，并将其涂布在10μg/ml层粘连蛋白涂层的培养皿上，以进一步膨胀和冷冻保存。

为了进行神经元分化，将NP悬浮在补充有B27、N-2、2 mM L-谷氨酰胺、2mM非必需氨基酸、50 U/ml青霉素/链霉素（均来自美国加利福尼亚州英维特罗根）、20μg/ml牛胰腺胰岛素和75μg/ml低内毒素牛血清白蛋白（美国密苏里州西格玛）的神经基础培养基中，作为漂浮聚集物，放置三天。然后用神经诱导培养基代替培养基（补充有N-2、2 mM非必需氨基酸和1μg/ml肝素的DMEM/F12培养基），细胞聚集物膨胀10天。培养基每2天更换一次。神经扩张后，将聚集物（神经球）附着在神经分化培养基（补充有B27、N-2、10 ng/ml BDNF、10 ng/ml GDNF、200μg/ml抗坏血酸、0.1μM cAMP和20μg/ml层粘连蛋白的神经基底培养基）中10μg/ml的层粘连素涂层板上10天。每2天更换一次培养基。

抑制剂

（R） -4-（4-（（4'-氯-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基）甲基）哌嗪-1-基）-N-（（4-（4-吗啉-1-（苯硫代）丁-2-基氨基）-3-（三氟甲基）磺酰基）苯基）磺酰）苯甲酰胺（ABT-263）；4-[4-[[2-（4-氯苯基）-4,4-二甲基环己烯-1-基]甲基]哌嗪-1-基]-N-[3-硝基-4-（恶烷-4-基甲胺基）苯基]磺酰基-2-（1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基）苯甲酰胺（ABT-199）（加州圣克鲁斯生物技术公司）；5-[3-[4-（氨甲基）苯氧基]丙基]-2-[（8E）-8-（1,3-苯并噻唑-2-基肼亚基）-6,7-二氢-5H-萘-2-基]-1,3-噻唑-4-羧酸（WEHI-539）（美国加州旧金山Genentech USA Inc慷慨赠送）和PFT-μ（美国密苏里州圣路易斯Sigma）溶解在二甲基亚砜中，并储存在-20°C下。将抑制剂添加到细胞培养物中，使最终DMSO浓度保持在0.25%（v/v）。

细胞转染与RNA干扰

使用Lipofectamine用相应的小干扰RNA（siRNA）转染细胞™2000脂质试剂（Invitrogen CA，USA）。简单地说，3x105细胞/孔（6孔板）转染Silencer®选择阴性对照#2（Ambion™，cat#4390846），消音器®选择已验证的Bcl-xL siRNA（Ambion™，siRNA ID:120717）或消音器®预先设计的Bcl-2 siRNA（Ambion™，siRNA ID:214532）（Invitrogen，加利福尼亚州，美国）。用于细胞转染的siRNA浓度（50 nM）是根据剂量反应研究选择的。转染48小时后测定细胞活力。

免疫染色和荧光显微镜

对hiPSCs和hESCs衍生NP进行原位免疫荧光分析。简单地说，用冰镇PBS冲洗细胞并用4%甲醛将其固定在PBSA（含0.1%牛血清白蛋白的PBS）中45分钟。用PBS冲洗两次后，用0.1%Triton X-100在含10%正常山羊血清的PBSA中渗透细胞30分钟，冲洗两次并用相应的一级抗体染色。使用荧光二级抗体定位抗原/一级抗体复合物。用DAPI对细胞进行复染，并在配备20X E-Plan物镜和超高压汞灯的尼康Eclipse TE2000-S倒置显微镜下进行检查。这些图像是用尼康DXN1200F数码相机采集的，该相机由EclipseNet软件（版本1.20.0 build 61）控制。使用了以下主要抗体：α-磷酸化ATM（ab81292）、α-γH2AX（ab2893）、α-p53（ab1101）（美国马萨诸塞州剑桥市Abcam公司）、α-p53第15列（类别9284）（Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA）；α-MAP2（M1406），α-MAP5（M4528）（西格玛，密苏里州圣路易斯，美国）；α-巢蛋白（AB5922）（美国加利福尼亚州特梅库拉Millipore）和α-双皮质激素（E-6）（sc-271390）美国加利福尼亚州圣克鲁斯），α-Tuj1（MMS-435P）（美国新泽西州普林斯顿市科文斯）

流式细胞术分析

NP单细胞悬浮液是通过使用锐角菌（美国加利福尼亚州英维特罗根）（37°C，5-10分钟）处理获得的。电池（1x106)与单克隆CD133/1（AC133）-PE偶联抗体（1:40，Miltenyi Biotec，Auburn，CA，USA）在4°C下孵育30分钟，并用2 ml PBS洗涤。然后以200 x克将其重新悬浮在0.5 ml PBS中5 min，并通过流式细胞仪进行分析。使用WinMDI 2.9软件从Becton Dickinson（BD Biosciences，San Jose，USA）的FACSAria II流式细胞仪上获取数据。通过用特定的同型对照物替换特定的一级抗体来评估背景荧光。

用碘化丙锭（PI）流式细胞术分析细胞活力

PI是一种不渗透膜的染色质染料，它被排除在膜完整的细胞之外，而具有受损质膜的细胞在染料嵌入DNA时会发出红色荧光。添加ABT-263、WEHI-539或ABT-199后20小时，用锐角菌处理（37°C，5-10分钟）获得单细胞悬浮液。然后以200倍离心分离细胞克持续5分钟，再悬浮10分钟6FACS缓冲液中的细胞/ml（2.5 mM CaCl2140 mM NaCl和10 mM HEPES，pH 7.4）。接下来，将100μl细胞悬液与5μl PI（50μg/ml）在PBS中在黑暗中孵育5分钟。最后，向每个试管中添加400μl FACS缓冲液，并立即用流式细胞仪分析细胞。结果表示为显示PI荧光（不存活）的细胞占处理的细胞总数的百分比。荧光强度通过流式细胞术在配备有488nm氩激光器（Becton Dickinson）的FACScan上测定。

细胞周期分布的流式细胞术分析

对于DNA含量分析，将细胞固定在70%乙醇中，在PBS中再水化，并用RNase A（1 mg/ml）处理30分钟，用PI（1 mg/ml）处理5分钟。荧光强度通过流式细胞术在配备488-nm氩激光（Becton Dickinson）的FACScan上测定。使用BD CellQuest软件进行数据采集，并使用MODFIT-LT软件程序（Verity software House，Topsham，ME，USA）计算G1、S和G2/M期细胞的百分比。

逆转录聚合酶链式反应

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取总RNA。用MMLV逆转录酶（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）从500 ng总RNA合成cDNA。cDNA样品稀释五倍。使用SYBR进行定量PCR研究®绿色-ER™qPCR SuperMix UDG（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。使用的引物如下：Bcl-2，forward5'-TATAACTGGAGAGTGCTGAAG-3'，反向5’-ACTTGATTCTGGTTTTCCC-3’; Bcl-xL，向前5'-TGCGTGGAAAGCGTAGACAAG-3'，反向5’-GTGAGAGTGTAGTGGATGG-3’; Bax，向前5’-GACGGCAACTTCAACTGG-3’，反向5’-GTGAGGCTTGAGGAG-3’; Bcl-w，向前5’-TGGATGGTGCCTACCTG-3’，反向5’-CGTCCCCGTATAGAGCTG-3’; Mcl-1，向前5'-GGGCAGGATTGACTCATT-3'，反向5'-GATGCAGCTTTCTTGGTTTATGG-3'; 美洲狮，前进5’-GACCTCAACGAGTACGAG-3’，反向5'-AGGAGTCCCATGATGATT-3'和GAPDH，向前5'-ACAGCCTCAAGATCAG-3'，反向5’-GAGTCTTCCACGATACC-3’使用ABI PRISM 7500序列检测系统（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）对所有样本进行分析，并将其归一化为GAPDH基因表达。

西方印迹法

细胞在添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的冰镇RIPA缓冲液中进行裂解，并使用Bichinconic Acid protein Assay（Pierce™美国伊利诺伊州罗克福德）。在12%聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行等量的蛋白质，并转移到PVDF-FL膜（Millipore，Billerica，MA，USA）。将膜在含有0.1%吐温20的奥德赛封闭缓冲液（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，USA）中封闭1h，然后在4°C的含有奥德赛阻断缓冲液、0.05%吐温20和相应的一级抗体的溶液中培养过夜。冲洗膜4×用含有0.1%吐温20（TTBS）的Tris缓冲盐水（TBS）、20mM Tris-HCl、pH 7.5、500mM NaCl）孵育5分钟，然后在含有奥德赛阻断缓冲液、0.2%吐温20和IR染料二级抗体（1:20.00，LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，USA）的溶液中孵育1小时，随后洗涤4×TTBS中5分钟，1×在TBS中5分钟。立即使用680nm和780nm通道以4的扫描强度扫描膜的蛋白带。使用奥德赛红外成像系统（LI-COR）显示免疫复合物。使用了以下主要抗体：α-肌动蛋白（sc-1616）、α-Bax（N-20）（sc-493）、α-Bcl-2（C-2）（sc-7382）、α-BclXS公司/L（左）（S-18）（sc-634），α-GAPDH（V-18）（sc-20357）（美国加利福尼亚州圣克鲁斯），α-p53第15列（类别9284），α-磷酸-p53Ser46系列（类别2521）（Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA）和α-p21Waf1型（类别556430）（BD Pharmingen™（美国加利福尼亚州圣何塞市Becton-Dickinson）。用近红外荧光标记的IR-Dye 800CW或IR-Dye680RD二级抗体检测抗原/一级抗体复合物（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，USA）。

或者，电泳后将分离的蛋白质转移到PVDF膜上（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。在室温下，在含有低脂奶粉（5%）的TTBS中封闭印迹1h。在4°C的温度下，在封闭缓冲液（TTBS中的3%脱脂奶）中对一级抗体进行12小时的培养。然后将膜与相应的反抗体和经增强化学发光检测证明的蛋白质孵育（SuperSignal West Femto System，Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）。使用了以下主要抗体：α-PARP（sc-8007）和α-Actin（sc-1616）（美国加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）、α-活性Caspase-3（ab13847）（美国马萨诸塞州剑桥市Abcam公司）和α-Caspase-9（cat.9502）（美国麻省贝弗利市Cell Signaling Technology公司）。使用了以下二级抗体：辣根过氧化物酶结合的α-兔IgG；α-小鼠IgG或α-山羊IgG。

细胞活力测定

细胞被镀到Matrigel上™涂布96-well组织培养板，密度在1x10之间4和3x104每个孔的细胞并生长直至汇合。在CPT（1μM，持续3 h）和/或ABT-263（0.1μM）、WEHI-539（1μM）或ABT-199（1μL）去除后的指定时间点，在含有0.3μg/孔中间电子载体的PBS中50μg/井活化的2,3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-5[（苯氨基）羰基]-2 h-四唑氢氧化铵（XTT）（西格玛，圣路易斯，密苏里州，美国），添加N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸盐（PMS）（Sigma，St.Louis，MO，USA）（最终体积100μl）并在37°C下培养2–3 h。通过使用多波长分光光度计（Benchmark，Bio-Rad，Hercules，CA，USA）在450 nm波长下测量样品的吸光度，并减去690 nm的背景吸光度，来测定细胞代谢活性。

DNA片段的评估

用细胞死亡检测ELISA直接测定核小体DNA片段定量细胞凋亡Plus（加）套件（德国曼海姆罗氏公司）。该分析使用针对来自片段DNA的组蛋白的特异性单克隆抗体，允许测定细胞裂解物细胞质部分中的单核小体和寡核小体。简单地说，2 × 105细胞被放置在24孔板上，500μl培养液中。在添加ABT-263（0.1μM）或ABT-199（1μM）后15小时或停药后3小时（1μM，持续3小时），根据制造商手册对细胞进行裂解，然后进行离心（200 x g，5分钟）。当指定的ABT-263（0.1μM）或ABT-199（1μM）在CPT治疗前和治疗期间1小时添加到培养基中时（1μM持续3小时）。使用抗组蛋白生物素抗体测定上清液中的单核小体和寡核小体。使用Benchmark微量滴定板读数器（Bio-Rad Hercules，CA，USA）在405nm波长下测量得到的显色，该显色与抗体三明治中捕获的核小体的量成比例。结果表示为DNA低聚物百分比，根据处理样品与未处理样品的吸光度比计算得出。

统计分析

所有结果均表示为平均值±SEM。学生的配对t检验用于确定平均值之间的显著差异，低于0.05的P值被认为具有统计学意义。

结果

CPT处理的hiPSCs和hESCs衍生NP的DNA损伤反应信号

尽管干细胞生物学的最新进展促进了人胚胎干细胞对不同基因毒性应激反应的表征，但这些还远未被完全理解。因此，为了深入了解多能性细胞对DNA损伤的反应，我们试图比较两种不同类型的人类多能性干细胞（hESCs和hiPSCs）对DSBs诱导剂CPT（一种众所周知的DNA-拓扑异构酶I复合物抑制剂）的反应。考虑到人类胚胎干细胞提供了一个可访问和可管理的平台来模拟人类发展的早期阶段，我们生成了由胚胎干细胞衍生的NP，以进一步表征正在经历神经分化的胚胎干细胞中由基因毒性应激触发的细胞反应。为此，我们将H9 hESCs置于神经分化协议下。我们确定，人胚胎干细胞衍生的NP表达干细胞标记物nestin和CD133以及神经元迁移蛋白doublecortin（DCX）(图1a)。这些NP进一步分化为具有加工能力的神经元样细胞，其微管相关蛋白MAP-2和MAP-5以及神经元特异性III类β-微管蛋白（Tuj1）染色阳性(图1b，底部面板）。

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人胚胎干细胞衍生的NP和分化的神经元样细胞表型特征。

（a） 用nestin和DCX的主要抗体染色的NP代表性图像（左面板）。H9 hESCs衍生NP的代表性流式细胞术直方图叠加显示了CD133相对于同型对照的表达（右面板）（b）NP和分化的神经样对应物的代表性图像，用MAP-2、MAP-5和Tuj1的一级抗体染色。用DAPI对细胞核进行复染。比例尺代表100μm。

在之前的研究中，我们描述了H9 hESCs对CPT诱导的DNA损伤的反应[26]在此，我们将其行为与FN2.1 hiPSCs系列进行了比较[25]以及从相同的细胞背景分化细胞，特别强调生存/死亡决定的机制。

与hESCs中发生的情况类似，我们发现CPT治疗（1μM持续3 h）导致FN2.1 hiPSCs和NP中ATM（丝氨酸1981）和H2AX（丝氨酸139，γH2AX）同时磷酸化。3 h内，在受损细胞中也观察到丝氨酸15上p53的核蓄积和磷酸化(图2a).

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CPT激活hiPSCs和hESCs衍生的NP中的DNA损伤反应并触发细胞凋亡。

（a） 基因毒性治疗（3小时内1μM）的hiPSC和NP在CPT治疗后立即进行免疫荧光显微摄影（3小时期间1μM。图中显示了用抗ATM磷蛋白（pATM）、组蛋白γH2AX、p53、p53磷蛋白15（p53pSer15）的初级抗体染色的细胞的代表性图像。用DAPI对细胞核进行复染。比例尺代表100μm。（b） 在药物去除后6 h，通过XTT/PMS分析，在3 h内测量经或未经1μM CPT处理的hESCs、hiPSC、NP和HF的细胞存活率（顶面板）。结果显示为未处理细胞的存活率百分比。每个条形图代表三个独立实验的平均值±SEM，一式五份。一对学生的t吨该试验用于比较CPT处理的样品和未处理的对照。在停药3小时后，收集经CPT处理的细胞，并通过免疫分析对DNA低聚物进行定量（底部面板）。结果显示为未处理细胞的DNA低聚物百分比。每个条形代表三次独立实验的平均值±SEM*P＜0.05，**P＜0.001。（c） 在药物去除后立即（3小时）、6小时或15小时（分别为3+6、3+15），用抗胱天蛋白酶-9、抗裂解胱天蛋白酶-3和抗PARP特异性抗体通过Western印迹分析CPT治疗后hiPSCs和NP中胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3和PARP裂解的时程。GAPDH被用作负荷控制。

然后，我们评估了CPT（1μM持续3小时）对H9 hESCs、FN2.1 hiPSCs、NP和HF存活率的影响。为此，我们使用XTT/PMS活性染料分析测定了6小时停药后存活细胞的百分比。我们发现，CPT对hiPSCs生存能力的影响大于NP，细胞存活率分别下降到约43%和70%(图2b)。重要的是，这两种多能干细胞对拓扑异构酶I的抑制同样敏感。值得注意的是，用于hiPSC重新编程的HF在测试浓度和时间范围内都对CPT作用产生了抗药性。

为了阐明对CPT的不同敏感性是否与每种细胞类型中驻留在S期的细胞百分比有关，我们通过DNA含量的流式细胞仪分析表征了其细胞周期分布。流式细胞术结果显示，与H9 hESCs相似，FN2.1 hiPSCs细胞中有相当一部分（65%）在任何给定时间通过S期。相反，NP和HF在S期的细胞比例很小（分别为14%和10%）(S1图)。因此，如果我们考虑到CPT杀死细胞的主要机制是通过S期依赖性细胞毒性，那么CPT治疗后观察到的hiPSC活性的较高下降可能至少部分归因于经过细胞周期S期的多能干细胞百分比的升高。

为了进一步研究细胞活力的丧失是否是由于CPT诱导的凋亡所致，我们测量了DNA片段（细胞质寡核苷酸片段），这是凋亡级联反应中的一个晚期事件，也是多种半胱氨酸蛋白酶依赖和独立通路聚合的一个事件[27]. 为此，我们用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量了处理和未处理细胞中DNA片段的丰度。如所示图2b（底部面板）在去除CPT后3小时（1μM持续3小时），受损多能干细胞（hESCs和hiPSCs）中的DNA低聚物百分比显著增加。相反，在受损的人胚胎干细胞衍生的核蛋白中，仅观察到DNA片段的轻微而不显著的增加(图2b)。值得注意的是，根据ELISA定量判断，应激和非应激HF中的DNA寡聚体数量没有明显差异(图2b，底部面板）。

半胱氨酸蛋白酶是半胱氨酸蛋白水解酶的一个家族，作为常见的死亡效应分子，一旦激活，就会分裂细胞质或细胞核中的各种底物。因此，我们决定评估拓扑异构酶I的抑制是否导致hiPSCs中caspases的激活。为此，我们进行了Western blot分析，发现在CPT处理3小时后，引发剂原蛋白酶-9（47 kDa）被加工成活性片段（37/35 kDa(图2c，左上面板）。此外，使用识别裂解caspase-3的特异性抗体，我们确定该效应器caspase在添加CPT后3 h也被激活(图2c，左中面板）。活性执行子caspase-3可以进一步切割参与凋亡变化的下游底物，如PARP。我们发现hiPSCs在DNA损伤后3小时内积累裂解的PARP(图2c，左下面板）。有趣的是，我们确定在CPT暴露后，FN2.1 hiPSCs和H9 hESCs显示出caspase-9和caspase-3活化的类似动力学[26].

接下来，我们想知道拓扑异构酶I抑制在未分化的人胚胎干细胞和经历神经分化的人胚干细胞中诱导的凋亡反应之间是否存在差异。在这方面，我们观察到，在hESC衍生的NP中，CPT触发了前caspase-9的蛋白水解过程，停药6小时后出现35kDa裂解片段证明了这一点(图2c，右上面板）。胱天蛋白酶-9激活后，胱天蛋白酶-3和PARP裂解，在基因毒性去除后15小时变得明显(图2c、右侧中间和底部面板）。总之，这些发现表明，CPT似乎在hESCs、hiPSCs和hESCs衍生后代中诱导了相似的反应，但在不同程度上和不同的动力学。

在多能干细胞和NP中CPT暴露后，p53在丝氨酸46处发生磷酸化

为了应对DNA损伤，p53经历了一系列翻译后修饰，其中一些被认为在靶基因选择性中起作用[28]. 在这方面，最近的研究表明丝氨酸46上p53的磷酸化是一个重要的细胞命运决定因素，有利于p53依赖性转录激活促凋亡靶基因[29,30]. 这些考虑促使我们探索p53是否在多能干细胞和人胚胎干细胞衍生的NP细胞中的丝氨酸46上发生磷酸化。为了解决这个问题，在治疗后的不同时间点采集CPT处理（1μM，持续3 h）的H9 hESCs、FN2.1 hiPSCs和NP，并进行Western blot分析。免疫印迹分析显示，在所有受试细胞类型中，CPT暴露后，p53在丝氨酸46上磷酸化。停药6小时后，hESCs和hiPSC的磷酸化p53（Ser46）水平升高。然而，在NP中，这种翻译后修饰仅在药物去除15小时后才变得明显(图3a，左侧面板）。事实上，丝氨酸15上的p53磷酸化先于丝氨酸46上的磷酸化，这与之前的研究结果一致，即特定的磷酸化事件可能依赖于之前的p53翻译后修饰。从这个意义上说，ATM对丝氨酸15的p53磷酸化促进了丝氨酸6、丝氨酸9、苏氨酸18、丝氨酸20和丝氨酸46的进一步磷酸化[31].

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CPT触发丝氨酸46的p53磷酸化。

（a） 使用抗磷酸化p53 Ser46（p53pSer46）特异性抗体，在药物去除后（分别为3+6小时、3+15小时）立即通过Western blotting分析CPT治疗后丝氨酸46处p53磷酸化的时间进程。GAPDH被用作负荷控制（左侧面板）。p21蛋白Waf1型使用抗p21的特异性抗体，在1μM CPT治疗（3小时）、6小时或15小时后（分别为3+6小时、3+15小时），立即通过Western blotting分析hiPSCs和hESCs衍生NP中CPT暴露后的表达水平Waf1型和肌动蛋白（右面板）（b）mRNA水平bcl-2基因,bax基因和彪马通过实时RT-PCR分析CPT治疗或未治疗的hESCs、hiPSCs和NP。GAPDH表达作为正常化指标。图中显示了mRNA相对于未受损hESCs的折叠诱导，任意设置为1。每个条形代表三个独立实验的平均值±SEM。在所有病例中，使用配对Student’s t检验比较CPT处理的样本与未处理的样本（c）在药物去除后6 h，通过XTT/PMS测定PFT-μ处理或未处理细胞（10μM，CPT暴露前1 h和暴露期间）的细胞存活率。结果显示为未处理细胞的存活率百分比（左侧面板）。在CPT处理后3小时（3小时内1μM）采集经PFT-μ处理或未处理的细胞，并通过免疫分析测定DNA寡聚体。结果显示为未处理细胞的DNA低聚物百分比。每个条形代表三次独立实验的平均值±SEM（右侧面板）。在所有情况下，使用配对Student t检验比较CPT加PFT-μ处理的样品与CPT处理的样品。*P<0.05，***P<0.0001。

在之前的一项研究中，p21缺乏可检测水平Waf1型Western印迹分析证实了H9-hESCs中的蛋白，尽管CPT触发了p53的稳定[26]. 因此，我们询问这种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂是否也会在未受损和受损的hiPSC中缺失。为了回答这个问题，我们对未经治疗和CPT治疗的hiPSC进行了Western blot分析。我们发现，与在人胚胎干细胞中发生的情况类似，这种多能干细胞类型不表现出可检测到的p21水平Waf1型甚至在DNA严重受损之后。相反，我们确定经历神经元分化的人胚胎干细胞表达可感知的p21水平Waf1型在基因毒性停药6小时后强烈诱导(图3a，右侧面板）。这种诱导以前在CPT处理的类胚体中观察到（正在进行血清诱导分化的H9 hESCs）[26].

p53作为一种转录因子，通过诱导可导致生长停滞或凋亡的转录程序，对某些细胞应激源作出反应。p53通过转录激活基因如p21介导阻滞Waf1型而p53依赖性凋亡是由促凋亡基因如Bax和Puma的反式激活触发的[32]. 除了能够促进促凋亡Bcl-2家族成员的转录外，在某些情况下，p53还可以通过直接抑制促生存Bcl-2转录来调节凋亡[33]. 为了解决p53稳定是否伴随着bcl-2基因,bax（巴克斯）和彪马我们对受损和未受损细胞的mRNA水平进行实时定量RT-PCR分析。我们观察到彪马所有受试细胞系在停药后6小时（1μM持续3小时）的mRNA，而bcl-2基因和bax基因检测到mRNA表达水平(图3b)。有趣的是，我们发现hESCs和hiPSCs表现出明显的低水平bcl-2基因mRNA水平高于NP(图3b左侧面板）。

p53线粒体死亡程序调节基因毒性诱导的多能干细胞死亡程度

在几种细胞类型中，p53启动了一个直接的线粒体死亡程序，以应对强烈的应激[34]. 为了阐明该程序在hiPSCs和hESCs衍生后代中是否也有功能，我们将细胞暴露于PFT-μ，PFT-γ是一种小分子，通过降低其与Bcl-xL和Bcl-2的亲和力来抑制p53与线粒体的结合，但对p53依赖的反式激活没有影响[35,36]. 为此，我们在药物去除6小时后，在有PFT-μ（10μM，CPT暴露前和暴露期间1小时）的情况下，对CPT处理或未处理的细胞进行了细胞活力测定。通过XTT/PMS测定，我们确定当添加PFT-μ时，受损多能干细胞的细胞活力增加（hESCs中为22%，hiPSC中为27%）(图3c，左侧面板）。有趣的是，我们还发现，正如之前在人类胚胎干细胞中所描述的那样[26]，PFT-μ保护hiPSCs免受自发凋亡（12-16%）。相反，在存在该抑制剂的情况下，未观察到hESC衍生NP活性的明显差异(图3c，左侧面板）。为了进一步了解p53在这些细胞类型中参与CPT诱导的细胞死亡，我们通过量化CPT治疗的hESCs、hiPSCs和NP中存在或不存在PFT-μ的细胞溶质DNA寡聚体的百分比来确定凋亡水平。如中所示图3c（右图），PFT-μ处理显著降低了多能干细胞去除基因毒性后3h细胞质中存在的DNA寡聚体的数量（hESCs中为41%，hiPSCs中为48%），而NP中未观察到显著变化。这些结果表明，在几种细胞类型中，p53的线粒体死亡程序调节基因毒性诱导的细胞死亡的程度，特别是在hESCs和hiPSCs中，也影响自发细胞死亡。

多能干细胞的抗凋亡Bcl-2水平低于人胚胎干细胞衍生的神经祖细胞

通常，达到凋亡阈值的能力是由关键促凋亡和抗凋亡因子的内源性表达水平决定的。因此，为了评估多能干细胞和祖细胞凋亡关键调控因子的表达水平，我们进行了实时定量RT-PCR分析。我们确定未分化和分化的细胞表现出类似的抗凋亡因子表达谱bcl-w公司,bcl-xL公司、和mcl-1型和促凋亡蛋白bax（巴克斯）和彪马(图4a)。然而，我们发现hESCs和hiPSCs的促生存因子水平较低bcl-2基因mRNA比NP(图4a)。此外，使用Western blotting，我们观察到bcl-2基因,bcl-xL公司和bax（巴克斯）mRNA及其蛋白产物(图4b)。重要的是，之前在WA01 hESC细胞系中将未分化细胞与其全细胞进行比较时，观察到了Bcl-2的这种表达谱-反式维甲酸分化对应物[16]支持未分化细胞中促凋亡和抗凋亡蛋白的内在平衡比分化细胞中更接近凋亡阈值的概念。同时，我们检测了上述促凋亡因子和抗凋亡因子在HF中的表达谱。实时PCR数据显示，这些细胞显示较低水平的凋亡因子美洲狮mRNA和更高水平的bcl-w公司mRNA表达水平高于多能干细胞和NP细胞。有趣的是，我们发现HF表现出非常低的Bcl-2水平。Bcl-2的这种减少表达模式以前在在体外正常成纤维细胞的衰老[37].

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Bcl-2家族成员在hESCs、hiPSCs、hESCs衍生NP和HF中的表达谱。

（a） mRNA表达水平bcl-2基因,bcl-w公司,bcl-xL公司,mcl-1型,bax（巴克斯）和彪马通过实时定量RT-PCR分析hESCs、hiPSCs、NP和HF中的GAPDH表达。图中显示了mRNA相对于hESCs的折叠诱导，任意设置为1。显示了三个独立实验的平均值±S.E。在所有病例中，采用配对Student t检验来检验hESCs和每个被测细胞系之间的显著差异*P<0.05，***P<0.0001。（b） 显示了具有代表性的Western blot图像。制备细胞提取物，并使用抗Bcl-2、抗Bcl-xL和抗Bax特异性抗体进行Western blot分析。Actin用作加载控制（顶部面板）。使用计算机辅助密度分析测量Bcl-2和Bcl-xL对应的蛋白带的强度，并将其归一化为肌动蛋白的强度。Bcl-2和Bcl-xL的强度也相互比较，并表示为每个细胞系的平均比率（底部面板）。进行配对Student’s t检验，以检验hESCs和每个受试细胞系之间的显著差异*P<0.05。

BH3模拟药物ABT-263在hESCs、hiPSCs和NP中引发细胞凋亡并加剧CPT诱导的细胞死亡

在凋亡开始时，细胞通常激活不同种类的BH3-only蛋白，这些蛋白优先结合并灭活过多的抗凋亡Bcl-2家族蛋白。最近的研究表明，在细胞死亡之前，必须隔离所有抗凋亡分子[38]. 因此，凋亡阈值可能在很大程度上取决于仅BH3蛋白未占据的生存前亲属的比例。

这些考虑促使我们问，干扰促凋亡和抗凋亡蛋白之间的平衡是否会使细胞激活凋亡。为了回答这个问题，我们将细胞暴露于小分子BH3蛋白模拟物ABT-263[21]研究BH3-结合囊的增加是否足以启动多能干细胞和NP细胞的细胞死亡反应。

为了评估ABT-263是否在hESCs、hiPSC、NP和用于产生hiPSC的起始细胞群（HF）中触发类似的作用，我们将这些细胞类型暴露于该药物浓度增加（0.1μM至1μM）的环境中15小时。如所示图5a，ABT-263治疗导致多能干细胞的浓度依赖性死亡。ABT-263（0.1μM）暴露导致hESCs（13%）和hiPSC（16.5%）的生存能力轻度下降，但具有统计学意义(图5a，顶部面板）。相反，ABT-263（0.1μM）引起NP活力显著下降（36%）。我们的结果表明，NP对ABT-263的敏感性高于多能性细胞，而HF对该分子几乎完全不敏感。

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ABT-263降低hESCs、hiPSCs和NP的细胞活力并增强CPT诱导的凋亡。

（a） H9 hESCs、FN2.1 hiPSCs、hESCs衍生NP和HF在15h内用浓度增加的ABT-263（0.1–1μM）处理（顶部面板），或用ABT-264（0.1μM）预处理1小时，然后用CPT处理（3小时内用1μM处理）（中间面板）。在添加ABT-263（0.1μM）后15 h或ABT-266（0.1μM）和/或基因毒性去除后6 h，通过XTT/PMS分析测定细胞活力。结果显示为未处理细胞的存活率百分比。每个条形图代表三个独立实验的平均值±SEM，一式五份。在添加ABT-263（0.1μM）15小时后，或在退出3小时后，采集ABT-266（0.1μM）和/或CPT处理的细胞，并通过免疫分析对DNA低聚物进行定量（底部面板）。结果显示为未处理细胞的DNA低聚物百分比。每个条形代表三次独立实验的平均值±SEM。使用配对Student t检验比较ABT-263处理的样品与未处理的样品（顶面板）或CPT加ABT-265处理的样品和CPT处理的样品之间的差异（中面板和底面板）*P<0.05，**P<0.001。（b） 20小时内经PI染色的ABT-263（0.1μM）处理细胞或未经处理的未固定细胞的代表性直方图。通过流式细胞术分析（c）在CPT（1μM，3 h）、ABT-263（0.1μM，15 h）或ABT-265（0.1μM，0.1μM）后，hESCs、hiPSCs和NP中的PI阳性细胞百分比（晚期凋亡或坏死）由Caspase-9、Caspase-3激活和PARP裂解确定在CPT治疗前和治疗过程中的1 h内，在去除基因毒性后的3 h内通过Western blotting进行分析。GAPDH被用作负荷控制。

添加药物后20 h，通过流式细胞仪分析和PI染色进一步证明ABT-263（0.1μM）在受试细胞类型中的差异细胞毒性。PI是膜不渗透的，不能进入具有完整膜的活细胞，因此图5b显示包含质膜完整性的细胞百分比（晚期凋亡或坏死）。这种对ABT-263敏感性的差异程度至少可以部分解释为多能细胞和NP细胞显示的Bcl-2的不同表达水平。

在未分化的hESCs和hiPSCs中，许多促凋亡基因的表达与相对较少的抗凋亡基因相比存在偏差[16,39]. 这种表达谱表明，这些多能干细胞的存活可能受到功能性抗凋亡因子的高度调节。因此，我们想知道抗凋亡因子的活性是否在基因毒性应激下多能干细胞的命运中发挥重要作用。为了解决这个问题，我们用ABT-263预处理细胞并将其暴露于CPT。基因毒性去除后6小时测量的细胞活力分析显示，添加ABT-263显著增加hESCs和hiPSCs系对CPT的超敏反应(图5a中间面板）。此外，当Bcl-2因子的活性受到ABT-263治疗的损害时，经历神经分化的人胚胎干细胞对DSB诱导的细胞死亡的敏感性显著增加。

此外，我们通过ELISA测定停药3小时后寡核苷酸形成的程度，确定ABT-263（0.1μM）对CPT诱导的细胞凋亡的影响。我们发现，ABT-263（0.1μM）处理显著增加了CPT诱导的H9 hESCs（约2.0倍）、FN2.1 hiPSCs（约1.6倍）和NP（约2.0倍数）中DNA寡聚体的数量(图5a，底部面板）。此外，DNA断裂和细胞活性丧失伴随着典型的凋亡特征，如细胞脱落和膨胀(S2图)。ABT-263加速了hESCs、hiPSCs和NP中这些形态学变化的出现，这些变化在添加CPT后的3小时就变得明显（比较ABT+CPT，1+3小时与CPT，3+12小时）(S2图)。相反，HF似乎具有更高的凋亡阈值，因此，在ABT-263和CPT存在的情况下，至少在测试的浓度和时间范围内，HF不会发生凋亡(图5和S2图).

然后，为了进一步描述由于ABT-263占据BH3小窝而导致程序性细胞死亡的事件，我们通过Western blot分析评估了活性caspase-9和-3的表达以及裂解PARP的存在。如所示图5cABT-263的存在增加了启动子和效应子半胱天冬酶活性片段的丰度，以及受损多能干细胞和祖细胞中PARP裂解的程度。此外，在NP中，在基因毒性添加后的3小时内，活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和89 kDa PARP裂解片段的出现是明显的，而在缺乏BH3-模拟分子的情况下，这些现象在15小时的退出期后变得明显(图2c)。这些结果与其他实验室先前的研究结果一致，ABT-263治疗增加了分化hESCs对D的敏感性不适用双链切割剂新卡司汀[16].

抗Bcl-xL策略（siRNA或BH3mimetic:WEHI-539）使多能干细胞和NP细胞对CPT诱导的DNA损伤敏感

为了进一步研究Bcl-xL作为多能干细胞和NP细胞生存因子的相关性，我们使用了最近开发的Bcl-xL选择性BH3模拟物WEHI-539。我们发现H9 hESCs和FN2.1 hiPSCs细胞暴露于该化合物后，在浓度为1-10μM时会导致活性丧失(图6a顶部面板）。重要的是，NP对WEHI-539治疗的敏感性高于多能干细胞(图6a和6b)。此外，正如0.1μM ABT-263存在时一样，我们确定1μM WEHI-539次最佳剂量可有效增强多能干细胞和NP细胞对CPT的反应，但对HF无影响(图6a，底部面板）。

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Bcl-xL的药理抑制或siRNA-介导的下调使hESCs、hiPSCs和NP对CPT诱导的DNA损伤敏感。

（a） H9 hESC、FN2.1 hiPSC、hESCs衍生NP和HF未经处理或在15h内用浓度增加的WEHI-539（0.1–10μM）处理（顶面板），或用CPT（1μM）治疗3h，或用WEHI-5391（1μM）预处理1h，然后暴露于CPT（底面板）。在添加WEHI-539（1μM）后15 h或去除CPT后6 h，通过XTT/PMS测定细胞活力。结果显示为未处理细胞的存活率百分比。每个条形图代表三个独立实验的平均值±SEM，一式五份。使用配对Student t检验比较WEHI-539处理样品与未处理样品（顶部面板）或CPT加WEHI-539-处理样品与CPT处理样品（底部面板）*P<0.05，**P<0.001。（b） PI-染色的WEHI-539（1μM）处理细胞在20小时内或未处理的未固定细胞的代表性直方图。通过流式细胞术分析测定PI阳性细胞的百分比（c）H9 hESCs、FN2.1 hiPSCs、hESCs衍生的NP细胞用nt-siRNA或Bcl-xL-siRNA（50nM）转染，并在转染后48小时暴露于CPT（1μM，3小时）。去除基因毒性12小时后，PI染色转染细胞的代表性直方图（左面板）。mRNA表达水平bcl-xL公司通过实时RT-PCR（右面板）分析nt-siRNA和Bcl-xL siRNA转染的细胞株。GAPDH表达被用作标准化因子。图中显示了与nt-siRNA转染剂相关的mRNA折叠诱导，任意设置为1*P<0.05**P<0.001。

为了深入了解Bcl-xL在多能性和NP细胞存活调节中的作用，我们使用了siRNA诱导的基因沉默。为了确定siRNA介导的Bcl-xL敲除在转染细胞中的有效性，我们对来自转染非靶向控制siRNA（nt-siRNA）或Bcl-xL特异性siRNA的细胞的RNA进行了实时RT-PCR图6c转染Bcl-xL siRNA的细胞中Bcl-xL mRNA显著降低。正如预期的那样，我们发现siRNA介导的Bcl-xL下调使多能干细胞和祖细胞对拓扑异构酶I抑制诱导的遗传毒性显著敏感(图6c和S2图)。即使在CPT治疗后，siRNA下调Bcl-xL表达也不会影响HF的形态或粘附(S2b图)。综上所述，这些结果证实Bcl-xL代表了一种与hESCs、hiPSCs和NP具有显著生理相关性的抗凋亡分子。

Bcl-2选择性抑制并不影响CPT在多能干细胞和NP细胞中触发的凋亡水平

为了剖析Bcl-2和Bcl-xL在多能干细胞和祖细胞命运决定中的相对贡献，我们使用了ABT-199，一种有效且选择性的Bcl-2抑制剂[40]. 为了解决这个问题，我们在ABT-199浓度增加（0.1μM到10μM）的情况下，在15小时内进行了生存能力测定。我们发现抑制Bcl-2既不影响多能干细胞也不影响成纤维细胞的生存能力(图7a)。然而，在用10μM ABT-199治疗后，NP中观察到明显的细胞活力损失（约40%）(图7a)。在ABT-199（1μM）暴露20小时后，使用PI染色的流式细胞术进一步证实了这种对ABT 199敏感性的降低(图7b).

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Bcl-2选择性抑制剂ABT-199对hESCs、hiPSCs NP和HF活性的影响。

（a） H9 hESCs、FN2.1 hiPSCs、hESCs衍生NP和HF在15 h内未经处理或用浓度增加的ABT-199（0.1–10μM）处理（顶部面板），或用CPT（1μM）治疗3 h，或用ABT-199（1μM）预处理1 h，然后在3 h内用CPT处理（底部面板）。在添加ABT-199后15小时或去除CPT后6小时，通过XTT/PMS测定细胞活力。结果显示为未处理细胞的存活率百分比。每个条形图代表三个独立实验的平均值±SEM，一式五份。使用配对Student t检验比较ABT-199处理的样品与未处理的样品（顶面板）或CPT加ABT-199-处理的样品和CPT处理的样品之间的差异（底面板）*P<0.05（b）20小时内PI染色的ABT-199－处理细胞或未处理的未固定细胞的代表性直方图。PI阳性细胞（晚期凋亡或坏死）的百分比通过流式细胞仪分析确定（c）NP转染nt-siRNA或Bcl-2 siRNA，并在转染后48小时暴露于CPT（3小时内1μM）。有代表性的图片显示，nt-siRNA或Bcl-2 siRNA转染NP后，用1μM CPT处理或不处理3小时（转染后48小时）。在去除基因毒性后12小时拍摄图像。比例尺代表100μm。去除基因毒性12小时后，PI染色转染细胞的代表性直方图（左面板）。信使核糖核酸表达水平bcl-2基因通过实时RT-PCR（右面板）分析nt-siRNA和Bcl-2siRNA转染的NP。GAPDH表达被用作标准化因子。图中显示了与nt-siRNA转染剂相关的mRNA折叠诱导，任意设置为1**P<0.001。

然后，为了测试双歧杆菌诱导细胞凋亡对Bcl-2的需求，我们用ABT-199（1μM）预处理hESCs、hiPSCs、NP和HF，并将其暴露于CPT。如所示图7c在CPT和CPT加ABT-199处理的细胞之间，存活细胞的百分比没有明显变化。重要的是，我们确定了Bcl-2表达与ABT-199敏感性之间存在负相关。

为了进一步证实这些发现，我们检测了siRNA介导的沉默Bcl-2表达对NP的影响。实时RT-PCR在转染后48小时验证了Bcl-2 siRNA的有效敲除(图7c)。如所示图7cBcl-2-siRNA和nt-siRNA转染子之间的细胞活力没有观察到明显的变化。接下来，我们询问Bcl-2下调是否会触发CPT敏感性的变化。为了找到答案，我们用50 nM siRNA转染NP后，将NP暴露于CPT（1μM）中3小时和48小时，并确定nt-siRNA和Bcl-2 siRNA转导剂对药物的反应相同(图7c)。这些结果表明，Bcl-2在保护多能干细胞和NP细胞免受CPT诱导的凋亡方面的重要性相对较低。

讨论

对hESCs和hiPSCs中细胞凋亡的详细机制的研究构成了密集研究的焦点，因为这些多能干细胞对再生医学具有希望，并且实际需要了解为什么这些细胞对外部线索如此敏感。事实上，hESCs和hiPSCs具有分化为三个胚层的所有细胞类型的潜力，扩大了这些兴趣，并为神经退行性疾病的疾病建模带来了新的前景。在这方面，研究人员目前面临的另一个挑战是高效生成可再生NP，以进一步分化为神经元，用于疾病发展和细胞替代疗法的研究。

在此，我们从H9人胚胎干细胞系中产生了NP，并将其行为与CPT引起的DNA损伤后的人胚胎干公司和hiPSCs的行为进行了比较。我们确定，在未分化细胞和经历神经分化拓扑异构酶I抑制的人胚胎干细胞中，ATM激活、p53核积累及其在丝氨酸15和46处的磷酸化，最终导致细胞凋亡。尽管如此，我们观察到了细胞凋亡动力学和程度的差异。在所有病例中，我们发现凋亡过程包括caspase-9和-3激活、PARP裂解和DNA断裂。

此外，我们发现尽管NP和HF表现出相似的S期种群(S1图)p21的可比表达水平Waf1型（在多能干细胞中检测不到）[26]与HF相比，NP对CPT引起的S期毒性表现出更高的敏感性。因此，尽管存在相似的细胞周期分布和p21Waf1型在协调由CPT触发的DNA复制与DSB修复的早期步骤中起着核心作用[41]，其他特定于细胞类型的机制可能会最终决定细胞在发育过程中的命运。

作为对死亡刺激的反应，一部分应激稳定的p53迅速转移到原始细胞、永生细胞和转化细胞中的线粒体[42]. 在线粒体，p53与Bcl-xL和Bcl-2相互作用，中和它们对促凋亡Bax和Bak的抑制作用。从这个意义上说，Hagn和同事提出p53通过促进Bcl-xL和BH3-only蛋白之间的相互作用，部分实现其在线粒体的功能，从而取代Bax/Bak，使其脱离抗凋亡的Bcl-2蛋白，从而促进线粒体外膜的通透性[36]. 在此，我们描述了p53/Bcl-xL和/或p53/Bcl-2与PFT-μ相互作用的废除导致受损多能干细胞活力显著增加，自发细胞死亡减少(图3c)进一步支持即使在“启动细胞类型”中，抗凋亡因子也会施加阈值来克服凋亡的概念。

尽管在多能干细胞中如何建立和维持高启动状态仍是一个悬而未决的问题，但一个潜在的机制可能是调节控制这些细胞类型中凋亡阈值的促凋亡和抗凋亡蛋白之间的平衡。为此，我们分析了hESCs、hiPSCs、NP和HF中存在的凋亡机制的某些成分的表达谱。我们发现多能干细胞和HF的抗凋亡Bcl-2水平低于经历神经分化的hESCs。此外，我们观察到，未分化和未成熟分化的后代表现出类似的其他凋亡调节因子的表达水平（mRNA水平），如bcl-w公司,bcl-xL公司,mcl-1型,彪马和bax（巴克斯）。我们还确定HF表现出较低水平的彪马mRNA和更高水平的blc-w公司比其他分析细胞系的转录本。因此，凋亡基因的这种表达谱是否影响HF对CPT或BH3模拟物耐药的机制仍然是一个悬而未决的问题。

由于该阈值的高度不是一个固定属性，而是反映促凋亡和抗凋亡信号之间的动态平衡，因此我们研究了在未分化和分化细胞中扰动该平衡的后果。为此，我们使用BH3蛋白模拟分子ABT-263、WEHI-539和ABT-199来研究：首先，BH3结合囊的增加是否足以启动细胞死亡反应，其次是由于这种占据而发生的关键事件，最终导致细胞死亡的发生。我们推断，根据促生存蛋白的表达谱，细胞类型对这些药物的敏感性可能会有很大差异。

直觉上，我们预计抗凋亡Bcl-2蛋白的丰富性将主要决定细胞对BH3模拟物的敏感性。与我们的预期一致，我们发现祖细胞对ABT-263的敏感性高于多能干细胞。值得注意的是，通过用ABT-263增强hESCs、hiPSCs和hESCs衍生NP的启动，我们观察到所有受试细胞类型都显著增加了它们对CPT的敏感性。

ABT-263与Bcl-2和Bcl-xL结合的亲和力很高，与Bcl-w的结合强度几乎是前者的300倍[22]. 因此，该药物的生物效应似乎主要取决于对Bcl-2、Bcl-xL或两者的抑制。此外，由于ABT-263没有与Mcl-1相互作用的能力[43]，受试细胞类型对该分子的敏感性表明，抗凋亡的Mcl-1可能不是保证其生存所必需的。为此，Crowther及其同事曾报道过单一能效NP细胞对Mcl-1活性的相对依赖性，他们描述了Mcl-1被条件性删除的小鼠存活下来时没有明显的神经功能缺陷[44].

为了进一步明确哪些抗凋亡因子主要负责维持DNA损伤的多能干细胞和祖细胞的存活或死亡，我们实施了抗Bcl-xL策略。我们发现，使用WEHI-539抑制Bcl-xL活性或使用siRNA减少Bcl-xL表达会降低多能性和NP活性，并显著提高细胞对CPT的敏感性。这些发现突出了hESCs、hiPSCs和NP对Bcl-xL生存的依赖性。

在进一步分析Bcl-2和Bcl-xL在多能干细胞和祖细胞命运决定中的作用时，我们使用了有效和选择性的Bcl-2抑制剂ABT-199或siRNA-介导的Bcl-2下调。我们确定Bcl-2抑制或下调不足以导致多能干细胞凋亡，因为它们对ABT-199治疗或siRNA介导的基因沉默几乎不敏感。此外，Bcl-2表达或活性的受损并不影响CPT在所有受试细胞类型中触发的细胞反应的程度。

已经证明，诱导人胚胎干细胞凋亡的高效性取决于多种机制，一方面，多种促凋亡蛋白的表达水平升高[45]和组分活性Bax被隔离在高尔基体中，迅速转移到线粒体，从而触发细胞死亡程序[46]. 另一方面，hESCs独特的简化细胞周期[47]DNA损伤或复制应激后，这些多能干细胞中缺乏功能性G1和S期检查点[48]. 此外，已知hESCs的线粒体是片段化的、形态上不成熟的，并且缺乏氧化磷酸化[49,50]. 在这方面，有人认为线粒体断裂的条件可以促进细胞凋亡[50]. 因此，这种独特的线粒体形态可能在某种程度上使人胚胎干细胞易于迅速凋亡。

最近，Crowther及其同事证明，初级神经前体细胞，如ESC，在线粒体中含有具有张力活性的Bax，有助于快速诱导细胞死亡，以应对多种促凋亡刺激[44]. 因此，如果hESCs衍生NP中也存在这种分子背景，这可能至少部分解释了与HF相比，NP对CPT的敏感性增加。

尽管多能干细胞存在于易凋亡状态，但其Bcl-2成员的特征表达谱可能构成防止不必要细胞丢失所必需的内在抗凋亡“刹车”。重要的是，这种“刹车”的优势和劣势可能是它们容易发生细胞死亡的另一个决定因素。

总的来说，在这项研究中，我们阐明了在细胞死亡信号后损害多能性和NP细胞中Bcl-xL和/或Bcl-2蛋白活性的后果。我们提供证据表明，与Bcl-2相反，Bcl-xL有助于确保细胞存活，似乎是CPT诱导的hESCs、hiPSCs和NP凋亡的主要抑制因子。为此，我们对应激信号和凋亡途径在多能干细胞和祖细胞中如何相互作用了解得越多，我们越能更好地预测细胞反应，并有可能将这些细胞类型用于治疗目的。

支持信息

S1图

非同步生长的H9 hESCs、FN 2.1 hiPSCs、NP和HF的细胞周期分布。

（TIF）

S2图

ABT-263治疗引发的形态学变化和siRNA介导的Bcl-xL下调。

（a） 显示生长在Matrigel上的hESCs和hiPSCs菌落的代表性图像™涂层表面，hESCs衍生NP生长在层粘连蛋白涂层基质上，HF经过或不经过1μM CPT处理3小时，0.1μM ABT-263处理15小时，或在CPT暴露（1+3小时）期间用0.1μM ABT-263预处理1小时。（b） 典型图片显示nt-siRNA或Bcl-xL siRNA转染的hESCs、hiPSCs、NP和HF经1μM CPT处理或不处理3小时（转染后48小时）。图中描述了拍摄图像的时间点。刻度条代表100μm（c）mRNA表达水平bcl-xL公司通过实时RT-PCR分析nt-siRNA和Bcl-xL siRNA转染HF的细胞。**P<0.001。

（畅通节能法）

致谢

这项工作得到了ANPCyT（PICT 2011-2017）和Fundación Perez Companc的资助。CPG和NAD是研究生研究员，LR和SGM是CONICET的研究成员。GAVR是国家癌症研究所的研究生研究员。

资金报表

这项工作得到了ANPCyT（PICT 2011-2017）和Fundación Perez Companc的资助。

数据可用性

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