融合还是不融合：你的目的是什么？

摘要

介绍

过去三十年来，基因组学、蛋白质组学和生物信息学的进展极大地增加了重组DNA的使用，将其作为研究各种应用中感兴趣的蛋白质的一种方法。结合亲和标记，重组DNA技术允许从一系列宿主系统中鉴定、修饰、生产、分离和纯化蛋白质，包括大肠杆菌酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞系。然而，重组蛋白的生产经常会遇到问题，包括包涵体的形成、错误的蛋白质构象、对宿主细胞的毒性或蛋白质产量低。这些问题通常通过改变表达宿主或通过将感兴趣的蛋白（POI）融合到载体蛋白（融合标签）来解决。融合标签位于感兴趣蛋白质的N或C末端，可以提高蛋白质的溶解度，实现天然蛋白质折叠，并通过改善表达和减少降解提高总产量。可以使用Fusion标签串联利用亲和标记和其他标记来提高检测，允许蛋白质分泌，并实现更高的总产量。

在过去几年中，有几篇关于亲和标签和融合标签的公开评论。¹,²虽然这些评论在描述当前可用的许多标签和标签删除系统方面做得很好，但很难确定哪些标签是特定应用的最佳候选标签。例如，据估计，20~40%的真核蛋白质不能在原核宿主中以可溶性形式表达。^三考虑到蛋白质结构的可变性，许多标签可能会有类似的问题。因此，这篇综述的重点是用于特定蛋白质应用的标签，包括蛋白质-蛋白质相互作用“下拉”分析、结构测定，例如X射线晶体学、蛋白质功能的控制和维护，以及大规模制造，我们希望能够深入了解这些应用程序中使用的突出标记。

蛋白质-蛋白质相互作用“下拉”分析

蛋白质不是孤立地工作，而是在复杂的网络中相互作用。在研究任何一种蛋白质时，在其复合体中分离其他蛋白质可以有多种用途，包括纯化一个或多个结合伙伴，或识别未知的结合伙伴。蛋白质复合物免疫沉淀（Co-IP）是一种技术，其中抗体与已知的靶蛋白结合，使该蛋白和与之结合的其他蛋白质沉淀或“下拉”出溶液并进行分析。

虽然这项技术有效，但它的一个问题是很难产生针对目标蛋白的特异性抗体。一种解决方案是将目标蛋白的DNA克隆到一个表达载体中，该表达载体在蛋白的两端都含有融合标签。根据标签的不同，亲和层析或抗体均可用于捕获复合物。亲和层析的使用大大加快了蛋白质分离和鉴定的过程，并允许重复使用相同的纯化过程。此外，该系统可用于增加目标蛋白的表达，使其超过内源性水平，从而可能使蛋白质复合物更彻底地下拉，并提供更多的特异结合蛋白。^4,5

在下拉测定中使用的最常见的融合标签是谷胱甘肽-S-转移酶（GST）。寄生蠕虫的26kDa蛋白质血吸虫GST与谷胱甘肽具有高亲和力。⁶当用作融合标签时，GST可以通过有效启动翻译来提高蛋白质产量。⁷GST被广泛应用于多种细胞类型，包括大肠杆菌,^8——10酵母，^11,12植物，^13,14昆虫，^15,16和哺乳动物细胞。^17,18为了纯化，GST蛋白融合物与固定在固体载体上的谷胱甘肽结合，如琼脂糖珠或磁性颗粒。融合构造通过添加10 m洗脱M（M）还原型谷胱甘肽。靶蛋白和相关蛋白可以通过标准方法（如SDS-PAGE或western blotting）进行分析。¹⁹GST被用作N端和C端标签，在许多商用系统中，GST和目标蛋白之间编码蛋白酶裂解位点，可以在纯化后去除GST。

基于GST的下拉分析可能出现的问题之一是结合蛋白的溶解度。特别是，高度疏水或大于100kDa的蛋白质在标记GST时，往往会形成不溶性聚集体和包涵体，使其失去活性。为了纠正这一点，净化过程中经常使用Triton X和CHAPS等清洁剂来提高融合络合物的溶解度。如果洗涤剂破坏了结合蛋白的生物活性，也可以使用高盐缓冲液来促进溶解。²⁰

GST的另一个问题是其二聚化倾向。天然GST以同二聚体的形式存在，当与也可以寡聚化的靶蛋白融合时，所得到的融合可以形成不易从结合的谷胱甘肽树脂中洗脱的大络合物。²¹防止二聚化的策略包括改变盐或pH值，或添加强还原剂，如二硫苏糖醇（DTT）。另一种策略是通过添加额外的游离谷胱甘肽来促进洗脱，或者通过将洗脱剂转换为S-丁基谷胱甘氨酸来促进洗提，S-丁基谷胱甘肽对GST的亲和力是谷胱甘苷的25倍。²²与上述不溶性情况一样，其中一些溶液可能会破坏标记蛋白质的功能，一些研究人员建议，GST不适用于已知低聚化蛋白质的下拉分析。^7,23

虽然GST是最常见的标记，但它并不是用于下拉分析的唯一标记。从技术上讲，任何可以与目标蛋白融合的亲和标记都会起作用，作为普遍使用最广泛的亲和标签，多组氨酸标记（通常为六组氨酸或His₆)也适用于下拉分析。虽然是他的₆标签不提供增加的表达或溶解度水平，它很小（0.84kDa），免疫原性不活跃，并且不二聚。像GST一样，他的₆标签可以附着在目标蛋白的N端或C端，大多数蛋白质都有标签的功能。他的净化₆-标记融合涉及固定化金属亲和层析（IMAC），因为带负电荷的组氨酸与带正电荷的金属离子结合，最常见的是镍²⁺.²⁴融合结构可以用咪唑梯度洗脱（逐步或线性）。²⁵咪唑洗脱的一个缺点是发现高浓度的咪唑可以去除多种蛋白质中的金属离子，使其失去活性，并可能改变其蛋白质相互作用的性质。²⁶超出GST和他的_6,许多附加标签用于下拉分析，包括Strep-tag，²⁷和碎片结晶（Fc）-融合，²⁸尽管总体数字要低得多。

结构研究标签

为了结构研究（如核磁共振波谱、X射线晶体学和冷冻电子显微镜）而产生高质量的蛋白质，对蛋白质的生产提出了严格的要求。这些方法需要高纯度的毫克蛋白质和生产技术，以最大限度地减少使用洗涤剂、共沸物和还原剂，从而改变蛋白质的最终结构或防止形成优质衍射晶体。虽然融合标签可以通过提高产量、加强折叠和简化纯化来克服其中一些挑战，但它们也可能造成新的障碍。通过柔性连接物连接的多域融合蛋白可能不太可能形成有序的衍射晶体，或者对于核磁共振研究来说太大。需要去除标记的策略带来了挑战，包括优化切割条件，增加去除标记的蛋白酶成本，以及去除标记后无法恢复可溶性或结构完整的蛋白质。然而，总的来说，使用融合标签生产用于结构研究的蛋白质的优点大于缺点，并且融合标签已被广泛采用作为用于结构研究的蛋白质生产的选择方法。结晶产生的蛋白质中超过75%是以融合结构表达的。²⁹

到目前为止，他的₆-tag是最常见的融合伙伴，用于60%的晶体研究。³⁰他的₆-tag的小尺寸通常不会干扰结晶，它在镍亲和色谱中的应用有助于在毫克级进行简单且经济高效的纯化。³¹伊斯₆-然而，标签确实有一些缺点，因为它们在大肠杆菌,³²这会导致不利于晶体形成的异质性。虽然是他的₆-标签在结构研究中很明显是有效的，结构基因组中心估计，当在大肠杆菌用His-tag，^33,34另外的研究表明，真核蛋白的这个数字更高。^35——37

许多大的融合标签，如麦芽糖结合蛋白（MBP），³⁸格林威治恒星时，³⁹硫氧还蛋白，⁴⁰和小泛素样修饰物（SUMO），⁴¹提高溶解度，并直接或结合小亲和标记简化纯化。因此，作为与这些标签融合的目标蛋白的表达通常被用作难表达蛋白的拯救策略（参见。⁴²). 在大多数情况下，通过在融合标签和感兴趣的蛋白质之间设计内蛋白酶裂解位点，标签在结晶之前被蛋白质水解去除。结晶试验所需的高度均一性要求在去除标记期间将非特异性或可变解理降至最低。通常用于标签去除的凝血酶、肠激酶（肠肽酶）和FactorXa，在历史上曾在不同于工程位点的位点显示出假切割。⁴³相比之下，病毒蛋白酶、烟草蚀刻病毒（TEV）或人鼻病毒3C蛋白酶的周转率较低，导致次优切割位点的催化事件较少，因此特异性更强。⁴³然而，较低的营业额要求大量蛋白酶用于去除标签，并增加了蛋白质生产成本，尤其是在毫克级。虽然仅限于去除SUMO标签，但SUMO蛋白酶具有高特异性和高效率。⁴⁴SUMO蛋白酶特异性地识别SUMO标签的三级结构，这种结构在蛋白质组的其他地方没有发现，而不是线性肽序列，并在标签的C末端精确裂解。此外，SUMO蛋白酶具有k个_猫～比TEV高25倍，使SUMO标签/SUMO蛋白酶系统成为结构工作的高效且经济的选择。⁴⁵

越来越多的案例被记录为使用完整的融合蛋白进行结晶（在Smyth中进行了回顾^三和月亮⁴⁶). 成功的晶体被描述为与MBP融合，^47——49格林威治恒星时，^50——53硫氧还蛋白，^54,55溶菌酶，^56——58和SUMO。⁵⁹保留融合标签在所谓的“载体驱动”结晶中具有许多优势，^60——62特别是，当感兴趣的蛋白质小到足以占据晶格中相邻标记分子之间的可用空间时。MBP的高分辨率结构，^63——65格林威治恒星时，⁶⁶TRX中，^67,68和SUMO^69,70已确定。标签提供有利于晶体晶格形成的表面，并且通过延伸，标签结晶的条件可以转化为融合蛋白成功结晶的条件。此外，标签的结构可以作为搜索模型，通过分子替换方法解决晶体学相问题。在去除或不去除标记的情况下测定的蛋白质结构示例如所示图1.

在单独的窗口中打开

图1

在大肠杆菌中表达为SUMO融合体的两种蛋白质的结构。面板A显示了肽基-脯氨酸反式异构酶的结构伯克霍尔德（Burkholderiapsuedomallei）与8-二乙基-8-[丁烯基]-抗坏血霉素结合（固体表面）。蛋白质结晶，结构确定为1.9º分辨率，仍附着（标记）SUMO。（PDB ID 3UQB、Fox III、Abendroth、Stager和Stewart，西雅图结构基因组感染病中心，2011年11月存放）。面板B显示了人Ub E3连接酶Parkin的结构。SUMO在结晶之前被酶去除。在2.0º分辨率下测定结构（PDB ID 4I1H，Riley等.⁴²).

GST具有许多特性，使其成为载体驱动结晶的良好候选材料。³⁹GST的亲水表面可以提高感兴趣蛋白质的溶解度，GST融合物可以通过谷胱甘肽树脂容易地纯化，最后，重组GST的结构已知。⁶⁶小肽和蛋白质调节结构域的几种结构已被确定为GST融合，⁶⁰C末端纤维蛋白原γ链，⁵³α-Na/K ATP酶的咽部结合域，⁵²急性髓细胞白血病-1核基质靶向序列[氨基甲基-卵磷脂（AML）-1 NMTS]，⁵¹和DNA复制相关元件结合因子。⁵⁰另一组蛋白质已经结晶，但尚未报道其结构，可能是因为融合片段发生了紊乱。载体驱动的GST的成功似乎仅限于少于100个氨基酸的蛋白质片段。⁶²GST的使用带来了额外的缺点，因为它不能在所有情况下提高溶解性⁷¹形成二聚体，^72,73这可能导致某些目标的聚合。

MBP也已成功用于载体驱动结晶。^三,46与GST一样，MBP使其融合伴侣的溶解度增加⁷¹并对其晶体结构进行了求解。^63——65此外，MBP的C末端形成一个溶剂可及的α-螺旋，为连接感兴趣的蛋白质提供刚性支撑。^三尽管MBP提供了一种通过直链淀粉亲和层析进行亲和纯化的策略，但MBP融合蛋白在实践中往往无法与直链淀粉树脂结合。^31,74,75此外，MBP在有无结合麦芽糖的情况下采用不同的构象，^63——65因此，麦芽糖的部分占有会导致最终产品的异质性，这可能不利于晶体的形成。在某些净化方案和结晶试验中，可能需要添加过量的麦芽糖。为了避免这些问题，MBP经常与His一起使用₆-用于净化的标签。迄今为止，MBP已显示出作为蛋白质结构测定的载体蛋白的最高成功率，其中超过25个结构被确定为MBP融合。⁴⁶在融合标签和感兴趣的蛋白质之间设计一个短的刚性连接物对载体驱动结晶的成功至关重要。应该尝试各种连接子和目标蛋白的N末端截断。连接子过长会导致过度的灵活性，而连接子过短可能会影响目标蛋白质结构。

其他标签已被纳入成功的晶体中，包括硫氧还蛋白、，^54,55溶菌酶，^56,58和SUMO，⁷⁶但程度低于MBP或GST。与MBP一样，硫氧还蛋白的C末端是一个刚性的、溶剂可及的α-螺旋。⁵⁵硫氧还蛋白的许多极性表面可以形成晶体接触，硫氧还毒素很容易结晶。尽管有这些特征，但只有两个晶体和一个溶解结构被报道使用硫氧还蛋白作为融合伙伴。^54,55溶菌酶不是传统的溶解度或亲和力标记，而是用来取代β2-肾上腺素能G蛋白偶联受体中的非结构环。^56,58溶菌酶提供了一个增加的极性表面，有利于晶格的形成。SUMO融合的多个结构已放置在NCBI结构数据库中。SUMO融合标签为载体驱动结晶提供了一个有趣的选择。如上所述，SUMO提高了多种靶点的收率和溶解度^{44,45,77——81}其结构已解决到高分辨率。^69,70最重要的是，SUMO星形系统易于在真核宿主中表达，从而可以生产用于结构研究的蛋白质，这些蛋白质需要在真核寄主中表达才能产生适当的折叠或所需的真核翻译后修饰。^41,78,82

功能活动标签

许多研究都需要产生具有功能活性的蛋白质，但当所讨论的蛋白质具有潜在的治疗作用时，这一点尤为重要。构象特征，包括适当的折叠和溶解度，是功能活性蛋白质的重要组成部分，而这些可以通过融合标签的存在而得到改善。⁸³然而，天然N末端的产生对功能活性也至关重要，特别是在细胞因子、小肽和细胞毒蛋白中，这给标签的使用带来了额外的挑战。

细胞因子，包括白细胞介素（如IL-6、IL-8）、干扰素（如hIFN-γ）、集落刺激因子（g-CSF、M-CSF和GM-CSF）以及造血因子（如促红细胞生成素和促血栓素），因其免疫调节作用和治疗潜力而备受关注。一系列标签被用于表达细胞因子，成功率各不相同。GST和硫氧还蛋白在溶解这些类型的蛋白质方面表现不一致。^1,84——86MBP和NusA被发现具有提高溶解度的特性，并可能由于其大小而增加目标蛋白的表达水平。^84,87事实上，NusA已被用于成功表达和纯化具有IL8-like折叠的细胞因子同源物。⁸⁵去除这些标签需要在加工蛋白的N末端留下额外氨基酸残基的内蛋白酶，^1,85这可能会影响蛋白质的结构和/或功能。⁸⁸SUMO是一个取得了持续成功的标签。SUMO蛋白酶的构象特异性活性确保了在目标蛋白的N末端精确发生裂解，并且已证明SUMO可产生一系列功能活性细胞因子。使用SUMO高水平表达IL-1β和IL-8，两者都具有生物活性。^88,89最近，尽管IFN-γ以前是以包涵体的形式表达的，但在SUMO表达和纯化后，IFN-γ以功能活性形式生成。⁹⁰TNF-α也是一种成熟的活性产品，用于药物开发分析。⁹¹最后，趋化因子的活性可以通过N末端的截断或延伸而显著改变（参见示例^92,93). 在一项广泛的研究中，卢等使用SUMO标签以活性形式表达和纯化15种趋化因子。⁹⁴在他们的系统中，SUMO融合对溶解度没有帮助，但对于生产具有真正N末端的蛋白质至关重要。他们使用了两种标准₆-SUMO-tag，在主题上的一个有趣变化中，他们使用了串联融合；伊斯₆-硫氧还蛋白-SUMO，在没有氧化还原缓冲液的情况下促进趋化因子的复性。

抗菌肽在生理学中的作用以及作为治疗药物的潜力已被研究。感兴趣的主要肽家族防御素和组氨酸合成为前体蛋白，经蛋白质水解裂解产生成熟肽。^95,96这些前体保护宿主细胞免受成熟肽的细胞毒性作用，^97,98融合标签用于模拟这些前体，防止细胞毒性，并成功生成功能肽。

与细胞因子的表达工作类似，用于生产抗菌肽的标签也遇到了不同的结果（参见李克强的评论⁹⁹). GST的表现再次不一致，因为在许多情况下，标签未能防止前体肽的蛋白水解裂解。^100——102这可能是由于GST（28kDa）的大小较大，尤其是与小抗菌肽有关。MBP已用于生产人β-防御素25（hBD25）和人β-防卫素28（hBD28），但两者都需要复性步骤才能从纯化中的聚集体中恢复融合蛋白。^98,103

其他标签在表达抗菌肽方面更为成功。硫氧还蛋白被用来在细胞质中获得高产的前体肽，可能是因为它的尺寸较小（11.8kDa；40）。SUMO体积较小（11.2kDa），也已成功用于产生防御素和cathelicidins。在生产人β-防御素-4的过程中，纯化后获得166 mg/L发酵液。¹⁰⁴LL-37被认为是在人类中发现的唯一一种由cathelicidin衍生的抗菌肽，¹⁰⁵与硫氧还蛋白结合产生双标记表达。^104,106SUMO产生的其他功能活性蛋白包括抗菌肽CM4（ABP-CM4），¹⁰⁷从蜘蛛毒液中分离的PnTx3–4毒素，¹⁰⁸以及从蝎毒中纯化的抗肿瘤镇痛肽。^108,109

自我分裂亲和力标签

自剪接标签（内含子）在重组蛋白纯化中的应用于1997年首次被描述^110,111由一个在新英格兰生物实验室工作的小组发起。他们的工作产生了NEB的IMPACT（具有亲和性几丁质结合标签的内联蛋白介导纯化）系统，该系统仍然是最常用的内联肽纯化方法。该技术围绕酵母衍生的蛋白质剪接元件与细菌几丁质结合亲和纯化标签的结合使用。表达的蛋白质被捕获在几丁质柱上，洗去宿主衍生的蛋白质，然后通过诱导内含子裂解释放。从机械上讲，内含子在其N端半胱氨酸残基处自发发生S-N酰基转移，与感兴趣的蛋白质形成硫酯键。然后，该硫酯容易被一些小分子（例如2-巯基乙醇、2-巯基乙磺酸或DTT）裂解。感兴趣的蛋白质以小分子的硫酯形式释放，根据预期用途，可用于进行C端修饰或简单水解以生成C端羧酸盐。虽然这项技术对来自小型抗菌毒素的大量蛋白质效果良好^112——114抗体片段^115,116合成人胆碱乙酰转移酶¹¹⁷它还没有成为一种广泛用于普通蛋白质纯化的方法。相反，它被广泛用于生成蛋白质，随后可通过裂解期间生成的硫酯用于C末端修饰。这包括表达蛋白连接或天然化学连接。在该技术中，通过将含有N端半胱氨酸残基的C端肽与带有C端硫代酯的N端肽连接在一起，将两个不同的肽段连接在一起。半胱氨酸的巯基对硫酯的攻击导致两种肽之间的硫酯连接。与内肽反应相反，硫酯经历N到S的迁移，生成标准酰胺键。当两个伴侣中的一个是人工合成而非生物合成时，这种方法经常用于将非天然氨基酸引入蛋白质。一个有趣的用途是连接两个肽，其中一个表达为重同位素标记蛋白(¹³C和¹⁵N） 以产生两个蛋白质结构域的更精细的NMR结构，该结构域确定了两个先前被认为独立行为的蛋白质之间的扩展相互作用界面。¹¹⁸在该方法的另一个迭代中，硫代酯用于在感兴趣的蛋白质的C末端引入小分子，例如荧光团，以生成酶底物。例如，围绕泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的C末端修饰，作为泛素脱共轭酶（氘基化酶、去氨酰化酶、脱NEDDylases等）的底物/抑制剂，一个小型家庭手工业已经发展起来。其中包括抑制剂，如Ub-醛¹¹⁹和Ub-乙烯基砜¹²⁰在其他中^121——123和底物，如Ub-酰胺甲基香豆素（AMC），¹²⁴Ub-罗丹明110，¹²⁵和Ub-AML。¹²⁶

内部技术有两个主要缺点。首先，几丁质琼脂糖的结合能力很低。通常，几丁质琼脂糖的容量为每毫升基质1-2毫克重组蛋白⁺²-IMAC或IEX-sepharose柱，树脂容量为40–80 mg/mL。因此，必须使用相对较大的色谱柱以确保完全捕获表达的蛋白质。虽然这通常不是实验室规模的主要关注点，但它降低了这种方法在制造规模上的可取性。其次，裂解反应非常缓慢。柱上解理通常在室温下进行16小时¹¹⁰或在4°C下最多5天。^114,127长时间的孵育和高温可通过污染蛋白酶或增加蛋白质变性的风险，导致非特异性蛋白质水解增加。最后，使用高水平还原剂（30至100 mM（M）)可能不利于二硫键连接蛋白的恢复，从而导致后续需要重新折叠。

为了克服这些缺点，普林斯顿的伍德实验室一直在积极改进这项技术。他们的主要关注点是用其他类型的纯化实体取代甲壳素结合域，以避免甲壳素琼脂糖的低容量，并用机械初级分离方法取代柱层析（见Banki和Wood的评论¹²⁸). 简言之，这些新方法要么需要一个沉淀步骤，由粘附在内含物上的弹性蛋白样多肽标签的可控聚集介导^129——132或在特殊工程菌产生的聚羟基丁酸纳米颗粒上吸附相蛋白标记的内含子大肠杆菌.^133——136这些方法都没有在创作者的实验室外进行过广泛的尝试。在另一项旨在提高互联网技术净化能力的尝试中，Wang等.¹³⁷添加了一个他的₆-Ub-tag或His₆-内含子N末端的SUMO-tag与C末端靶蛋白。然后他们可以使用Ni⁺²-IMAC进行纯化，然后诱导内含子裂解以释放感兴趣的蛋白质，而不使用蛋白酶。作为额外的奖励，与单独的整合素相比，SUMO-和Ub标签提高了表达水平。

这些方法都没有解决卵裂率慢的问题。为了解决这个问题，许多小组已经从内含子转移到使用蛋白酶本身作为融合标签的一部分。这些包括他的₆-标记的半胱氨酸蛋白酶结构域霍乱弧菌¹³⁸和他的₆-标记的催化排序酶域来自金黄色葡萄球菌.¹³⁹在这两种情况下，通过添加小分子六磷酸肌醇或钙在柱上启动酶切⁺²分别是。同样，这些方法在发起者实验室之外没有得到广泛接受。也许这些方法中最成熟的是布莱恩团队开发的方法¹⁴⁰并由BioRad销售。作为Profinity系统。在这种情况下，亲和标签是细菌枯草杆菌蛋白酶的前体。枯草杆菌素的工程形式与该前体蛋白具有高亲和力，并与琼脂糖偶联以进行亲和力纯化。与上述两个蛋白酶标签一样，卵裂是由一个小分子启动的，在本例中是氟化物。虽然效力较低，但酶可以被其他卤素离子激活，限制了其在缓冲液中的使用。这种自切割系统的另一个缺点是需要对突变枯草杆菌素进行单独表达、纯化和接合，这可能会使该系统的大规模成本过高。在其他两个基于蛋白酶的系统中，酶被表达为融合蛋白的一部分，以确保始终存在足够的蛋白酶。

大规模制造

大规模的蛋白质生产通常与小规模的研究生产截然不同。虽然用于研发的蛋白质生产通常需要几升或更少的培养物才能获得所需数量的纯化产品，但商业生产通常需要能够容纳数千升的生物反应器。高质量和低成本生物处理的挑战意味着亲和和融合标签不常用，部分原因是与标签去除和后续大规模纯化步骤相关的额外时间和成本。因此，当使用标签系统时，它必须在生产中或对治疗本身表现出明显的优势。

Fc-融合蛋白是大规模制造中使用的融合标签的最著名例子。1989年作为潜在的艾滋病治疗药物首次创建，¹⁴¹几种市售药物是基于Fc-fusion的。这些药物包括用于器官排斥反应的贝拉他西普和阿莱法西普，用于类风湿性关节炎的阿巴曲西普和依那西普，以及用于黄斑变性的纤维西普等。¹⁴²Fc融合蛋白由一种与免疫球蛋白的Fc结构域相连的感兴趣蛋白质组成，该结构域是距离抗原结合位点最远的重链段。在约250个氨基酸的大小上，Fc结构域可以连接到感兴趣的蛋白质的任一末端。目前，所有商业治疗药物都使用人类IgG1的Fc结构域，尽管其他选项，如IgG3、IgA和IgM目前正在探索中。¹⁴³

作为亲和标记，Fc结构域与蛋白质A（一种最初从金黄色葡萄球菌其通常与固定相树脂结合。洗脱可以通过pH梯度或商用洗涤剂完成，高亲和力和简单洗脱的结合使Fc系统在足够大的规模上具有成本效益，适合制造。这种净化过程只是一种辅助效益；将Fc结构域添加到治疗性化合物中可提供具有多种有益药理特性的融合。最显著的是，Fc结构域的添加增加了治疗药物的血清半衰期，增加了其活性。这是通过Fc结构域与新生儿Fc受体（FcRn）结合实现的，Fc受体通过阻止溶酶体降解在蛋白质再循环中发挥作用。^144——146Fc结构域还可以与免疫系统中某些细胞（如B淋巴细胞和自然杀伤细胞）上的Fc受体相互作用，这种能力对某些类型的肿瘤治疗很重要。^147,148最后，由于Fc域的折叠独立于其融合伙伴，因此添加Fc域可以提高整体融合的溶解度。¹⁴⁹

由于Fc结构域本质上是最终治疗的功能部分，因此不需要切割步骤。为了考虑将经过标签去除的融合系统用于大规模蛋白表达，必须提供额外的好处来抵消额外的纯化成本。其中一个系统是SUMO。如前所述，SUMO可以提高其融合伙伴的产量和溶解度，标签的切割是由一种特定的SUMO蛋白酶进行的，该蛋白酶不会留下额外的氨基酸来破坏治疗功能。当与His组合时₆或者SUMO标签和蛋白酶上的其他亲和标签，可以使用基于IMAC色谱的简单纯化方案，当前的SUMO标记可以用于多种表达系统，包括大肠杆菌,毕赤酵母和哺乳动物细胞，如HEK和CHO。⁴⁵最近的例子包括生产抗病毒蛋白氰卵磷脂-N（CVN），这是一种具有抗HIV作用的杀微生物剂。CVN与His的表达₆-SUMO标签导致可溶性蛋白质水平大肠杆菌使用30L生物反应器处理30%以上的总可溶性蛋白质。¹⁵⁰此外，在DARPA赞助的一项测试中，SUMO被用于生产炭疽和猪流感的亚单位抗原，该测试要求快速抗原生产和每剂量成本阈值。在30 L规模下，最大产品产量为14 g/L，每剂量的成本完全符合要求。

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