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美国国家科学院院刊。2008年2月19日；105(7): 2538–2543.
2008年2月11日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0707730105
预防性维修识别码：PMC2268172型
PMID：18268355

中的突变FN1型导致肾小球疾病伴纤维连接蛋白沉积

费德里卡·卡斯特莱蒂,* 罗伯塔·多纳代利,* 费德里卡·班特拉,* 弗里德海姆·希尔德布兰特,† 彼得·齐菲尔,‡ 埃琳娜·布雷辛,* 埃德加·奥托,† 克里斯汀·斯凯尔卡,‡ 亚历山德拉·雷涅利,§ 玛尔塔·托德斯奇尼,* 杰西卡·卡普里奥利,* 罗莎·玛丽亚·卡鲁索, 罗桑格拉·阿图索,§ 朱塞佩·雷穆齐,*‖和玛丽娜·诺里斯*
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

伴有纤维连接蛋白（FN）沉积的肾小球疾病（GFND）是一种具有年龄相关性外显率的常染色体显性疾病，其特征是蛋白尿、显微镜下血尿、高血压和导致终末期肾衰竭的大量FN沉积。GFND的遗传异常尚不清楚。我们假设FN1型编码FN，是GFND的原因。在一个有8名受影响受试者的大型意大利家系中，我们发现GFND与FN1型2q32位点。我们对FN1型在15个不相关的家系中发现了三个杂合错义突变，即W1925R、L1974R和Y973C，这些突变在6个家系中与该疾病共分离。突变影响了FN的两个域（W1925R和L1974R的Hep-II域，Y973C的Hep-III域），这两个域在FN-细胞相互作用和FN纤维生成中起着关键作用。表达了突变重组Hep-II片段，功能研究表明，与野生型Hep-II相比，与肝素、内皮细胞和足细胞的结合更低，诱导内皮细胞扩散和细胞骨架重组的能力受损。总显性突变FN1型占我们研究组GFND病例的40%。这些发现可能有助于了解GFND中蛋白尿和肾小球FN沉积的发病机制，可能还有助于了解糖尿病肾病、IgA肾病和狼疮肾炎等更常见的肾脏疾病的发病机制。据我们所知，没有FN1型此前曾报道过导致人类疾病的突变。

关键词：遗传学、蛋白尿、细胞外基质、肾脏、足细胞

伴有纤维连接蛋白（FN）沉积的肾小球疾病（GFND）是一种遗传性肾病（MIM 601894），伴有蛋白尿、镜下血尿和高血压，可导致第二至第六个十岁的终末期肾衰竭（ESRF）。斯特罗姆认为这种疾病是一种独特的疾病等。(1). 光镜显示肾小球增大，系膜和内皮下间隙有沉积物，免疫球蛋白或补体因子免疫反应较弱(1). 本病最显著的发现是肾小球沉积物对FN具有较强的免疫反应性(1)，一种粘附的高分子量二聚糖蛋白，是细胞外基质的一部分(2).

疾病在家庭中的聚集(1,三)表明GFND的遗传起源，分离与年龄相关外显率的常染色体显性遗传模式一致。然而，GFND背后的基因异常仍然未知(三–5). 通过对一个大家系的全基因组连锁分析，GFND的基因位点被定位在1q32上，间隔为4.1-cM，其中包含一组参与补体激活调节（RCA）的基因(6). 然而，突变分析和功能研究没有发现任何异常(7).

在这里，我们研究了GFND的遗传基础。连锁分析结果排除了1q32位点，并显示2q34上包含FN1型编码FN的基因，作为之前未描述的疾病位点。通过序列分析，我们发现了杂合子FN1型在15个无血缘关系的家系中，有6个家系中与该疾病共分离的突变。我们研究了遗传缺陷在GFND蛋白尿和FN肾小球沉积发病机制中的分子意义。

结果和讨论

F233家系研究。

临床描述。

这是一个有部分描述的意大利家庭(1)并在本文件中进行了更新。总的来说，这一谱系中有8名受试者[其中3名之前描述过(1)根据以下描述的标准，本文中新报道的5例患者受到该疾病的影响方法其中5人进行了肾活检，显示肾小球增大，系膜和内皮下间隙广泛沉积，FN染色非常强烈。FN主要通过检测血浆和细胞衍生FN的抗体染色，较少通过仅针对细胞FN的特异性抗体染色(8)表明积聚在肾小球中的FN主要来源于血浆(9). 通过电子显微镜，沉积物主要是颗粒状的(1,8).

受影响受试者的临床病程如所示表1。该指数病例，受试者717，是一名14岁男孩，于2005年因肾病范围蛋白尿（每天7.46克）、低血清白蛋白和严重高血压被转诊至Ospedali Riuniti di Bergamo肾脏科。他接受了针对尿蛋白排泄进行滴定的多药治疗支持信息（SI）文本]2年后，尿蛋白排泄量约为基线值的三分之一，血压完全正常，肾功能稳定正常(表1).

表1。

F233家系GFND患者的临床数据

患者性别/年龄*首次观察时的数据
改善效果追踪
上次观测数据
年龄，年蛋白尿，g/24小时美国创造。，毫克/分升Hypert公司/微小时。N范围蛋白尿年龄高血压年龄/微小时。ESRF年龄TR年龄年龄，年蛋白尿g/24小时美国创造。，毫克/分升Hypert公司/微小时。
725‡59肾病范围正常+/?5959/?74—73†2.5†4†+/?†
传真：77
71944300毫克/分升1.4−/?4646/46——541.061.55−/+
55年5月
死亡‡40?2.2+/?—40/?——————
M（M）
72035肾病范围1.5+/?3535/———461.422.52+/−
M/48号
716‡184.161.4−/−1819/—3237410.21.22−/−
M/42号
721270.740.8−/+——/27——404.771−/+
40年月日（正常）
723‡16?正常−/?2430/?343535?1.5?
M/39号
717‡127.460.7+/+1212/12——14§2.31§0.7§−/+§
2014年5月（正常）

肾病范围（N范围）蛋白尿：>3.5 g/24h，S.creat，血清肌酐；正常值，0.6–1.3 mg/dl；因蛛网膜下腔动脉瘤破裂死亡，享年47岁，不适用。

*目前的年龄。

†ESRF之前的数据。

‡活检诊断。

§多药肾保护治疗2年后记录的数值。

肾移植后测量。

其他三名受影响的受试者（716、723和725）出现了ESRF，其中两名（716和723）接受了肾移植。移植三年后，716名受试者的同种异体移植物活检显示移植后疾病复发(表1). 723名受试者的移植物在1年随访中功能良好。

GFND基因座的鉴定。

我们使用10个跨22Mb的多态性微卫星DNA标记，沿着1q32位点的RCA簇对F233家系进行单倍型分析(6)（参见SI文本和SI图4).

17名受试者为单倍型。该家族GFND的分离符合常染色体显性遗传和年龄相关外显率。由于该病具有渐进性表现，在第三代的四名健康受试者（均<35岁）中无法确定是否存在该病。数据首先根据“仅受影响”策略进行评估。通过GENEHUNTER软件对与GFND共分离的单倍型进行连锁分析后，没有一个单倍型在整个染色体区域的多点优势对数（lod）得分小于-2。在进一步分析中，根据检查时的年龄分配责任等级，如方法.两点和多点连锁分析结果证实，在该家系中排除了1q32为疾病位点(SI图4).

我们进一步对包含编码补体系统其他蛋白质的基因的位点进行了单倍型分析，即补体因子D(计算流体力学)和补充C3类（19p13）和CD59型（11p13），两个区域均为阴性结果（未显示数据）。

然后我们查看了候选基因的位置FN1型在第二季度34，因为FN1型编码FN，是GFND肾小球沉积的主要成分。18名受试者（包括从尸检材料中获得DNA的已故受试者）在标记D2S2167和D2S2297之间37 Mb的间隔内进行了单倍型分析(图1一). 所有受GFND影响的受试者都具有相同的单倍型，除第三代受试者733外，没有任何未受影响受试者继承了该等位基因，该受试者在分析时未受影响，但由于年龄较小（24岁），仍有风险。值得注意的是，受试者733的蛋白尿轻度恶化（从2006年的0.18克/24小时恶化到2007年的0.30克/24 h），但肾功能正常。在标记之间发现重组事件D2S2387型和D2S2289型在第二代和标记之间第2359页和297年2月2日第三代(图1一). 在仅受影响的模型中，关联分析给出了最大多点lod得分1.8。责任类别的两点联动分析（参见方法)导致Z轴最大值标记=3.084（θ=0）D2S128型和D2S2361型，非常接近SLink模拟获得的最大值(SI表2). 一致地，使用八个微卫星标记进行的多点连锁分析给出了一个Z轴最大值同一标记上3.084的平台(图1一).

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FN1型GFND突变。(一) (上部)单倍型分析FN1型F233家系基因座。微卫星位点位于左侧。(下部)GENEHUNTER的多点连锁分析（模型：具有年龄相关外显率的常染色体显性传播，责任类别分析）。对于标记D1S128型和D1S2361型，最大lod得分为Z轴最大值=3.084，如图所示。*，之前发表的主题。，生物免疫性GFND。实体符号、受影响的个人；交叉符号，已故；先证者紫罗兰箭头：整体FN1型测序；红点，FN1型突变携带者。¶，受试者筛选FN1型突变和SNP分离；un，不可用。(b条)纤维连接蛋白示意图。纤维结合蛋白单体由I型（蓝色）、II型（绿色）和III型（橙色）重复序列以及交替剪接位点EDI、EDII和IIICS组成。显示了三个主要的肝素结合域和整合素的结合位点。GFND相关突变的位置用箭头表示。(c上部)其他五个家族的家谱FN1型突变。(下部)报告了受影响的受试者人数、突变情况以及所有六个突变家族的起源。

FN1突变的鉴定。

我们对FN1型(NC_ 000002，吉：51511462）。用于测序的引物列表见SI表3.

杂合子5773T>外显子36中的错义突变，导致III中的色氨酸-精氨酸替代（W1925R）13重复(图1 b条和c（c）)在所有受影响者和733名受试者中发现(图1一)在该谱系的其他9名受试者或100名健康受试者中均未发现。

然后我们进行了筛选FN1型在另外14个GFND家系中FN1型如下文所述，在其中5例中发现了突变。

F656家系的研究。

这家人来自新西兰，有六名受感染者，父亲和七个兄弟姐妹中的五个。4例活检证实FN沉积。受影响的儿童分别在14、16、26、43和47岁的大范围内出现蛋白尿。三名患者分别在33岁、34岁和35岁时出现ESRF，并接受了成功的肾移植（两例）或血液透析。的排序FN1型在受感染者的第37外显子中发现了杂合错义突变（5921T>G），导致重复序列III中L1974R发生改变13(图1 b条和c（c）). 该突变与受感染状态分离，在母亲、两名健康兄弟姐妹和180名健康对照个体中未发现。

F468家系研究。

这是一个以前描述过的意大利家庭(1,8)三名受试者。先证者是一名53岁的女性，25岁时出现肾病范围的蛋白尿。目前，蛋白尿仍在肾病范围内，肾功能中度下降。她的女儿14岁时出现肾病范围蛋白尿(1,8). 目前，25岁时，肾功能正常。在这两名受影响的受试者中，活检证实了GFND的诊断，电子显微镜检查显示主要是内皮下间隙和系膜中的颗粒沉积物，很少有纤维。先证者的一位姑父死于肾病，享年37岁。先证者的父亲死于癌症，享年30岁。

杂合2918A>G突变导致重复序列III中的Y973C改变4在索引病例和受影响的女儿身上发现，但在未受影响的父亲身上没有发现(图1 b条和c（c）和SI图5)或在230名健康的白人对照组中的任何一名。

F546谱系的研究。

这家人来自荷兰，包括两名受影响的受试者(10). 该指数病例是一名29岁时出现轻度蛋白尿的男性。38岁时，蛋白尿处于肾病范围，肾活检显示GFND。他的第一个孩子在21岁时检测到蛋白尿（每24小时2.8克）。肾活检显示肾小球病变类似于他父亲的肾小球病变，系膜区有大量沉积物，内皮下也有少量沉积物(10)这显示出一种细颗粒图案，与含有更规则排列的纤维的区域交替。免疫荧光显示血浆FN染色强(10). 上次更新时，另一个21岁的儿子身体健康。

在索引病例和两个儿子中发现杂合2918A>G突变(图1 b条和c（c）、和SI图5). 由于GFND的年龄相关性外显率，未受影响的儿子可能仍处于风险之中。

F663家系研究。

在一个有四个受累兄弟姐妹的德国家系中，两例活检证实了GFND的诊断。所有4例患者均出现蛋白尿。一名患者（18岁时出现蛋白尿）在33岁时出现ESRF。在年龄最大的患者（42岁）中，血清肌酐水平在2–3 mg/dl范围内。

在所有四个受影响的兄弟姐妹中都发现了杂合2918A>G突变，但在未受影响的母亲中没有发现(图1 b条和c（c）和SI图5). 父亲的DNA不可用（死亡，原因不明），因此我们无法确定突变的起源。

F1098家系研究。

这家人来自日本(11). 该指示病例是一名3岁时出现严重蛋白尿和镜下血尿的男孩。肾活检显示肾小球增大，肾小球内颗粒物质沉积，抗FN抗体染色明亮(11). 有轻微血尿和/或蛋白尿但无肾病综合征或肾功能不全的12名成员的肾脏疾病家族史显著。没有亲属接受过肾活检(11). 据推测，该指数病例与该谱系中的任何人都有不同的疾病，可分离出轻度肾病(11).

在索引病例中发现杂合2918A>G突变，但在该家族的9名受试者中没有发现。具体来说，在父亲的两个单倍型中，母亲或其他三个兄弟姐妹中都没有发现突变（父亲的DNA不可用），这表明发生了突变从头开始先证者(图1 b条和c（c）和SI图5).

值得注意的是，Y973C的变化存在于四个不同种族背景的家系中（意大利、荷兰、德国和日本；图1 b条和c（c）). 四个家系的单倍型分析表明，没有单倍型共享，因此不太可能有共同的起源(SI图5).

总的来说，我们研究了15个不同的家族，包括大多数已发表的(1,8,10,11)以及其他未公开的家谱，其中6个（40%）携带FN1型突变。所有受影响的受试者都携带突变，分离符合常染色体显性遗传(图1c（c）). 在携带FN1型突变，我们还发现了几个SNP，其中9个编码SNP和两个先前未描述的内含子SNP在SI表2非同义SNP家族成员的测序表明，rs17449032与GFND不分离，而rs1250259在F468和F546家族中分离(SI表4)但不在F233家族中(SI图6).

多个物种之间的部分蛋白质序列比对表明，残基W1925、L1974和Y973高度保守(SI图7). 这些发现提供了证据表明FN1型负责GFND。

GFND相关FN1突变的功能研究。

纤维连接蛋白以二聚体形式分泌，在细胞与基质的接触过程中发挥作用，如细胞附着和扩散、细胞迁移、细胞骨架控制、形态和分化(9,12,13). 它还参与细胞外基质的形成、止血和血栓形成(12). 所有这些生物活性都意味着FN通过整合素、肝素和硫酸肝素蛋白聚糖的结合位点与细胞和细胞外物质相互作用。

每个FN单体由分类为I、II或III型重复序列的同源模块组成(图1b条). C端子III12–14重复序列（Hep-II）包含肝素的主要结合位点(14,15)和III13约占Hep-II活性的98%。它包括一个带有六个带正电残基的“阳离子摇篮”和一个由P1908、W1925、F1936、L1964和Y1970组成的疏水核心(15,16). W1925R突变在Hep-II疏水核中引入了一种基本氨基酸。类似地，L1974R突变引入了一种非常接近Hep II疏水核心的碱性氨基酸(图2一). 理论上，这两个突变可以通过向结构域提供额外的阳离子电荷来增加Hep II对肝素的亲和力；然而，它们也可能改变域的折叠并损害其功能。

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纤维连接蛋白重组野生型和突变型Hep-II结构域的表达。(一)FN III的结构13氨基酸残基用颜色标记为带正电（红色）、疏水核（绿色）和残基W1925和L1974（黄色）。(b条和c（c）)用SDS/PAGE在12%凝胶上分析WT和突变纯化的重组蛋白，并用抗His抗体（C-term）进行Western blotting观察(b条)或针对Hep-II结构域的抗纤维结合蛋白单克隆抗体。(c（c）)显示了标准的位置（kDa）。装载等量（各5μg）的WT和突变蛋白。单独的车道用考马斯蓝标记，作为装载的对照。未经改造。

为了研究W1925R和L1974R突变对Hep-II与肝素和细胞结合的功能影响，我们生成了III12–14重量，III类12–14W1925R型、和III12–14L1974R型多标记重组片段并在Sf9细胞中表达。重组野生型和突变蛋白由昆虫细胞表达和分泌，并在Western blot上检测为≈34 kDa的条带(图2 b条和c（c）). 野生型和突变蛋白与抗-His抗体进行了类似的染色，表明它们的表达水平相同。相比之下，用抗FN抗体观察到突变蛋白的微弱染色，这表明突变导致表位识别的变化。

III的装订12–14W1925R型和III12–14L1974R型纯化的重组蛋白固定化肝素（通过ELISA）表明(对<0.01）野生型减少(图3一). 因此，突变体与内皮细胞（人类真皮微血管内皮细胞系HMEC-1）和永生化小鼠足细胞的结合显著减少(对<0.01 vs.野生型），如FACS和共焦显微镜分析所记录(图3 B类和C类). 人类脐静脉内皮细胞（HUVEC，SI图8).

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FN Hep-II结构域的突变导致与肝素、内皮细胞和足细胞的结合减少，并损害应激纤维的形成。(一)III的装订12–14重量，III类12–14W1925R型、和III12–14L1974R型通过ELISA检测肝素。外径、光密度。(B类和C类)WT与突变poli-His-taged III的结合12–14W1925R型和III12–14L1974R型加入人内皮细胞（HMEC）和小鼠足细胞的重组体(b条)FACS分析。(C类)共焦显微镜；原始放大倍数，×600）。用抗-His抗体加FITC-偶联（FACS）或Cy3-偶联（共聚焦，红色）二级抗体进行染色。MFI，荧光强度中值。(D类)HMEC被镀在一个120-kDa的N末端FN片段上(一)或III的存在12–14重量(b条)，III类12–14W1925R型(c（c）)，III类12–141974年(d日)，或全长FN(e（电子）)，在无血清培养基中培养3h，然后用罗丹明-卟啉标记以显示应力纤维。应激阳性细胞的百分比（平均值±标准差）显示在底部（白色数字）。数据为三个独立实验的平均值±标准差。*，对减去仅添加缓冲液（空白）记录的值后，计算出<0.01 vs.WT.O.D.和MFI值。

细胞与FN的最初粘附和扩散是由FN III中含有RGD的结构域的相互作用介导的9–10α5β1细胞整合素重复序列(17). 但是，进一步形成肌动蛋白应激纤维和焦点接触需要Hep-II与细胞表面蛋白聚糖和整合素结合(18–20). 因此，我们假设低肝素亲和力和细胞结合III12–14W1925R型和III12–14L1974R型导致触发应力纤维形成和细胞扩散的能力受损。这种可能性已经过测试在体外在HMEC中，在含有RGD结构域但缺少Hep-II结构域的120-kDa FN片段层上，在III的存在下12–14重组体(19) (图3D类). 镀在120-kDa片段上的HMEC能够附着，但是，它们显示出很少的肌动蛋白应力纤维，表明它们没有完全扩散。如果III12–14重量加入培养基后，压力纤维阳性细胞的百分比增加了3倍(19)，而当两个突变体以相同浓度添加时，这种增加不会发生(对与野生型相比<0.01；图3D类).

第三个GFND相关突变Y973C影响FN的另一个肝素结合域Hep-III，位于III4–5重复。它与Hep-II共享促进应力纤维和焦点粘附形成的能力(21). Y973C突变在III中引入额外的半胱氨酸4，这可能通过形成异常的Cys–Cys键影响蛋白质折叠和功能。

致病性假说。

上述报告FN1型突变及其功能后果可以解释GFND进展性肾病之前的严重蛋白尿和镜下血尿。事实上，由于与突变FN的相互作用受损，肾小球内皮细胞和足细胞中的细胞扩散和细胞骨架受到干扰，预计会改变肾小球的大小选择性特性并诱导异常的蛋白质运输(22,23).

FN以可溶性形式（pFN）存在于血浆中，或以不溶性组织纤维（细胞FN）的形式沉积在细胞外基质中(9). GFND患者的肾活检标本显示，肾小球系膜和内皮下间隙内广泛的FN沉积，主要呈颗粒状，只有一些不规则排列的纤维混杂(1,8,10). 通过使用pFN和细胞FN的特异性抗体，有文献证明肾小球FN沉积主要来自血浆，在较小程度上来自常驻肾小球细胞(1,8,10).

Hep II和III结构域通过复杂的FN–FN和FN–细胞表面蛋白聚糖相互作用，在调节FN组装成细胞外基质中有组织的原纤维中发挥主要作用(18,24–26). 此外，Hep II结构域和III结构域之间的相互作用2–3重复序列使pFN保持紧密可溶状态，防止其沉积在细胞外基质中(27). 基于这一证据和本文提出的功能研究结果，我们认为GFND相关突变FN1型损害FN组装成纤维的控制以及可溶性和不溶性FN之间的平衡，这可以解释参与本研究的患者肾活检标本中记录的肾小球基质中非纤维性pFN的异常掺入。

GFND是一种非常罕见的疾病(1,8,10,11,28)然而，目前的数据可能有助于理解以FN肾小球沉积为特征的更常见肾脏疾病的发病机制，如糖尿病肾病(29)，IgA肾病(30)和狼疮性肾炎(31).

方法

患者和诊断。

在知情同意后，我们从15个家系的所有受影响和未受影响的成员中采集血液样本，以分离基因组DNA。受影响状态的定义是基于肾活检或与GFND状态兼容的临床病史（蛋白尿、微小血尿、高血压和肾功能缓慢下降），每个谱系中至少有一个经活检证实为GFND的个体(1). 受影响的受试者没有出现系统性狼疮、冷球蛋白血症、糖尿病、淀粉样变或自身免疫性疾病的临床或实验室证据。对于无疾病的定义，符合以下标准：无明显蛋白尿、血尿、血压正常和肾功能正常(6). 这些研究中包含的所有方案均已获得机构审查委员会的批准。赫尔辛基声明称，所有参与研究的受试者都获得了知情的书面同意。

DNA分析。

我们对F233家系的候选染色体区域1q32、19p13、11p13和2q34进行了连锁分析(SI文本).

使用GENEHUNTER软件包（1.2版）重建单倍型。根据临床和系谱数据，假设常染色体显性传播与年龄相关的外显率(6). 责任等级分配如下：第一代和第二代受试者和未受试者被分配为责任等级1，外显率向量{0.0、0.99和0.99}。第三代未受影响的个体（均<35岁）被分配为2级责任，外显率向量{0.0、0.50和0.75}。一般人群中的疾病基因频率设定为0.0001(6). GENEHONTER通过使用仅受影响和责任类别模型进行了两点和多点链接分析。SLink模拟是通过FASTLINK包完成的。

我们对其外显子和侧翼内含子区域进行了测序FN1型(NC_ 000002，吉：51511462）。该基因有三个区域接受选择性剪接（EDI、EDII和IIICS），可能产生20种不同的转录变体。我们选择了代表最长转录物并编码最长亚型的变体1(NM_212482号)（参见SI文本和SI表3). 氨基酸编号指翻译起始位点（Met+1），核苷酸编号指ATG起始密码子的A(网址：www.ncbi.nlm.nhi.gov,NM_212482号).

表达和功能研究。

影响Hep-II结构域的两个突变被引入编码重复序列III的人类互补DNA（cDNA）12–14FN，并通过杆状病毒系统在Sf9细胞中表达为His-tagged融合蛋白（参见SI文本).

野生型与突变型III的结合12–14用ELISA检测肝素重组体(32). 野生型和突变型III的能力12–14结合内皮细胞（HMEC和HUVEC）和足细胞（纽约西奈山医学院Peter Mundel的永生化小鼠足细胞）的重组体(33)通过FACS和共焦显微镜分析进行评估（参见SI文本) (34).

为了进行扩散分析，HMEC细胞被涂布在玻璃盖玻片上，之前用人120-kDa FNα-密码子片段涂布过夜，缺失Hep-II结构域，带有或不带有纯化野生型III12–14和突变型III12–14W1925R型和III12–14L1974R型重组蛋白。作为阳性对照，细胞接种在涂有完整FN的玻璃盖玻片上(19). 在孵育期结束时，用罗丹明-球蛋白对F-肌动蛋白丝进行染色，并用倒置共焦激光显微镜检查细胞（参见SI文本) (33).

统计分析。

数据以平均值±标准偏差报告。野生型和突变型III的功能分析结果12–14FN1片段由Student的t吨测试未配对数据。

补充材料

支持信息：

致谢。

我们感谢Gaia Pianetti在测序方面提供的出色技术援助；Francesca Mari博士、Mario De Marchi博士、Gianna Mazzucco博士和Mario Carmellini博士在家庭遗传咨询、样本收集和临床数据讨论方面提供帮助；Fabio Sangalli和Simona Buelli博士协助共焦显微镜实验。我们感谢Andrea Hartmann对肝素和HUVEC结合实验的出色协助。这项工作得到了意大利米兰艺术协会基金会的资助。F.C.是ART奖学金的获得者，M.N.和G.R.由美国国立卫生研究院（NIH）DK71221拨款支持。F.H.由NIH Grant DK039255-16资助，是Frederick G.L.Huetwell教授和Doris Duke杰出临床科学家。P.F.Z.感谢德意志联邦调查局和KIDNEEDS的支持。

脚注

作者声明没有利益冲突。

这篇文章是PNAS直接提交的。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/cgi/content/full/0707730105/DC1.

工具书类

1Strom EH、Banfi G、Krapf R、Abt AB、Mazzucco G、Monga G、Gloor F、Neuweiler J、Riess R、Stosiek P等。肾脏Int。1995;48:163–170.[公共医学][谷歌学者]
2Kornblihtt AR、Pesce CG、Alonso CR、Cramer P、Srebrow A、Werbajh S、Muro AF。美国财务会计准则委员会J。1996;10:248–257.[公共医学][谷歌学者]
三。Hildebrandt F、Strahm B、Prochoroff A、Cybulla M、Gemperle O、Krapf R、Brandis M。美国医学遗传学杂志。1996;63:323–327.[公共医学][谷歌学者]
4Zhang Z、Kundu GC、Yuan CJ、Ward JM、Lee EJ、DeMayo F、Westphal H、Mukherjee AB。科学。1997;276:1408–1412.[公共医学][谷歌学者]
5Vollmer M、Krapf R、Hildebrandt F。肾拨号移植。1998;13:2417–2418.[公共医学][谷歌学者]
6Vollmer M、Jung M、Ruschendorf F、Ruf R、Wienker T、Reis A、Krapf R、Hildebrandt F。美国人类遗传学杂志。1998;63:1724–1731. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Vollmer M、Kremer M、Ruf R、Miot S、Nothwang HG、Wirth J、Otto E、Krapf R、Hildebrandt F。基因组学。2000;68:127–135.[公共医学][谷歌学者]
8Mazzucco G、Maran E、Rollino C、Monga G。Hum Pathol（Hum病态）。1992;23:63–68.[公共医学][谷歌学者]
9Kennedy DW山田KM。细胞生物学杂志。1979;80:492–498. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Assmann KJ、Koene RA、Wetzels JF。美国肾脏病杂志。1995;25:781–791.[公共医学][谷歌学者]
11Niimi K、Tsuru N、Uesugi N、Takebayashi S。儿科肾病学。2002;17:363–366.[公共医学][谷歌学者]
12Hynes RO，山田KM。细胞生物学杂志。1982;95:369–377. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13霍曼H。克林·沃琴施（Klin Wochenschr）。1982;60:1265–1277.[公共医学][谷歌学者]
14Barkalow FJ，施瓦茨鲍尔JE。生物化学杂志。1991;266:7812–7818.[公共医学][谷歌学者]
15Sharma A、Askari JA、Humphries MJ、Jones EY、Stuart DI。EMBO J。1999;18:1468–1479. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Sachchidanand、Lequin O、Staunton D、Mulloy B、Forster MJ、Yoshida K、Campbell ID。生物化学杂志。2002;277:50629–50635.[公共医学][谷歌学者]
17Sechler JL、Schwarzbauer JE。细胞广告通讯。1997;4:413–424.[公共医学][谷歌学者]
18Santas AJ、Peterson JA、Halbleib JL、Craig SE、Humphries MJ、Peters DM。生物化学杂志。2002;277:13650–13658.[公共医学][谷歌学者]
19Peterson JA、Sheibani N、David G、Garcia-Pardo A、Peters DM。生物化学杂志。2005;280:6915–6922.[公共医学][谷歌学者]
20伍兹A、朗利RL、图莫娃S、小库奇曼。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。2000;374:66–72.[公共医学][谷歌学者]
21Moyano合资公司、Maqueda A、Albar JP、Garcia-Pardo A。生物化学杂志。2003;371:565–571. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Tryggvason K、Patrakka J、Wartiovaara J。N英格兰医学杂志。2006;354:1387–1401.[公共医学][谷歌学者]
23巴勒曼BJ。肾单位生理学。2007;106:19–25. [谷歌学者]
24Bultmann H、Santas AJ、Peters DM。生物化学杂志。1998;273:2601–2609.[公共医学][谷歌学者]
25Maqueda A、Moyano合资公司、Hernandez Del Cerro M、Peters DM、Garcia-Pardo A。基质生物。2007;126:642–651.[公共医学][谷歌学者]
26Mao Y，Schwarzbauer B。基质生物。2005;25:389–399.[公共医学][谷歌学者]
27Johnson KJ、Sage H、Briscoe G、Erickson HP。生物化学杂志。1999;274:15473–15479.[公共医学][谷歌学者]
28Sato H、Matsubara M、Marumo R、Soma J、Kurosawa K、Taguma Y、Saito T。美国肾脏病杂志。1998;31：E3。[公共医学][谷歌学者]
29Janssen B、Hohenadel D、Brinkkoetter P、Peters V、Rind N、Fischer C、Rychlik I、Cerna M、Romzova M、de Heer E等。糖尿病。2005;54:2320–2327.[公共医学][谷歌学者]
30Mattii L、Segnani C、Cupisti A、D'Alessandro D、Moscato S、Meola M、Barsotti G、Marino M、Bianchi F、Dolfi A等。肾单位实验肾单位。2005;101：e16–e23。[公共医学][谷歌学者]
31Baelde HJ、Eikmans M、van Vliet AI、Bergijk EC、de Heer E、Bruijn JA。病理学杂志。2004;204:248–257.[公共医学][谷歌学者]
32Opperman M、Manuelian T、Jozsi M、Brandt E、Jokiranta TS、Heinen S、Meri S、Skerka C、Gotze O、Zipfel PF。临床实验免疫学。2006;144:342–352. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Morigi M、Buelli S、Angioletti S、Zanchi C、Longaretti L、Zoja C、Galbusera M、Gastoldi S、Mundel P、Remuzzi G等。《美国病理学杂志》。2005;166:1309–1320. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Manuelian T、Hellwage J、Meri S、Caprioli J、Noris M、Heinen S、Jozsi M、Neumann HPH、Remuzzi G、Zipfel PF。临床投资杂志。2003;111:1181–1190. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院