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前Oncol。2023; 13: 1220459.
在线发布2023年8月31日。 数字对象标识：10.3389/fonc.2023.1220459
预防性维修识别码：下午0501397
PMID：37719019

MiR-4270通过直接靶向人骨肉瘤细胞中的Bcl-xL发挥肿瘤抑制作用

Clément Veys公司,1 弗拉维·布卢亚德,1,2 阿卜杜拉希姆·本穆萨,1,三 马诺·詹姆斯,1 艾米莉·布罗廷,4,5,6 弗朗索瓦斯·雷迪尼,7 劳伦特·普兰,5,6 尼古拉斯·格鲁希,1,2 克里斯托夫·德诺耶勒,4,5,6 弗洛伦斯·勒让德,1,†和菲利普·加莱拉通讯作者1,*,†
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摘要

软骨肉瘤和骨肉瘤是恶性骨肿瘤，如果不能切除或转移，预后较差。此外，放疗和化疗可能无效。MiRNAs代表了一种替代治疗方法。基于高通量功能筛选，我们鉴定了四种对SW1353软骨肉瘤细胞具有潜在抗增殖作用的miRNA。然后在SW1353细胞和三个骨肉瘤细胞系中进行个体功能验证。与阳性对照miR-342-5p比较，评估miRNAs的抗增殖和细胞毒性作用。四种选定的miRNAs对SW1353细胞的细胞毒作用尚未得到证实，但我们明确揭示miR-4270对HOS和MG-63骨肉瘤细胞株具有强大的细胞毒效应，但对SaOS-2细胞株没有。此外，与miR-342-5p一样，miR-4270也能诱导这两种细胞系的凋亡。此外，我们提供了作为miR-4270直接靶点的Bcl-xL的第一份报告。MiR-4270还降低了抗凋亡蛋白Mcl-1的表达，并增加了促凋亡蛋白Bak的表达。我们的研究结果表明，miR-4270在骨肉瘤细胞中具有肿瘤抑制活性，尤其是通过Bcl-xL下调。

关键词：骨肉瘤，软骨肉瘤，miR-4270，miR-342-5p，凋亡，Bcl-XL

1.简介

骨肉瘤是相对罕见的肿瘤。在世界卫生组织（WHO）列出的各种骨肉瘤中，两种主要的骨肉瘤和软骨肉瘤。骨肉瘤是最常见的骨肉瘤类型(1,2). 这种侵袭性癌症主要影响儿童和年轻人，在大多数情况下，它发生在四肢的长骨上：股骨下端、胫骨上端或肱骨上端(三). 肿瘤细胞以合成类骨基质为特征。软骨肉瘤是第二常见的骨肉瘤，发病年龄在40岁以后。它优先发育于扁骨（骨盆、肩胛骨、肋骨、脊柱）和长骨（股骨、胫骨、肱骨）(4,5). 这种肿瘤的特征是在缺氧环境中形成细胞外软骨基质(6).

在目前的治疗中，骨肉瘤是最容易治愈的肉瘤，预后良好，可长期存活。新辅助化疗，包括顺铂、阿霉素和甲氨蝶呤，加上手术是这类肿瘤的首选治疗方法(7,8). 然而，对于无法切除的转移瘤患者或老年人，预后较差(9). 对于软骨肉瘤，只有手术才有效，因为软骨肉癌对化疗和放疗有抵抗力(10). 总的来说，治疗这两种类型的骨肿瘤绝对需要新的治疗策略。

MicroRNAs（miRNAs）是约20-25个核苷酸的小型非编码RNA。它们是数百种不同mRNA的转录后调节器。当它们通过互补碱基配对退火为mRNA时，它们起到翻译抑制剂的作用或有利于mRNA的降解(11). 近年来，miRNAs已成为尚未完全阐明的复杂靶网络中的关键调控因子(12,13). MiRNAs在许多生理过程中发挥着重要作用，但也在许多病理条件中发挥着关键作用，特别是在癌症的进展中，包括骨肉瘤(14–16). 各种miRNAs有望用作诊断或预后生物标志物，也可能导致骨肉瘤新的治疗靶点的发现(14,17–19). 骨肉瘤中发现了许多由miRNAs调控的代谢途径，如生存、生长、血管生成或化疗敏感性。然而，很少有研究关注直接靶向Bcl-2家族抗凋亡成员的miRNAs在骨肉瘤中的作用。几项研究已经报道了靶向这些蛋白质治疗骨肉瘤的有希望的治疗潜力。Bcl-2和Bcl-xL的过度表达确实常常与预后不良有关，并且在一定程度上与肿瘤细胞的化疗耐药性有关(20–24). 一项研究表明，Bcl-xL的药理抑制提高了骨肉瘤对阿霉素的敏感性(25). 此外，我们先前表明，miR-491-5p和miR-342-5p直接抑制Bcl-xL可诱导骨肉瘤和软骨肉瘤细胞系的凋亡(26,27). MiR-342-5p还直接抑制了一些受试细胞系中Bcl-2的表达。

在这项研究中，我们继续了我们之前对SW1353软骨肉瘤细胞系上1200个miRNA模拟物的高通量miRNA筛选(26). 通过miRNA靶点预测，我们选择了四种可能产生细胞毒性作用的miRNA，它们可能会靶向BCL2级,BCL2L1型或MCL1公司信使核糖核酸。随后，我们对miR-16-1-3p、miR-646、miR-3667-3p和miR-4270进行了个体和功能研究。MiR-342-5p被用作阳性对照，因为其对软骨肉瘤和骨肉瘤细胞的抑瘤作用已经得到验证(26,27). 对于SW1353软骨肉瘤细胞系，研究了miRNA在常氧和缺氧条件下的潜在细胞毒性和化学增敏作用，因为缺氧是就地肿瘤的病理生理微环境(28). 不幸的是，在功能研究中，没有一种新选择的miRNAs对SW1353细胞产生细胞毒性作用。由于它们具有细胞毒性，我们决定在骨肉瘤细胞系上测试它们。相比之下，miR-4270对三种骨肉瘤细胞系中的两种细胞具有细胞毒作用，并通过凋亡诱导细胞死亡，这表明其特定作用取决于细胞类型。通过western blots和荧光素酶报告子分析，我们证明miR-4270直接靶向BCL2L1型信使核糖核酸(Bcl-xL公司基因）。此外，miR-4270在蛋白水平降低了Mcl-1的表达，而增加了Bak的表达。这些结果表明miR-4270可以在骨肉瘤细胞中起到抑癌作用。

2.材料和方法

2.1. 细胞培养

软骨肉瘤细胞系SW1353（ATCC®HTB-94）在添加了10%胎牛血清（FCS，Eurobio Scientific，Courtaboeuf，France）、3µg/mL环丙沙星（Sigma-Aldrich，Saint-Louis，MO，USA）和0.5µg/mL两性霉素（Eurobio-Scientistic）的高葡萄糖-DMEM（HG-DMEM，Biowest）中培养。SW1353细胞在常压氧（21%O2)和缺氧（3%O2)在一个密封的房间里(29).

骨肉瘤细胞系HOS（ATCC®CRL-1543™）在HG-DMEM中培养，HG-DMEM中添加10%FCS，以及100 IU/ml青霉素、100µg/ml链霉素和0.25µg/ml两性霉素的混合物（法国科塔博夫Eurobio Scientific）。骨肉瘤细胞株MG-63（ATCC®CRL-1427™）在MEM（法国努埃尔的Biowest）中培养，并添加10%的FCS，以及100 IU/ml青霉素和100µg/ml链霉素的混合物（法国科塔博夫的Eurobio Scientific）。骨肉瘤细胞系SaOS-2（ATCC®HTB-85™）在DMEM中培养：HAM的F12（Biowest）添加5%FCS、2 mM L-谷氨酰胺（Eurobio Scientific，Courtaboeuf，France）和100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的混合物（Eurobio Sciefic，Cortabouf，Frances）。骨肉瘤细胞的治疗仅在常压下进行。

人类关节软骨细胞（HAC）是在获得适当伦理批准的情况下获得的，如前所述，它们是从接受关节置换术的患者的股骨头宏观健康区域中制备的(26). 该研究完全按照当地伦理委员会的指导方针进行，所有软骨样本均根据法国法律在捐赠者书面知情同意后采集。所有实验方案均经生物测定局（研究方案编号PFS21-025）和法国高等教育和研究部（人体样本研究伦理委员会CODECOH:DC 2014-2325）批准。

2.2. 药物和miRNAs

在转染miRNA期间使用亚致死剂量的CDDP（默克公司、桑特SAS公司、法国里昂），如下所示：SW1353为1µg/ml（3.3µM），HOS、MG-63和SaOS-2细胞为0.5µg/ml（1.65µM。MiRNA-Control（miR-Ctrl，MIMAT0000039）、hsa-miR-342-5p（miR-342，MIMAT0004694）、hsa-miR-16-1-3p（miR-16-1，MIMAT 0004489）、hse-miR-646（miR-645，MIMAT000 3316）、hsi-miR-3667-3p（miR3667，MIMAT0018090）、hsp-miR-4270（miR-4270,MIMAT0016900）、hsh-MiRNA-342-5p-发夹抑制剂（抗miR-342,IH-301083-02）、，hsa-miR-4270-发夹抑制剂（anti-miR-4270，IH-301835-01）和miRNA发夹抑制剂阴性对照（anti-micR-ctrl，IN-001005-01）购自Dharmacon（英国剑桥Horizon Discovery）。

2.3. miRNA模拟筛选

如前所述，在常氧条件下，将SW1353细胞置于96 well E板中，置于xCELLigence实时细胞分析（RTCA、ACEA、Ozyme、Saint-Quentin-en-Yvelines、France）上(26). 简单地说，使用Interferin™（Polyplus-Transfection，Strasbourg，France）接种20 nM miRNAs后24小时，将细胞转染三次。转染24小时后，对其进行CDDP或不进行CDDP治疗。连续测量每个孔的阻抗，并将其表示为细胞指数（CI）值±SD（使用RTCA 2.1.0软件）。如前所述，在实验结束时（接种后120小时）使用Cellavista成像系统（罗氏，巴塞尔）进行形态学分析(26).

2.4. 转染和CDDP治疗

生长中的软骨肉瘤和骨肉瘤细胞以1x10接种4细胞/厘米2每25厘米2瓶。如前所述，使用INTERFERin™（多聚物转染）在接种20 nM miRNA模拟物24小时后转染细胞系(26,27). 如前所述，在48小时后使用每种亚致死剂量的CDDP进行额外的CDDP治疗(26,27).

2.5. XTT分析

SW1353细胞和骨肉瘤细胞系接种在密度为3.5x10的96摆板中三细胞/孔和3.3x10三细胞/孔各一式三份。24小时后用20 nM miRNA转染细胞，转染48小时后再加或不加CDDP处理。如前所述，使用XTT试验（瑞士巴塞尔罗氏）在转染72小时后评估细胞代谢活性(26,27). 使用微孔板阅读器（Spark 10M，Tecan Lyon，法国）测量光密度（OD）。

2.6. 生物发光细胞毒性试验

毒素光细胞毒性测定试剂盒（Interchim，Montluçon，France）也用于评估转染后72小时miRNA诱导的细胞毒性。如前所述，在上清液中测量释放的腺苷酸激酶(26). 用微孔板阅读器（Spark 10M，Tecan Lyon，法国）测量生物发光，并表示为相对荧光素酶单位（RLU）。

2.7. 通过DNA含量进行细胞周期分析

如前所述，用Cytoflex S流式细胞仪（Beckman Coulter France SAS，Paris，France）用碘化丙啶（Sigma-Aldrich，Saint-Louis，MO，USA）对胰酶化细胞染色后的DNA含量进行核染色(26).

2.8. 核形态学

如前所述，采用DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚，己二酸盐）（美国德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术公司）进行核染色，对分离细胞和胰蛋白酶化细胞进行形态学表征(26).

2.9. 西部地块

使用来自Cell Signaling Technology（Ozyme，Saint-Quentin-en-Yvelines，France）的PARP（9542）、Bcl-xL（2764）和Bak（3814）抗体，以及来自Santa Cruz Biotechnology（Dallas，TX，USA）的Mcl-1（S-19）、GAPDH（FL-335）和β-Tubulin（D-10）抗体，通过免疫印迹分析分离细胞和粘附细胞的蛋白质水平，以及之前描述的来自DAKO（安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国）的Bcl-2（M0887）抗体(26,27). 每个免疫印迹至少代表三个不同的实验。通过量化根据GAPDH或β-Tubulin（ImageLab®软件）调整的免疫印迹条带密度来评估蛋白质表达。

2.10. miRNA靶向报告分析

使用jetOPTIMUS联合转染HOS细胞48小时™DNA转染试剂（Polyplus-transfection，法国斯特拉斯堡），带有20 nM miRNA模拟物或miRNA发夹抑制剂，以及BCL2-3'UTR载体（217HmiT016211a；2761 bp）、BCL2L1-3'UTR-载体（217 HmiT108616-MT05；1489 bp）或MCL1-3'UTR载体（21 7HmiT127389-MT05；2839 bp）（1 ng/µL；GeneCopoeia，Rockville，MD，USA），如前所述(27). 这些载体在Gaussia荧光素酶（GLUC）报告基因和分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因下游含有miR-342-5p和miR-4270 3'UTR序列。SEAP和GLUC荧光素酶活性用分泌-对-双发光检测试剂盒（美国马里兰州罗克维尔GeneCopoeia）检测三份。用发光微板阅读器（Spark 10M，Tecan）测量报告者的活性，并表示为对应于GLUC:SEAP比率的相对荧光素酶单位（RLU）。

2.11. 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7活性

如前所述，使用Incucyte®S3采集图像（英国罗伊斯顿埃森生物科学有限公司）中的Incucytes®Caspase-3/7绿色凋亡检测试剂（Fisher Scientifics SAS，Illkirch，France）评估HOS、MG-63和SaOS-2细胞的Caspase-3/4活性(26,27). 简言之，在转染20 nM miRNA后72小时内对细胞进行监测。每个实验均进行三次。

2.12. 统计分析

所有实验至少重复三次。数值以平均值±标准差表示。统计分析采用单向方差分析（使用Dunnett检验对多次比较进行校正）或双向方差分析（通过Sidak检验对多次对比进行校正）。或者，对于一式三份进行的代表性实验，使用双尾非配对Student’s进行统计分析t吨-用韦尔奇的修正进行测试。使用GraphPad Prism 7软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行分析：NS，P>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001）。

3.结果

3.1. 利用SW1353软骨肉瘤细胞系高通量筛选鉴定抗增殖miRNAs

如前所述，我们对SW1353细胞进行了1200个miRNA模拟物的实时高通量筛选(26). 在转染miRNAs 24小时后，还进行了额外的顺铂（CDDP）治疗，以研究其化学增敏作用(26). 通过使用xCELLigence系统实时跟踪细胞指数（CI）和使用Cellavista成像系统对细胞进行终点形态学观察来分析miRNA的生物学效应。最后，在所有这些miRNAs中，我们选择了四种对细胞增殖/附着具有潜在有效性的新miRNAs（miR-16-1-3p、miR-646、miR-3667-3p和miR-4270）( 图1 ).

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SW1353软骨肉瘤细胞miRNAs高通量筛选。SW1353细胞在转染miR-Ctrl、miR-16-1-3p、miR-646、miR-3667-3p或miR-4270之前生长24小时（箭头标记为T）。转染24小时后，用CDDP（1µg/ml）对细胞进行额外处理（箭头标记为C）。（A–D）使用xCELLigence系统进行实时生长曲线监测。每3 h监测一次细胞指数的测量，持续120 h。每miRNA一次实验的平均细胞指数±SD分析显示120 h（左侧面板）和播种后120 h（右侧面板）。使用未配对学生的t吨-测试。（E）用Cellavista成像系统在接种后120小时对细胞进行终点形态分析。Ctrl，控制；CDDP，顺铂。*：p<0.05，**:p<0.01，**:p<0.001。

MiR-16-1-3p从转染后约60 h到实验结束，细胞指数下降（与MiR-Ctrl相比，在接种后120 h，即转染后96 h，下降5.7倍，p<0.001， 图1A ). 在存在亚致死剂量的CDDP的情况下，细胞镀膜后120 h，miR-16-1-3p的细胞指数下降延迟至与不含CDDP的细胞指数相同的程度（p<0.001， 图1A ). 接种后120小时对细胞进行的显微镜观察证实，miR-16-1-3p在添加或不添加CDDP的情况下增殖减少( 图1 ). 因此，MiR-16-1-3p对SW1353细胞具有抗增殖作用，但没有化学增敏作用。

从转染后48小时到实验结束，MiR-646也降低了细胞指数（与MiR-Ctrl相比，接种后120小时，细胞指数降低了3倍，p<0.05， 图1B ). 当miR-646与CDDP联合使用时，减少了3.2倍（相对于miR-Ctrl+CDDP，播种后120小时，p<0.05， 图1B )，表明对CDDP无明显敏感性。此外，与miR-Ctrl处理的细胞相比，miR-646和miR-646/CDDP处理的细胞在汇合方面表现出类似的大幅减少( 图1 ). 因此，miR-646对SW1353细胞只有抗增殖作用。

同样，miR-3667-3p的转染导致在实验结束时，无论有无CDDP，细胞指数都降低了4.7倍（与miR-Ctrl治疗相比，p<0.001）， 图1C ). 与相应的miR-Ctrl相比，细胞附着和细胞密度也降低( 图1 ). MiR-3667-3p对SW1353细胞似乎只有抗增殖作用。

最后，miR-4270也降低了细胞指数，但与其他三种miRNAs相比，其作用延迟，仅在转染后约72小时观察到作用( 图1 ). 实验结束时，miR-4270在接种后120 h，无论是否添加CDDP，细胞指数都降低了2.5倍（与miR-Ctrl相比p<0.01，与miR-CTL/CDDP相比p<0.05）。无论有无CDDP，细胞汇合也减少了至少50%，表明这种miRNA没有化学增敏作用( 图1 ). 因此，miR-4270对SW1353软骨肉瘤细胞只有抗增殖作用。

3.2. miRNA的个体功能分析未能证实SW1353软骨肉瘤细胞系中细胞死亡的诱导

接下来，我们在转染正常氧和缺氧培养的SW1353细胞后72小时，对这四种miRNAs和miR-342-5p（用作阳性对照）进行了功能分析。我们还研究了miRNAs转染后48小时亚致死剂量暴露于CDDP的潜在化学增敏效应。

对SW1353活性和增殖以及miRNAs细胞毒性的研究表明，miR-342-5p具有最佳的抗增殖和细胞毒性作用，而除在CDDP缺氧条件下使用miR-16-1-3p和miR-646外，其他miRNA没有相关作用，因此揭示了可能的化学增敏作用( 图S1A ). 然而，这种作用没有得到进一步证实，因为后两种miRNAs在缺氧条件下，无论有无CDDP，都不能诱导SW1353细胞的细胞毒性( 图S1B )与之前描述的miR-342-5p不同(26).

关于细胞周期进展，使用流式细胞术使用miRNAs未观察到细胞周期阻滞( 图S2 ). 所有miRNAs均未诱导SW1353细胞的细胞周期阻滞。相反，亚致死剂量的CDDP在S期和G2/M期诱导细胞周期阻断。在所有四种培养条件下，只有miR-342-5p增加了亚G1期细胞的数量（与相应的miR-Ctrl处理相比，大约增加了3倍，p<0.01或p<0.05）。miR-Ctrl和miR-342-5p亚G1期细胞比例分别为6.8%和21.9%，无CCDP；5.5%和14%的CDDP处于常压状态；6.6%和20.5%缺氧时无CDDP；低氧条件下CDDP分别为4.4%和14.4%。

转染后72小时的显微镜观察进一步证实了只有miR-342-5p诱导细胞死亡。事实上，miR342-5p减少了汇合并增加了凋亡碎片或细胞碎片的数量( 图S3 ). 只有在正常氧和CDDP存在的情况下，MiR-646才能将G1亚期事件的百分比显著增加2倍（相对于MiR-Ctrl/CDDP处理的细胞，p<0.05）( 图S2 ). 在CDDP存在的情况下，MiRNAs并没有增加G1亚峰，这表明所有测试的miRNA都没有化学增敏作用。

总的来说，我们得出结论，在高通量筛选中观察到的这四种miRNAs的抗增殖作用并不是由于诱导SW1353细胞死亡。

3.3. miRNAs的功能分析揭示了miR-342-5p、miR-16-1-3、miR-646和miR-4270对骨肉瘤细胞株的抗增殖作用

同时，我们在转染后72小时对三种骨肉瘤细胞系进行了功能分析。在miRNAs转染48小时后，在有或无亚致死剂量CDDP的情况下，在常压下处理细胞。首先，使用XTT分析评估细胞活性和增殖( 图2 ).

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miRNAs对骨肉瘤细胞系细胞活性和增殖的影响。（A）HOS、，（B）MG-63和（C）接种后24小时用miRNAs转染SaOS-2细胞，转染后48小时用CDDP（0.5µg/ml）处理24小时（h）然后在转染后72小时进行分析。评估细胞活力和增殖，并表示为每个细胞系四个独立实验的平均OD±SD。使用单向方差分析（ANOVA）评估miR-Ctrl和miRNA处理细胞之间结果的显著性（*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001）。

HOS单元中( 图2 )与miR-Ctrl相比，所有miRNAs（miR-3667除外）均显著降低了细胞存活率和增殖率（miR-342-5p和miR-646约降低了1.8倍，p<0.001；miR-16-1-3p和miR4270约降低了1.5倍，p<0.01）。在CDDP存在的情况下，所有miRNAs都降低了细胞活力和增殖。MiR-342-5p和MiR-646是最有效的miRNAs，无论有无CDDP，其降低幅度都相同（约为1.8倍（p<0.001））。MiR-3667-3p的疗效最低，在CDDP存在的情况下仅微弱下降1.3倍（p<0.05）。

对于MG-63细胞，miR-342-5p、miR-646和miR-4270在转染后72小时显著降低了其活性和增殖( 图2 ). 在这两种培养条件下，MiR-342-5p使细胞活力和增殖降低了约3倍（相对于MiR-Ctrl，p<0.001；相对于MiR-Contrl/CDDP，p<0.01），而MiR-646和MiR-4270的幅度效应较小，大约降低了2倍（相对于各自的MiR-Ctrls，p<0.05）。

当不使用CDDP时，MiR-342-5p、MiR-646和MiR-4270显著降低了SaOS-2的活性和增殖（MiR-342-5和其他两种miRNAs分别降低了3.2倍和1.7倍，与MiR-Ctrl相比p<0.001）( 图2 ). 当miRNA与亚致死剂量的CDDP相关时，所有miRNA（miR-3667除外）均显著降低细胞存活率和增殖率（miR-342-5p减少3.7倍，p<0.001；miR-646和miR-4270减少1.8倍，p<0.001；miR16-1-3p减少1.4倍，p<0.05）。

总之，我们观察到miR-342-5p、miR-16-1-3、miR-646和miR-4270对三种骨肉瘤细胞株的反复抗增殖作用。

3.4. miRNAs的功能分析揭示了miR-4270对HOS和MG-63骨肉瘤细胞株的细胞毒性作用，但对SaOS-2骨肉瘤的细胞株没有作用

然后我们分析了这些miRNAs的细胞毒性作用( 图3 ). 除miR-342-5p外，只有miR-4270显著诱导HOS细胞的高细胞毒性( 图3 )：相对于miR-Ctrl处理的细胞是1.4倍（p<0.05），相对于miR-Ctrl/CDDP处理的细胞是2.4倍（p<0.05）。以同样的方式，只有miR-4270和miR-342-5p对MG-63细胞诱导了大约2倍的高细胞毒性（有和没有CDDP）与miR-342-5p约为3倍( 图3 ). 所研究的四种miRNAs均未对SaOS-2细胞产生细胞毒性。在存在或不存在亚致死剂量CDDP的情况下，只有阳性对照miR-342-5p的细胞毒性增加了约2倍( 图3 ).

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miRNA对骨肉瘤细胞系的细胞毒性作用。（A）HOS、，（B）MG-63和（C）用miRNAs转染SaOS-2细胞并用CDDP处理，如图2miRNAs的细胞毒性在转染72 h后评估为每个细胞系四个独立实验的平均RLU±SD。使用单向方差分析（ANOVA）评估miR-Ctrl和miRNA处理细胞之间结果的显著性（*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001）。

在HOS细胞系中，使用流式细胞仪对细胞周期细胞进展的分析显示，仅miR-342-5p和miR-4270的亚G1事件数量显著增加( 图4 ). 在没有CDDP的情况下，miR-342-5p显著增加了3.8倍的G1亚期事件数（p<0.001；在使用miR-Ctrl的G1子期事件中，有11.2%的事件数和使用miR-342-25p的43.1%），而miR-4270使其增加了3.4倍（p<0.01；在使用miR-4270的G1次期事件中有38.4%）。CDDP增加了S和G2/M阶段的事件百分比，但牺牲了G0/G1阶段。在CDDP存在的情况下，miR-342-5p使细胞死亡增加了3.5倍（p<0.001；在使用miR-Ctrl的亚G1事件中，有13%的细胞死亡增加，在使用miR342-5p的亚G2事件中增加了46.2%），而miR-4270使细胞死亡提高了3.9倍（p<0.01；在使用miR-4270的亚G1事件中，增加了51.4%）。单独转染miRNAs的细胞与联合CDDP治疗的细胞在诱导细胞死亡方面没有显著差异。转染后72小时的细胞形态分析显示，无论有无CDDP，miRNAs的细胞融合减少，细胞碎片数量增加，染色质碎片增多，染色质碎裂是凋亡细胞的典型特征( 图S4 ).

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骨肉瘤细胞系经miRNA处理后细胞周期相分布的分析。（A）HOS、，（B）MG-63和（C）用miRNAs转染SaOS-2细胞并用CDDP处理，如 图2 。细胞周期相分布在转染后72 h评估为HOS和MG-63细胞的四个独立实验和SaOS-2细胞的五个独立实验的平均值±SD。使用单向方差分析（ANOVA）评估miR-Ctrl和miRNA-处理细胞之间结果的显著性（***：p<0.001）。

对MG63细胞的细胞周期分布的分析表明，亚致死剂量的CDDP处理只会导致S期的阻滞( 图4 ). 在这两种培养条件下，MiR-4270显著增加了2.8倍的亚G1事件数（相对于MiR-Ctrl加或不加CDDP）( 图4 ). 相比之下，miR-342-5p使两种情况下的细胞死亡增加了约4倍（p<0.001）( 图4 )，如前所述(27). 对于两种miRNA，转染后72小时的细胞形态学分析显示，与有或没有CDDP的miR-Ctrl条件相比，细胞碎片的数量和凋亡小体的存在大幅增加( 图S5 ).

在SaOS-2细胞系中，我们观察到CDDP以G0/G1期为代价增加了S期事件的百分比( 图4 ). 在存在或不存在亚致死剂量CDDP的情况下，只有miR-342-5p能够显著增加2.9倍的G1亚期事件数量（p<0.001）。在两种培养条件下，MiR-4270均未显著调节细胞死亡：相对于MiR-Ctrl增加1.6倍，相对于MiR-CTL/CDDP增加1.9倍。细胞形态学分析显示两种miRNAs的融合减少，但与miR-342-5p相比，miR-4270的凋亡小体更少( 图S6 ).

总的来说，这些结果表明，与miR-342-5p类似，miR-4270可能是HOS和MG63骨肉瘤细胞系中的凋亡细胞，而它对SaOS-2骨肉瘤的细胞系只有显著的抗增殖作用。MiR-4270在有或无CDDP的情况下诱导细胞死亡的程度相同，表明它不是CDDP化学增敏剂。

3.5. MiR-4270激活HOS和MG-63骨肉瘤细胞系的凋亡途径

然后，我们研究了miR-4270单独对三种骨肉瘤细胞系转染72小时后凋亡的诱导作用( 图5 ). 我们注意到miR-Ctrl诱导PARP的切割( 图5A , 第7部分 )并增加HOS线路中caspase 3/7的活性( 图5 ). 如前所述，该细胞系对转染更敏感(27). 与miR-342-5p类似，miR-4270在三种骨肉瘤细胞系中诱导PARP裂解( 图5 ). 与SaOS-2细胞系相比，HOS和MG-63细胞系中的作用更为相关。miR-4270转染检测到大量裂解的胱天蛋白酶-3，特别是在HOS细胞系中，但对于两种miRNA，这种裂解在SaOS-2细胞系中几乎不存在( 图5 ). 此外，miR-4270仅在HOS和MG-63细胞中显著增加caspase-3/7活性（分别是miR-Ctrl处理细胞的1.8倍和5.7倍，p<0.001）( 图5 ). MiR-342-5p仅在HOS和MG-63细胞中显著诱导caspase-3/7活性，其幅度与MiR-4270相同(27)). 由于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活和PARP的裂解是细胞凋亡的特征，这些结果表明miR-4270明确地诱导HOS和MG-63骨肉瘤细胞系（如miR-342-5p）的凋亡。这与我们之前关于细胞死亡的结果一致( 图3 , 4 ).

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miR-342-5p和miR-4270对骨肉瘤细胞株的凋亡作用分析。接种24 h后，用miRNAs转染HOS、MG-63和SaOS-2细胞。在面板中（A、B）转染72小时后分析PARP和caspase-3水平。显示了三个独立实验的代表性印迹。（C）caspase-3/7活性评估为72（h）（平均RFU±SD；HOS和SaOS-2细胞n=5；MG-63细胞n=4）。使用双向方差分析（ANOVA）评估miR-Ctrl和miRNA处理细胞之间结果的显著性（**：p<0.01，***：p<0.001）。

3.6. MiR-4270调节骨肉瘤细胞系中Bcl-2家族蛋白的表达

Bcl-xL、Bcl-2、Mcl-1均为抗凋亡Bcl-2家族成员，是miR-4270和miR-342-5p的预测靶点。因此，我们评估了它们的蛋白表达，以确定它们在三种骨肉瘤细胞系中通过这种miRNA诱导凋亡中的作用。

在HOS细胞中，使用miR-4270，Bcl-2蛋白表达没有减少，但增加了1.4倍（相对于miR-Ctrl）( 图6 ). 相比之下，miR-342-5p使HOS细胞系中Bcl-2蛋白的表达降低了2倍。MiR-4270使MG-63和SaOS-2细胞中Bcl-2蛋白的表达分别降低了1.7倍和1.2倍。miR-342-5p对这两种细胞系的作用是相似的（MG-63细胞减少1.4倍，SaOS-2细胞减少1.7倍）。MiR-4270显著降低了所有三种骨肉瘤细胞系中Bcl-xL蛋白的表达（HOS细胞为2.5倍，MG-63细胞为5倍，SaOS-2细胞为1.4倍）( 图6 ). 我们之前确认Bcl-xL是HOS细胞系中miR-342-5p的直接靶点(27). 在这里，我们证实了它对三种测试的骨肉瘤细胞系中Bcl-xL蛋白表达的抑制作用，至少降低了1.7倍。

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miR-342和miR-4270对骨肉瘤细胞系中Bcl-2家族成员表达的影响。在面板中（A–D）接种24 h后，用miRNAs转染HOS、MG-63和SaOS-2细胞。转染72 h后分析Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1和Bak水平。显示了三个独立实验的代表性斑点。蛋白质表达在印迹的底部。将其归一化为β-微管蛋白或GAPDH以及相应的miR-Ctrl。

MCL-1型mRNA是两种miRNA的假定靶点。MiR-342-5p对Mcl-1蛋白表达水平没有相关影响( 图6 ). 在所有三种骨肉瘤细胞系中，miR-4270在不同水平上降低了Mcl-1蛋白的表达：HOS细胞降低了1.4倍，MG-63和SaOS-2细胞降低了1.7倍。

然后我们研究了参与内在凋亡途径的促凋亡蛋白Bak的表达( 图6 ). 该蛋白参与线粒体外膜的通透性和随后的细胞死亡诱导。这两种miRNAs均能在三种骨肉瘤细胞系中诱导Bak蛋白表达。MiR-342-5p具有最强的效果（用MiR-342-5p从2.2倍到30倍的诱导，但用MiR-4270仅从1.5倍到4倍的诱导）。

总之，miR-4270主要降低了骨肉瘤细胞中抗凋亡蛋白Bcl-xL和Mcl-1的表达，而miR-342-5p主要降低了Bcl-xL和Bcl-2的表达。两种miRNAs均显著增加促凋亡蛋白Bak的表达。

3.7. miR-4270对HOS骨肉瘤细胞BCL2L1 mRNA的直接抑制作用

然后我们验证了miR-342-5p和miR-4270对Bcl-2的影响(BCL2级基因），Bcl-xL(BCL2L1型基因）或Mcl-1(MCL1公司基因）与3'UTR区域中各自的mRNA直接结合。使用HOS细胞，我们共同转染荧光素酶报告载体，其中包含这些mRNA的3'UTR序列以及miR-4270和miR-342模拟物或其相应的发夹抑制剂( 图7 ).

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抑制分析BCL2级,BCL2L1型和MCL1公司HOS细胞中miR-342-5p和miR-4270的mRNA。3'UTR序列示意图BCL2级,BCL2L1型和MCL1公司分别显示在面板中（A–C），预测的位点为hsa-miR-4270或hsa-miR342-5p。在HOS细胞中，BCL2-3'UTR、BCL2L1-3'UTR和MCL1-3'UTRs报告载体与miR或抗miR同时转染。转染后48小时进行报告者分析。高斯荧光素酶（GLUC）活性归一化为分泌型碱性磷酸酶（SEAP）活性。数据显示了至少三个独立实验的代表性实验（RLU±SD的平均值）。使用双尾Student’st吨-测试（*：p<0.05，**：p<0.01）。

生物信息学分析确定了BCL2-3'UTR中核苷酸556-562之间miR-4270的潜在结合位点( 图7 ). 与MiR-Ctrl相比，MiR-4270没有显著降低WT-BCL2-3’UTR载体的萤光素酶活性（16%）。抗miR-4270的共转染导致WT-BCL2-3'UTR的荧光素酶活性略有增加（相对于miR-Ctrl，ns为12%），有利于miR-4270%的特异性抑制作用。然而，由于对Bcl-2蛋白表达的分析以及对荧光素酶活性的不良抑制作用，我们得出结论，miR-4270并不直接靶向BCL2级HOS细胞中的mRNA。MiR-342在WT-BCL2-3'UTR载体上也有潜在的结合位点，其转染降低了Bcl-2蛋白的表达。然而，如前所述(27)WT-BCL2-3'UTR载体的荧光素酶活性没有显著降低（22%）。此外，与抗miR-342-5p共转染并未显著逆转载体的荧光素酶活性。如前所示(27)尽管它对Bcl-2蛋白表达有抑制作用，但我们不能证实BCL2级mRNA是HOS细胞中miR-342-5p的直接靶点。

我们在BCL2L1-3'UTR的326-333和738-744位置确定了miR-4270的两个推定结合位点( 图7 ). 我们已经证明了在HOS细胞中BCL2L1-3'UTR的679-686和1407-1413位miR-342-5p的直接结合(27). 正如预期的那样，miR-342-5p诱导WT-BCL2L1-3'UTR载体的荧光素酶活性大幅下降（70%，p<0.01），而抗miR342-5p逆转了这种下降。miR-4270的联合转染导致报告载体的荧光素酶活性显著降低（35%，p<0.05）。抗miR-4270的联合转染将荧光素酶活性恢复到miR-Ctrl水平，这与miR-4270%的抑制作用一致。因此，在HOS细胞中，miR-4270通过与BCL2L1型mRNA。

生物信息学分析表明，这两种miRNAs在MCL1-3'UTR中都有潜在的结合位点：miR-342-5p的核苷酸2427-2433之间，miR-4270的核苷酸1585-1591之间( 图7 ). MiR-342-5p没有降低WT-MCL1-3'UTR载体的荧光素酶活性，表明没有转录后调节MCL1公司根据Mcl-1蛋白表达分析，通过miR-342-5p表达mRNA( 图6 ). 令人惊讶的是，作为反miR-Ctrl，反miR-342-5p将RLU增加到了miR-Control级别之外（相对于miR-Ctrl80%）。与MiR-Ctrl相比，MiR-4270将MCL1-3'UTR载体的荧光素酶活性降低了15%，但这种抑制作用在统计学上并不显著。抗-miR-4270也具有抑制作用，表明miR-4270对荧光素酶活性具有非特异性作用。因此，尽管它对Mcl-1蛋白表达有抑制作用，但我们不能证实MCL1公司mRNA是HOS细胞中miR-4270的直接靶点。

4.讨论

骨肉瘤和软骨肉瘤是最常见的骨肉瘤形式。今天，骨肉瘤是一种治疗良好的肿瘤，考虑到联合化疗和手术的疗效。然而，对于有转移或复发的患者，生存率要低得多。对于软骨肉瘤来说，这些肿瘤对常规化疗和放疗具有抵抗力，手术仍是唯一有效的治疗方法。然而，肿瘤的位置可能不允许手术。治疗性miRNAs的使用具有多靶点方法的优势。此外，miRNAs可能会导致临床应用新的治疗靶点的发现(14,17,30,31).

在实时细胞分析中，在减少SW1353细胞增殖的miRNAs中，我们重点研究了四种可能靶向Bcl-2家族抗凋亡成员的miRNA。事实上，Bcl-xL和Bcl-2是治疗软骨肉瘤和骨肉瘤的有希望的靶点(20–24). 在之前的研究中，我们通过直接抑制Bcl-xL和Bcl-2证明了miR-342-5p对软骨肉瘤细胞的抑制作用(26). 我们还发现，通过直接抑制Bcl-xL和抑制表皮生长因子受体（EGFR）的表达，miR-491-5p是软骨肉瘤细胞中的凋亡细胞。在对骨肉瘤细胞进行的第二项研究中，我们证明了两种miRNAs对Bcl-xL的直接抑制，以及它们伴随的凋亡诱导(27).

在常压下，在玻璃培养板中对SW1353细胞进行高通量miRNAs筛选的RTCA和终点形态分析。然而，软骨肉瘤主要是缺氧性肿瘤。因此，我们在常氧和缺氧条件下，在传统的塑料培养板中对miR-16-1-3p、miR-646、miR-3667-3p和miR-4270进行了单独的功能验证。我们还对这些miRNAs的化学增敏作用感兴趣。不幸的是，我们没有证实所选miRNAs对SW1353软骨肉瘤细胞株的潜在细胞毒性作用。此外，与我们在高通量筛选中观察到的情况相比，在我们的实验培养条件下，测试的miRNAs没有化学增敏作用。然而，我们证明了miR-4270对HOS和MG-63骨肉瘤细胞株的抗增殖和细胞毒作用。我们发现miR-4270对SaOS-2骨肉瘤细胞株只有显著的抗增殖作用。此外，我们无法证明这四种miRNAs对三种骨肉瘤细胞系中的任何一种都具有潜在的化学增敏作用。

人类miR-16，也称为miR-16-5p，起源于两个基因座，MIR-16-1型和MIR-16-2型这两个基因座产生相同的引导链miR-16-5p，但产生不同的副链，miR-16-1-3p和miR-16-2-3p。Calin等人。建立MIR-16-1型大多数慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的基因座缺失和/或miR-16下调(32). 自这项研究以来，miR-16已被报道在许多类型的癌症中是一种抑癌剂，在某些类型的癌症中将是一种潜在的抑癌剂(33). 然而，对miR-16-1-3p的研究很少。关于骨肉瘤，与健康骨骼相比，骨肉瘤样本中miR-16-5p和miR-16-2-3p的表达下调，并且未检测到miR-16-1-3p表达(34). Maximov等人。（2019）证明了miR-16-1-3p、miR-16-2-3p和miR-16-5p的抑瘤特性体内以及它们减少入侵的能力在体外(35). 在我们的研究中，miR-16-1-3p仅在HOS细胞上诱导活性和增殖显著降低，转染72小时后我们未能证明其细胞毒或凋亡作用。与我们的研究相比，Maximov等人。（2019）稍后（慢病毒感染后5天）进行了细胞凋亡诱导分析(35). 此外，与我们的方法相反，他们使用稳定的克隆过度表达miRNAs，因为HOS多克隆培养物过度表达miRNA的速度过快(35). 因此，我们的实验方法可能不适合miR-16-1-3p在骨肉瘤细胞系和SW1353软骨肉瘤细胞系中诱导细胞死亡。

MiR-646在许多癌症中下调，越来越多的证据支持其抑癌作用(36). miR-646的功能已在骨肉瘤研究中进行过研究，但在软骨肉瘤研究中未进行过研究。两项研究表明，miR-646抑制U2OS细胞系的迁移和侵袭(37,38). 另一项研究表明，miR-646在四种骨肉瘤细胞系（MG-63、SaOS-2、HOS和U2OS）和骨肉瘤组织中下调(39). 此外，miR-646的低表达与转移有关。他们表明，在MG-63细胞中转染miR-646可以抑制细胞增殖、迁移和侵袭，但他们没有研究细胞死亡的诱导。他们得出结论，miR-646可能是骨肉瘤中的肿瘤抑制因子通过其直接靶点为成纤维细胞生长因子2（FGF2）。在我们的研究中，miR-646还能够显著降低HOS、MG-63和SaOS-2细胞的活性和增殖，但它不能在所有这些细胞系中诱导细胞毒性。因为它在HOS和SW1353细胞系中没有诱导细胞死亡，所以我们没有继续在其他细胞系中进行研究，也没有研究它的抗转移能力。进一步的调查可能会得出与Sun等人相同的结论。研究(39)，但我们专注于骨肉瘤细胞上更有希望的miR-4270。

据我们所知，对于miR-3667-3p，只有一项其他研究涉及其在癌症中的作用。MiR-3667-3p靶向前列腺癌中的lncRNA（长非编码RNA）PCAT-1（前列腺癌相关转录物-1）(40). PCAT-1通过c-Myc的转录后正调控促进前列腺癌细胞增殖。因此，MiR-3667-3p具有抗抑制剂特性，但在我们的研究中，尽管具有抗增殖作用，但我们没有证实其对任何研究细胞系的潜在细胞毒性作用。

MiR-4270似乎在癌症中起着双重作用。在肝细胞癌（HCC）组织和胃癌组织中下调(41–43). 通过直接靶向稳定蛋白-2（STAB2）抑制肝癌中癌细胞的增殖和转移(42). Circ_0005556，一种环状RNA，海绵状miR-4270，导致MMP19过度表达，进而导致胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭(43). 有趣的是，其他研究表明，循环miR-4270在转移性胃癌和乳腺癌患者中显示上调的水平，并有可能将其用作诊断或预后生物标志物(44,45). Hao等人。据报道，miR-4270的水平通过调节p53调节鼻咽癌细胞的辐射敏感性体内(46). 总之，这些结果表明，不同水平的miR-4270表达可能与不同的癌症相关，并且miR-4270%可能具有不同的功能。

在我们的研究中，在高通量筛选中，miR-4270在转染后96小时对SW1353软骨肉瘤细胞的抗增殖效果最佳，但在转染72小时后的功能分析中，我们未能验证其细胞毒性作用。可能需要更长的潜伏期来验证筛选期间获得的效果。然而，功能分析显示miR-4270在转染72小时后对HOS和MG-63骨肉瘤细胞株具有抗增殖和细胞毒性作用，但仅对SaOS-2骨肉瘤肿瘤细胞株具有抑制增殖作用。在我们的实验条件下，在任何细胞系中，在CDDP存在的情况下，我们都没有检测到这种miRNA的任何化学增敏作用。CDDP的亚致死剂量可能不足以揭示miR-4270对骨肉瘤细胞的化学增敏作用。在HOS和MG-63细胞系中，我们清楚地观察到在miR-4270处理下，PARP裂解和caspase-3裂解增加。此外，如miR-342-5p所示(27)miR-4270增加了这两种细胞系中caspase-3/7的活性，而我们在SaOS-2细胞中仅检测到PARP裂解。在我们之前的研究中，我们证明miR-342-5p在SaOS-2细胞中诱导细胞死亡，但未诱导caspase-3裂解和caspase-3/7活性，但我们检测到裂解PARP的诱导(27). annexin V/PI检测有助于证实这些结果，但miR-4270似乎至少在诱导HOS和MG-63细胞凋亡方面有效。

生物信息学分析表明，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1是miR-4270的潜在靶点。在三种骨肉瘤细胞系中，miR-342-5p显著降低了Bcl-2蛋白的表达，但miR-4270没有显著降低。然而，我们没有验证Bcl-2作为HOS细胞中miRNAs的直接靶点，正如之前对miR-342-5p的描述(27). 我们证明，miR-4270可显著降低HOS和MG-63细胞中Bcl-xL蛋白的表达，在SaOS-2细胞中的表达程度较低。我们首次证明Bcl-xL是miR-4270的直接靶点。我们还证明，miR-4270降低了Mcl-1蛋白的表达，尤其是在MG-63和SaOS-2细胞中。然而，我们没有证实Mcl-1是HOS细胞中miR-4270的直接靶点。此外，miR-4270能够增加促凋亡蛋白Bak的表达，尤其是在HOS和MG-63细胞系中。为了深入了解miR-4270的作用机制，我们可以使用选择性Bcl-xL抑制剂（WEHI-539，A-1331852）或抗Bcl-xL的siRNA来比较它们与miR-4270。

我们使用了三个来自年轻白人患者的骨肉瘤细胞系。细胞系没有同样的攻击性。HOS细胞系与SaOS-2和MG-63细胞系相比具有较高的侵袭性，而MG-63的侵袭/迁移能力低于SaOS-2细胞(47). 基因组分析揭示了所用三种骨肉瘤细胞系的关键差异。在MG-63和SaoS2细胞系中发现p53抑癌基因缺失和重排，未检测到p53表达。在HOS细胞中描述了p53编码序列中的点突变，导致突变型p53的过度产生(48). 此外，与非侵袭性细胞系相比，一些mRNA和miRNA在高度侵袭性骨肉瘤细胞系中的表达存在差异。然而，在侵袭性细胞系中显著上调或下调的miRNA列表中没有发现miR-4270(47). 可能需要进一步研究将miR-4270的差异效应与3个细胞系的遗传背景联系起来。

许多信号通路与骨肉瘤的肿瘤进展有关。Wnt/β-catenin信号传导已被证明在包括骨肉瘤在内的多种肿瘤类型中致癌(49). NF-κB似乎在骨肉瘤的恶性肿瘤中起着致病作用(50). 此外，NF-κB和Wnt/β-catenin通路之间的串扰将炎症与肿瘤发生联系起来(51). Raf/MEK/ERK信号通路的过度表达和异常激活可能调节骨肉瘤和其他恶性肿瘤的肿瘤增殖、迁移和转移(52). PI3K/Akt是OS肿瘤发生的关键驱动因素，随着mTOR抑制剂（PI3K/Akt途径最重要的下游分子）的开发，PI3K/Akt已被大量研究(53). 据我们所知，没有研究探讨miR-4270对这些信号通路的影响。这可以在未来进行探索。然而，我们的初步数据表明，MG-63细胞上AKT和ERK信号通路可能受到下游抑制（数据未显示）。

总之，我们证明了miR-4270对HOS和MG-63骨肉瘤细胞株的肿瘤抑制作用。MiR-4270对SaOS-2细胞株具有抗增殖作用和一些抗凋亡作用，但后者的作用不足以诱导该骨肉瘤细胞株的细胞死亡。同样，尽管miR-4270具有抗增殖作用，但在SW1353软骨肉瘤细胞系中也没有诱导细胞死亡。此外，我们发现miR-4270不会影响健康的原代人类关节软骨细胞（HAC）细胞周期，也不会导致任何细胞死亡( 图S8 ). 对于miR-342-5p(26)这两个实验表明其对非癌细胞的生物安全性。然而，还需要进一步的研究来验证miR-4270在体内研究或三维（3D）OS细胞培养模型。然而，miR-4270因此似乎根据肿瘤类型具有特定功能，有时它可以作为癌基因或如上所述的肿瘤抑制因子。此外，它可能有或多或少明显的效果，这取决于所使用的细胞系，特别是根据其分化状态的改变。

5.结论

我们的研究证明了miR-4270对HOS和MG-63骨肉瘤细胞株的抗增殖和细胞毒作用。MiR-4270也显著诱导这些细胞系的凋亡。在这里，Bcl-xL首次被确定为miR-4270的直接靶点。MiR-4270还降低了Mcl-1蛋白的表达，而增加了Bak的表达。我们已经证明了特异性靶向Bcl-xL和Bcl-2对软骨肉瘤和骨肉瘤细胞的治疗潜力。在这里，我们提供了额外的证据，证明Bcl-xL可以作为相关的治疗靶点，与骨肉瘤的化疗相结合，例如与BH3-类似衍生物一起抑制Bcl-xL家族成员并提高对常规化疗的敏感性。

数据可用性声明

本文中包含了研究中提出的原始贡献/ 补充材料 。可向相应作者进行进一步查询。

道德声明

该研究完全按照当地伦理委员会的指导方针进行，所有软骨样本均根据法国法律在捐赠者书面知情同意后采集。所有实验方案均经生物测定局（研究方案编号PFS21-025）和法国高等教育和研究部（人体样本研究伦理委员会CODECOH:DC 2014-2325）批准。

作者贡献

概念化：CV、AB、CD、LP、NG、FL、PG。方法学：CV，AB，EB，FR，FL，PG。形式化分析：CV；FB；MJ；AB；EB；NG；FL；PG。软件：AB、EB。验证：简历、佛罗里达州、职业高尔夫球州。调查：简历、FB、MJ、EB、佛罗里达州。资源：CD、LP、FR、NG、PG。数据处理：EB、CD。写作-原始草案编制：简历、FL。写作-审查和编辑：佛罗里达州、PG，可视化：简历、MJ，CD、NG、FL、PG；监督：佛罗里达州，职业高尔夫兰州。项目管理：佛罗里达州。资金获取：CD、有限合伙公司、佛罗里达州，PG。所有作者阅读并批准了最终手稿。

致谢

简历是法国高等教育和研究部博士奖学金的获得者。MJ得到了由GIS CENTAURE（马研究联盟）和诺曼底地区委员会共同资助的博士研究金的支持。我们感谢Mathieu Meryet-Figuieère（UNICANCER综合癌症中心F.Baclesse，INSERM U1086 ANTICIPE）在生物信息学分析方面的帮助。

资金筹措表

这项工作得到了诺曼底地区委员会通过“紧急”计划（CD、LP和PG）和“RIN Recherche OncoThera”计划（LP和PG）的支持，以及诺曼底“法律控制癌症”联盟（Orne和Seine海事委员会）向佛罗里达州提供的两笔赠款，由法国政府和欧洲共同体（欧洲区域发展基金）向PG提供。xCELLigence仪器（诺曼底大学的核心设施联邦结构4206 ICORE）由欧洲共同体（ERDF）和综合癌症中心F.Baclesse（Caen）资助。这些资金来源没有参与研究设计、数据收集、分析和解释，也没有参与撰写手稿或决定将手稿提交出版。

利益冲突

作者声明，该研究是在没有任何商业或金融关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商备注

本文中表达的所有声明仅为作者的声明，不一定代表其附属组织的声明，也不一定代表出版商、编辑和审稿人的声明。任何可能在本文中进行评估的产品，或制造商可能提出的索赔，都不受出版商的保证或认可。

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文章来自肿瘤学前沿由以下人员提供Frontiers Media SA公司