胰腺癌细胞对隔离应激的反应上调LPAR4，以促进ECM富集的小生境并支持肿瘤的发生

LPAR4对于驱动肿瘤的发生是必要且充分的

对于TNMplot公共数据集¹⁹,LPAR4号机组胰腺癌（PAAD）的基因表达显著高于正常胰腺(图2a). 虽然正常胰腺核心呈阴性，但15个PDAC核心中有6个表现出相对较高水平的LPAR4表达(扩展数据图2a). 临床上LPAR4号机组，对TCGA PAAD数据集的分析表明LPAR4号机组mRNA表达与较短的无复发生存期（RFS，P（P）=0.017），总体生存率趋势相似(P（P）=0.18) (图2b)，表示高LPAR4号机组胰腺癌患者的表达与较差的预后相关。

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图2：

LPAR4号机组胰腺癌患者的表达及其与肿瘤发生的关系。

一，TNM图显示LPAR4号机组胰腺癌（PAAD）和正常胰腺的基因表达。条形图表示每组的中值。b条、低水平与高水平患者的无复发和总体生存率LPAR4号机组TCGA PAAD数据集中的表达式。c（c），在皮下肿瘤模型中，对照细胞和LPAR4号机组用ELDA软件计算表达调控细胞。P值通过Pearson的双尾检验获得。d日，在原位肿瘤模型中，使用ELDA软件计算Colo-357-sh-CTRL+荧光素酶细胞和Colo-357-2sh-R4.1+荧光素酶细胞之间的肿瘤起始细胞频率（TIC）（95%间隔）。P值通过Pearson的双尾检验获得。e（电子），异位的影响LPAR4号机组在甲基纤维素培养基中生长的细胞在瘤球形成上的表达，绘制为相对于表达空载体对照的细胞的折叠变化。数据为平均值±标准差（分别为MiaPaCa2、Colo-357和79E细胞的3、4、5个独立实验）。（f），各组菌落数相对于对照组的折叠变化（无压力）。数据为平均值±标准差（n=79E用H处理的5个独立实验₂哦₂79E细胞经血清剥夺后n=4，Colo-357和34E细胞的n=3个独立实验）。克，在无血清培养基中培养48小时的+EV或+R4细胞中MitoSOX信号的中值荧光强度（MFI）。数据为平均值±标准差（n=3个独立实验）。小时，在无血清培养基中培养48小时的用sh-CTRL、sh-R4.1或sh-R4.2稳定转染的79E细胞中MitoSOX信号传导的相对MFI。数据为平均值±标准差（n=3个独立实验）。采用双尾非配对单样本t检验进行统计分析。源数值数据可在源数据.

评估LPAR4号机组，我们平稳地撞倒了LPAR4型使用shRNA（sh-R4）或体外表达LPAR4号机组（+R4）在多种胰腺癌细胞系和患者衍生异种移植模型中的表达(扩展数据图2b). 使用限制稀释分析来衡量LPAR4号机组体内皮下肿瘤开始时，TIC频率降低了LPAR4号机组异位击倒和增强LPAR4号机组表达式(图2c和补充表1). 使用原位限制稀释肿瘤起始试验和非侵入性生物发光成像，我们同样发现，TIC频率对于具有LPAR4号机组击倒(图2d,补充表2、和扩展数据图2c). 操纵时LPAR4号机组在无应激条件下，表达对体外生长没有影响(扩展数据图2d–e（电子）)或体内肿瘤生长(扩展数据图2f)，异位表达LPAR4号机组可以帮助细胞克服3D培养中肿瘤球体形成过程中施加的隔离压力的挑战(图2e). 同样，诱发LPAR4号机组表达（过氧化氢、血清剥夺）也增强了肿瘤球的形成LPAR4号机组-依赖方式(图2f). 作为应力容限的附加读出，LPAR4号机组对于减轻受到血清剥夺应激的细胞中线粒体超氧化物（MitoSOX）的积累是必要且充分的(图2g–小时). 相反，击倒LPAR1号机组，Colo-357胰腺癌细胞上组成性表达的LPAR(扩展数据图1a和扩展数据图2g)，在2D和3D中同样受损的细胞生长(扩展数据图2h)这表明LPAR1在细胞生存或增殖中起着更广泛的作用。总之，这些发现表明胰腺癌细胞可以通过上调表达来克服肿瘤发生和隔离应激期间的生长限制条件LPAR4号机组.

压力抑制miR-139-5p以释放LPAR4上的刹车

miRNAs调节基因表达，允许对应激或损伤进行重新编程²⁰促进胰腺干细胞的功能²¹和其他癌症²².确定miRNA是否可以解释LPAR4号机组为了应对压力，我们使用了多个miRNA-靶向预测工具来生成一系列假定的LPAR4-靶向miRNAs，然后评估这些miRNA与TCGA PAAD数据集生存率的对应关系。这种方法最受欢迎的是miR-139-5p，高队列（50.1个月）的中位生存率大大超过低队列（19.9个月）(补充表3和图3a). 考虑到miR-139-5p已被确定为胰腺癌的抑癌基因²³，并且由于预测hsa-miR-139-5p能够识别3'UTR上的8聚体结合序列LPAR4号机组发起人(图3b)，我们考虑了压力如何影响miR-139-5p。值得注意的是，多种压力源上调LPAR4号机组和下调miR-139-5p，而另一个miRNA预测结合LPAR4号机组（miR-138-5p）无应激反应(图3c). 此外，自我更新细胞（即二级球体）LPAR4号机组与2D条件下生长的细胞相比，mRNA表达显示miR-139-5p水平显著降低，但miR-138-5p水平没有降低(图3d). 操纵LPAR4号机组未改变miR-139-5p水平(扩展数据图3a)，表明miR-139-5p不是LPAR4型.

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图3：

压力抑制miR-139-5p释放刹车LPAR4号机组表达。

一，TCGA PAAD数据集miR-139-5p高与低的总体生存概率。b、，LPAR4 3’UTR和hsa-miR-139-5p之间有8个寡核苷酸配对。c（c），相对mRNA水平LPAR4号机组在Colo-357细胞中，miR-139-5p和miR-138-5p被血清剥夺应激（n=3个独立实验）、缺氧（n=30个独立实验，miR-138-5除外n=2个独立试验）或氧化应激（n=4个独立实验。d日，从Colo-357或34E细胞生长的次级甲基纤维素球中miR-139-5p和miR-138-5p的相对mRNA水平，与它们在2D细胞中的表达相比。e（电子），相对mRNA水平LPAR4号机组在Colo-357（n=7个独立实验）或79E细胞系（n=4个独立实验。（f）在正常氧和缺氧条件下，用干扰控制miRNA或miR-139-5p模拟物处理的三个细胞系中LPAR4蛋白水平。数据是三个独立实验的代表。克，mRNA水平LPAR公司s和FOXO1系列用miR-139-5p抑制剂处理的34E细胞与用干扰对照处理的细胞相比（n=3个独立实验）。小时，34E（3个独立实验）或Colo-357（4个独立实验。我，miR-139-5p抑制剂对LPAR4号机组以及有或无Colo-357细胞中肿瘤球的数量LPAR4号机组敲除（n=3个独立的实验用于肿瘤球试验，n=4个独立的试验用于定量RT-PCR试验）。j个，miR-139-5p模拟物对LPAR4号机组以及有无Colo-357细胞中肿瘤球的数量LPAR4号机组异位表达（肿瘤球试验n=3个独立试验，定量RT-PCR试验n=5个）。数据表示为平均值±标准差c（c）-e（电子）和g-i公司使用双尾非配对单样本t检验进行统计分析(c-e公司和g-j公司). 源数值数据和未处理的斑点可在源数据.

用miR-139-5p模拟物转染细胞，以抵消应激期间miR-139-5 p的下调。miR-139-5p模拟物阻止缺氧诱导的LPAR4型(图3e–（f）)而抗miR-139-5p抑制剂足以增加LPAR4号机组在没有压力的情况下表达(图3g和扩展数据图3b)以及已知的miR-139-5p目标，FOXO1系列（参考。^24,25). 使用LPAR4-3'UTR荧光素酶报告子分析，我们观察到miR-139-5p与LPAR4-3’UTR直接结合(扩展数据图3c)，通过miR-139-5p模拟物降低，通过抗miR-139-5 p增加(图3h). 在未受应激的细胞中，LPAR4号机组抗miR-139-5p增加的表达和肿瘤球形成可通过shRNA介导的敲除LPAR4号机组(图3i和扩展数据图3d)，同时异位LPAR4号机组可以挽救miR-139-5p模拟物对肿瘤球体形成的抑制作用(图3j). 因此，miR-139-5p对肿瘤球形成的影响主要是由于其调节LPAR4号机组为了支持这一点，在肿瘤细胞中miR-139-5p的几个基因靶点中，LPAR4号机组miR-139-5p模拟物持续降低的幅度最大(扩展数据图3e). 总之，这些发现表明LPAR4号机组表达依赖于应激诱导的miR-139-5p表达缺失，揭示了胰腺癌细胞可以利用应激反应途径克服隔离应激。

LPAR4基因特征包括ECM相关基因

为了进一步研究胰腺癌细胞如何利用LPAR4获得干样特性，患者来源的79E胰腺癌细胞具有稳定的异位表达LPAR4号机组（+R4）或对照细胞用或不用典型LPAR4配体LPA处理，然后采集用于RNA-seq分析。正如预期的那样，控制细胞对LPA的反应是上调一组差异表达基因（DEG）（基因簇1），这些基因簇促进基因本体（GO）术语，如细胞增殖、生长因子活性、细胞间信号传导和信号转导(图4a). 令我们惊讶的是，与+EV细胞相比，一组基因（基因簇3）在+R4细胞中有差异表达，并且与LPA无关，尤其包括与细胞外基质（ECM）蛋白和组织相关的多个GO术语(图4a). 使用单个qPCR分析在4个配对细胞系中验证了该簇中的基因(图4b和扩展数据图4a). 因此，上调表达的细胞LPAR4号机组无论是否接触LPA，都能获得促肿瘤功能的子集，这支持了LPAR4允许细胞在肿瘤发生期间克服隔离压力的观点，即当获得来源于血管、基质或免疫细胞的LPA的途径有限时。

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图4：

共有的差异表达基因LPAR4号机组-表达细胞和患者肿瘤包括细胞外基质相关基因。

一、载体控制（+EV）细胞和LPAR4（+R4）细胞分别用或不用1μM LPA处理2小时。样本通过RNA-seq和DEseq2差异表达分析进行分析。无监督聚类分析揭示了与LPA治疗和LPAR4型表达。顶级基因本体（GO）术语说明LPA诱导或LPAR4号机组-诱导对基因表达的影响。b条，定量RT-PCR确认两对+EV与+R4细胞中与ECM相关的LPAR4调节基因，这两对细胞生长在含碳剥离FBS的培养基中。所有mRNA水平均归一化为+EV细胞。c（c）进行重叠分析以确定79E+R4细胞中通常上调或下调的二甘醇LPAR4号机组-TCGA PAAD数据集中的高肿瘤。79E+R4细胞和TCGA R4高肿瘤之间重叠的DEG的完整列表如所示补充表4.d日，显示H的IC50值的图表₂哦₂或吉西他滨在79E+EV和79E+R4细胞之间，表示为平均值±标准差（n=3个生物独立实验），由GraphPad Prime 9计算。e（电子），异位的影响LPAR4号机组在甲基纤维素培养基上生长的细胞在含有木炭剥离的FBS培养基中的肿瘤球形成表达，绘制为相对于表达空载体对照的细胞的折叠变化。数据以平均值±标准差表示（79E细胞的n=4个独立实验，Colo-357和MiaPaCa2的n=5）。使用双尾非配对单样本t检验进行统计分析(b条和d-e公司). 源数值数据可在源数据.

接下来，我们进行了重叠分析，以从TCGA PAAD数据集中确定79E+R4细胞和LPAR4高患者肿瘤之间的共同DEG(图4c和补充表4). 上调的DEG包括几个ECM基因，这些基因在胰腺癌进展中起到了已知的作用，如纤维连接蛋白(FN1型)²⁶LPAR4+细胞和肿瘤中较低的DEGs包括胰腺谱系标记物FOXA3公司（参考。²⁷)，表明LPAR4号机组表达与未成熟或去分化表型相关。值得注意的是，上调的DEG与正风险比相关（表明无复发生存率低），而下调的DEG则与负风险比相关(补充表4). 所有危险比均达到统计学显著性(P（P）<0.05），表明被鉴定为LPAR4基因特征的一部分的基因在人类胰腺癌进展中发挥作用。

根据LPAR4调节的原癌基因特征不需要外源性LPA治疗的观察结果LPAR4号机组允许细胞生长在含有煤焦样血清（耗尽生物活性脂质，包括LPA）或无血清的培养基中，以耐受H诱导的更高水平的应激₂哦₂或吉西他滨(图4d和扩展数据图4b). 同样，异位的能力不需要外源性LPALPAR4号机组促进甲基纤维素或悬浮培养物中3D肿瘤球的形成(图4e和扩展数据图4c). 因此，抗氧化基因的表达二氧化硫3在没有LPA的情况下，+R4细胞中显著升高(扩展数据图4d). 有趣的是，34E+R4细胞显著增加了胰腺CSC标记物的表达可编程只读存储器1,EPCAM公司、和CD44细胞，而79E+R4细胞表达较高的ALDH1A1型(扩展数据图4d)表明+R4细胞的表型在一定程度上与CSC人群重叠，这似乎与LPA无关。总之，这些发现表明获得LPAR4的胰腺癌细胞可以自主产生细胞周基质并获得TIC的特性。值得注意的是，即使在周围微环境中，如缺乏血管、免疫细胞或基质细胞作为胰腺癌LPA来源的微环境中对LPA的获取有限时，也会出现这种情况^12,28.

LPAR4促进FN1的细胞自主生成

ECM蛋白对癌症的发展和进展具有深远的影响²⁹在ECM相关基因中LPAR4号机组，我们对FN1型因为它与癌干和肿瘤发生有关^30–32，生物特征也是由LPAR4号机组事实上LPAR4号机组和FN1型TCGA PAAD数据集的mRNA表达(P（P）<0.0001) (图5a)和原位PDX肿瘤(P（P）=0.0180），而吉西他滨治疗的PDX肿瘤同时表达高水平的LPAR4型和FN1型(图5b). 根据观察LPAR4号机组,FN1型PAAD肿瘤的表达也显著高于正常胰腺(扩展数据图5a). 重要的是，对TCGA PAAD数据集的分析表明FN1型表达与较低的总生存率和无复发生存率显著相关（两者P（P）<0.05）(图5c).

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图5：

LPAR4号机组表达促进FN1的细胞自主生成。

一，之间的表达式相关性LPAR4号机组和FN1型来自TCGA PAAD数据集（n=177个样本）。皮尔逊相关系数r=0.63和双尾P（P）<0.0001.b条，之间的表达式相关性LPAR4型和FN1型来自使用载体对照（n=3个生物独立样本）或吉西他滨（n=5个生物独立样品）治疗的原位小鼠模型的PDX肿瘤。皮尔逊相关系数r=0.80和双尾P（P）=0.018.c（c）TCGA PAAD数据集中FN1低表达与高表达患者的总体无复发生存率。d日79E（n=10个生物独立样本）、Colo-357（n=4个生物独立标本）或34E（n=5个生物独立样品）中人类FN1免疫组织化学染色的代表性图像，这些肿瘤由100万（1M）细胞注射或300个细胞注射形成。比例尺为50μm。电子-传真Western blot和免疫染色显示FN1蛋白在胰腺癌细胞中的表达LPAR4号机组（+R4）vs.在含有碳条FBS的培养基中培养72小时的空载病媒控制（+EV）。数据代表了三个生物实验。克，在nu/nu小鼠胰腺植入后第15天采集的Colo-357+EV与Colo-357+R4肿瘤中人类FN1免疫组织化学染色的代表性图像。下部面板中的图像突出显示了基质区域的FN1染色。数据代表了三个生物样本。如图所示，比例尺为100μm或20μm。小时、缺氧和LPAR4号机组FN1蛋白表达的敲低。数据代表了三个生物实验。源数值数据和未处理的斑点可在源数据.

FN1型由于选择性剪接，有多达20种不同的亚型，并且含有额外结构域A（EDA）或EDB区域的亚型似乎更容易致癌³³因此，我们询问LPAR4是否诱导FN1型mRNA包含EDA或EDB，或两个结构域。如所示扩展数据图5b，+R4细胞表达相当的mRNA水平FN1型,FN1-EDA公司、和FN1-EDB公司，表明LPAR4诱导FN1型可能同时包含癌前EDA和EDB域。如LPAR4所示(图1a)，与100万细胞形成的肿瘤相比，注射300个细胞形成的隔离应激肿瘤中FN1的表达更高(图5d). 与LPAR4基因特征一致，在缺乏外源性LPA的情况下，+R4细胞显示出较高水平的FN1蛋白(图5e–（f）). 在原位肿瘤模型中，与Colo-357+EV肿瘤细胞相比，Colo-357+R4肿瘤细胞周围的基质中FN1染色更丰富(图5g)提供了LPAR4诱导肿瘤内在FN1在体内产生和沉积的证据。此外，暴露于缺氧中的细胞显示FN1增加，而LPAR4敲除阻止了FN1的增加(图5h和扩展数据图5c). 这些发现表明，LPAR4的表达改变了胰腺癌细胞的表型，为其提供了原癌FN1的细胞自主来源，创造了TIC生态位以支持肿瘤形成早期的生存。

试剂、化学品和抗体。

溶血磷脂酸（18:1）（Avanti Polar Lipid，Alabaster，AL，#857130）在dH2O中稀释至5mM，在37°C下超声15分钟，并新鲜使用。使用CellTiter-Glo试剂盒（Promega，Madison，WI，#G7573）测量细胞活力。盐酸吉西他滨（#S1149）、紫杉醇（NSC 125973）和过氧化氢（H₂哦₂)分别从Selleck Chem（德克萨斯州休斯顿）和Thermo Fisher Scientific（H325-100）购买。木炭：右旋糖酐剥离胎牛血清（FBS）购自GeminiBio（#100–119）。Ipatasertib（GDC-0068，HY-15186）和666-15（HY-101120）购自MedChemExpress（新泽西州蒙茅斯枢纽）。本研究中使用的主要抗体包括：LPAR4（Proteintech，#22165–1-AP，1:1000用于western blots）、LPAR4，（Thermo Fisher，#PA5–49727，1:50用于免疫组织化学）、Vinculin（Santa Cruz Biotechnology，#sc-25336，H-10，1:5000用于western blot）、GAPDH（CST，#5174，D16H11，1:3000用于westernblots），β-肌动蛋白（CST，#8457，D6A8，1:5000用于western blots），纤维结合蛋白（CSC，#26836，E5H6X，1:1000用于westernblots，1:200用于免疫组织化学和免疫荧光），磷光体AKT-Ser473（CST、#9271，1:1000 for western-blots），AKT（CST；#9272，1:1000表示western-blots）、磷光体CREB-Ser133，CREB（CST，#9197，48H2，1:1000用于western blots）、磷酸化GSK-3β-Ser9（CST、#5558，D85E12，1:1000 for western blot）、GSK-3α（CST）（#12456，D5C5Z，1:1000表示western blots）和抗α5整合素抗体（Sigma-Aldrich，MAB1956Z，P1D6）。如前所述，产生抗αVβ3整合素抗体（LM609）⁴⁹.用于western blots的二级抗体包括抗兔IgG（CST，#7074,1:3000用于westernblots）和抗鼠IgG。

细胞系。

胰腺导管腺癌细胞系（XPA1、MiaPACA-2）来自美国型培养物收集中心（ATCC、Manassas、VA）。79E和34E细胞来源于Andrew Lowy博士（加州大学圣地亚哥分校）建立的患者衍生异种移植物（PDX）模型。胰腺癌细胞系Colo-357的快速生长变体是Shama Kajiji博士和Vito Quaranta（斯克里普斯研究所）赠送的礼物。细胞在含有10%FBS（Gibco）和1%青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）的DMEM中生长，并冷冻保存为低通库存。使用PCR支原体检测试剂盒（加利福尼亚州圣地亚哥Genlantis）定期对所有细胞系进行支原体污染检测。所有细胞株检测支原体阴性。

基因敲除和异位表达。

用载体控制或LPAR4号机组使用慢病毒系统。使用Lipofectamine 3000（ThermoFisher Scientific）在与慢病毒骨架构建物和包装载体（ps-PAX2和VSVG）共同转染的293T细胞中产生慢病毒。在敲除实验中，使用Lipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）或shRNA（Sigma-Aldrich）通过慢病毒系统转染细胞siRNA（Sigra-Aldrich）。针对感兴趣基因不同区域的两个siRNAs或shRNAs被用于基因敲除。异位表达和敲除作用通过qRT-PCR得到证实。使用Lipofectamine RNAiMAX进行miRNA抑制剂（Millipore Sigma）或模拟物（Millipore Sigma）转染。转染后48小时收集细胞用于RNA分离和qPCR分析或用于甲基纤维素瘤球形成分析。补充表5显示了构建体、siRNA和miRNA试剂的详细信息。

细胞应激在体外的应用。

低氧：约50%汇合处的细胞在1%的O中生长₂缺氧室（Coylab）或21%O₂常温室（常规组织培养室）在2D单层培养上培养72小时。氧化应激：5 X10⁵细胞接种在12孔超低附着板（Corning，3D）中，并用不同剂量的H₂哦₂48小时。血清剥夺：5 X10⁵细胞接种在2D（6孔板）或12孔超低附着板（Corning，3D）上，在10%常规FBS或0%FBS补充培养基中培养48小时。在细胞收获前，用10%常规FBS补充培养基替换实验细胞和对照细胞培养基2小时。化疗应激：5 X10⁵在不同剂量吉西他滨或紫杉醇治疗前一天，将细胞接种在12孔超低附着板中24小时。

皮下和原位肿瘤研究。

实验是按照协议进行的{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“S05018”，“term_id”：“89429”，“term_text”：“pir||S0501八”}}S05018号加州大学圣地亚哥分校动物护理和使用委员会根据NIH《实验动物护理和利用指南》批准。所有实验均使用6-8周龄雌性免疫受损nu/nu小鼠（马萨诸塞州威明顿市查尔斯·里弗实验室）。小鼠在约22摄氏度的室温和40–60%的湿度下，通过楼宇控制管理系统进行监测，以12小时的光/暗周期（7:00至18:00）进行饲养。IACUC允许的最大肿瘤体积为2×10^三毫米^三未超过。

采用限制稀释试验估计肿瘤起始细胞的频率。简单地说，将100万、100K、10K、1K、100或10个细胞悬浮在Hanks平衡盐溶液和苯酚无红基底膜基质（BD Biosciences，San Diego，CA）的1:1混合物中，然后皮下注射。每周对小鼠进行两次可触及的肿瘤检查。结果以每注射肿瘤数量观察到的肿瘤数量（在指定终点）制成表格，并使用ELDA软件计算肿瘤起始细胞的频率⁵⁰.

根据极限稀释实验，300细胞注射的肿瘤摄取率约为50%，100万细胞注射的为100%。因此，我们推断，注射300个细胞后形成的肿瘤富含肿瘤干细胞或自生细胞。将300或100万个肿瘤细胞皮下注射到小鼠的侧面，每周检查两次是否有可触及的肿瘤。观察到肿瘤后，立即采集肿瘤，将其切成块，并使用玻璃组织研磨机和高纯度miRNA分离试剂盒（Roche）中20%的结合缓冲液在冰上研磨，以进行组织匀浆。按照制造商的方案，使用组织匀浆后收集的上清液，使用高纯度miRNA分离试剂盒（Roche）分离总RNA。

对于300细胞注射异种移植模型，在收获前48小时，用FN1 siRNA或打乱的siRNA转染+EV或+R4细胞，然后将300个细胞与无酚红基底膜基质（1:1比例）混合后皮下注射到小鼠体内。在第20天，对形成的可触及肿瘤的数量进行计数。

为了在原位模型中启动肿瘤，首先用荧光素酶慢病毒转导Colo-357-sh-CTRL或sh-R4.1细胞。将具有同等水平的萤光素酶活性的细胞植入nu/nu小鼠的胰腺中。通过使用非侵入性生物发光成像，每周两次监测小鼠胰腺中的肿瘤起始。。请注意，所有小鼠在注射D-荧光素（L9504，Sigma-Aldrich）10分钟后进行成像。使用ELDA软件分析肿瘤起始细胞的频率⁵⁰.

胰腺癌患者衍生异种移植物研究。

涉及患者样本的研究遵循加州大学圣地亚哥分校机构审查委员会（IRB）批准的方案（IRB编号：181755），所有患者均获得同意，未获得补偿。患者的信息（性别和年龄）被蒙蔽，以保护患者的机密性。根据加州大学圣地亚哥分校动物护理和使用委员会批准的方案S09158，按照NIH《实验动物护理与使用指南》进行患者衍生异种移植物小鼠研究。简而言之，1–2毫米^三PDX片段（n=8例患者肿瘤样本）植入NOD胰腺。Cg公司-Prkdc公司^{科学情报部} Il2rg公司^tm1Wjl公司/SzJ（NSG）小鼠。每周超声成像监测肿瘤生长。一旦肿瘤大小达到50–100 mm^三，随机招募小鼠，然后用载体或100mg/kg吉西他滨（腹腔注射）每周治疗两次，持续6周。一旦对照组肿瘤直径达到2.0 cm^三，处死所有小鼠进行肿瘤收获和qPCR分析。

定量RT-PCR和RNA-Seq。

使用RNeasy RNA纯化试剂盒（马里兰州日耳曼镇齐根）收集RNA。在指定的时间点和条件下采集细胞。用1X HBSS（Gibco，#14025076）清洗粘附（2D）细胞两次，并在Buffer RLT（Qiagen）存在下刮去。在超低附着板（Corning，#3473）中生长的细胞通过离心（300Xg，5分钟）获得，并用1X HBSS洗涤两次，然后用缓冲液RLT裂解。cDNA是使用高容量cDNA逆转录试剂盒（ThermoFisher Scientific）合成的，并在带有SYBR Green（加利福尼亚州欧文市BioRad）的LightCycler上进行RT-PCR。通过将目标Ct值与五个看家基因的Ct几何平均值进行比较，对每个目标基因的表达进行标准化，RPL37A型,ACTB公司,管壳，VCL和间隙。引物序列列于补充表6对于RNA-seq实验，按照制造商的说明，使用RNeasy RNA纯化试剂盒（Qiagen）提取RNA。按照制造商的协议，使用NEBNext Ultra RNA文库准备试剂盒（美国NEB），每个样品总共使用1μg RNA来生成RNA-seq文库。PCR产物被纯化（AMPure XP系统），文库质量在安捷伦生物分析仪2100系统上进行评估。根据制造商的协议，在Illumina Novaseq测序仪上对索引编码样本进行聚类。随后，在Illumina Novaseq机器上对RNA文库进行测序，并生成配对读码。Python软件包HTSeq用于生成每个基因的读取计数，并使用R软件包DESeq2（v.1.28.0）进行分析。Benjamini和Hochberg校正用于计算调整后的P（P）差异表达基因的值（p.adj）。p.adj<0.01被认为是差异表达的基因。热图是使用Java Treeview（v.1.1.6r4）生成的。按照制造商的方案，使用高纯度miRNA分离试剂盒（Roche）分离总RNA（包括小RNA）。合成了miRNA的cDNA，并应用干环RT-PCR方法评估感兴趣的miRNA的表达，遵循Xie等人详细描述的方案⁵¹扩增所有miRNA的PCR周期为：第一阶段：94℃，3分钟，1个周期；第二阶段：95°C，15秒；60°C，45秒；45个周期；第三阶段：分离分析。通过将目标Ct值与两个管家miRNA U6和miR-16-5p的Ct几何平均值进行比较，对目标miRNA的表达进行标准化。miRNA表达的引物序列列于补充表6.

LPAR4–3'UTR荧光素酶报告分析。

LPAR4–3'UTR荧光素酶报告质粒（HmiT099310-MT05）和对照质粒（CmiT000001-MT05）购自GeneCopoeia。简言之，在第1天使用脂质体3000（ThermoFisher Scientific）将LPAR4–3'UTR报告质粒或对照质粒转染细胞，然后在第2天分别使用脂质体RNAiMAX（Thermo Fisher科学）将100 nM miR-139-mimic或抗-miR或干扰对照模拟物转染细胞。在第4天，通过使用分泌对双荧光检测试剂盒（LF031，GeneCopoeia）分别检测每个样品的高斯荧光素酶和分泌碱性磷酸酶（SEAP）荧光素酶活性。

染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR分析。

ChIP试剂盒是从Cell Signaling（SimpleChIP Plus Chromatin IP试剂盒，#9005）购买的，实验是根据Cell Signoaling Technology提供的协议进行的。简而言之，在室温下使用37%甲醛交联10分钟之前，细胞在含有90%汇合度的木炭剥离FBS培养基中生长。在三组20秒脉冲和三组30秒脉冲之间的湿冰上消化和超声处理细胞核/染色质（Branson Digital Sonifier 450）。染色质裂解物与抗CREB抗体（#4820，细胞信号传导）或抗IgG（#2729，细胞信号传递）在4°C下孵育并旋转过夜。洗脱的DNA产物随后用于实时qPCR分析。检测FN1外显子1的引物可在补充表6PCR反应程序的细节是：初始变性：95°C，3分钟；变性：95°C，15秒；退火和拉伸：60°C，60秒；重复步骤变性、退火和延伸，共40个循环。

蛋白质斑点。

如前所述进行蛋白质印迹⁴⁵简而言之，在上述时间点和条件下采集细胞。用1X HBSS冲洗粘附（2D）细胞三次，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1X RIPA缓冲液或含有还原剂的2X Laemmli样品缓冲液中刮去。悬浮培养的细胞（3D）通过离心（300Xg，5分钟）获得，并用1X HBSS洗涤两次，然后用上述细胞裂解缓冲液裂解。进行BCA分析（Thermo Fisher Scientific），并将裂解液归一化。将含有还原试剂的样品缓冲液添加到1X RIPA缓冲液裂解液中，然后在95°C下加热5分钟。将20μg蛋白质加载到SDS-PAGE凝胶上。封闭和探测是在5%无脂肪牛奶+TBS-T缓冲液中进行的。ECL试剂（Thermo Fisher Scientific）用于显示蛋白质条带。

甲基纤维素瘤球形成试验。

按照制造商的说明进行甲基纤维素瘤球形成分析。简单地说，用1x HBSS清洗细胞，并在300 X g下离心5分钟，通过台盼蓝排除试验计算细胞数量。简单地说，将4000个细胞混合在1mL甲基纤维素储备培养基（明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统HSC001）中的24孔非处理板（科宁）中，顶部加1mL 10%常规FBS或10%木炭剥离FBS补充培养基。12天后，使用AmScope显微镜（MU1603）采集每个孔的低倍图像和每个孔内的3个高倍随机场。使用图像J（NIH，MD）计算每个场肿瘤球的数量和面积百分比。

流式细胞术检测线粒体超氧化物（MitoSOX）。

MitoSOX红色（Thermo Fisher，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M36008”，“term_id”：“214108”，”term_text“：”M36008“}}M36008型)按照制造商的说明进行染色。简单来说，5X10⁵细胞接种在无血清培养基中的6孔组织培养板上48小时。细胞用1 X HBSS洗涤两次，并用0.5%胰蛋白酶缓冲液分离，然后用1 X HBSS洗涤，并用300 X g离心5分钟两次。随后，在流式细胞术分析之前，用5μM MitoSOX试剂在37°C下对细胞进行染色10分钟，并避光。该分析的选通策略示例见补充图数据采用FlowJo.v10进行分析。

免疫组织化学染色。

根据制造商的方案，使用LPAR4抗体（Thermo Fisher，#PA5-49727）或FN1抗体（CST，#26836，E5H6X）对人类PDAC组织芯片（US Biomax PA484a）或福尔马林固定石蜡包埋异种移植瘤中的LPAR4或FN1进行免疫组化染色。随后，在纳米动omer载玻片扫描系统（滨松）上对载玻片进行成像。制造商对LPAR4抗体进行了免疫组化应用验证，并通过对79E+EV和79E+R4细胞产生的原位异种移植瘤进行染色进行了内部验证(扩展数据图8).

免疫荧光染色。

简单地说，细胞生长在8孔室载玻片上（Nunc^™泰克实验室^™室滑，Thermo Scientific），并在室温下用4%甲醛固定15分钟。然后，将细胞与1:1000稀释度的一级抗体（抗FN1）在4°C下孵育过夜，然后在1:2000稀释度下培养二级抗体1小时，并在室温下进行DAPI染色5分钟。图像由尼康Eclipse C1共焦显微镜采集，并用NIS-Elements Viewer 5.21进行分析。

无细胞细胞外基质的生产和测试。

+将EV或+R4细胞融合接种在无血清培养基中的6或96周组织培养板（Corning）上72小时，以沉积细胞外基质（ECM）。然后按照既定方案用20%氢氧化铵溶液去除细胞⁵²对于细胞生长试验，1X10⁵细胞接种在预先涂有+EV（ECM-EV）或+R4（ECM-R4）细胞胞外基质的6孔板上，在无血清的情况下培养12天。对于H₂哦₂和吉西他滨耐药试验，2X10⁴将细胞接种在96-well板上，板上预先涂有ECM-EV、ECM-R4或ECM-R4FN1敲除物，不含血清。第二天，用不同剂量的H处理细胞₂哦₂或吉西他滨，或与抗体P1D6（5μg/mL）或抗体LM609（5μg/mL）联合使用长达72小时。活细胞的数量通过CellTiter-Glo试剂盒（Promega）进行评估。

我们感谢Alex Reiss、Molly Morgan和Mahima Advani的技术支持。本研究由加利福尼亚大学烟草相关疾病研究计划（CW，T29FT0343）资助，并由美国国立卫生研究院（NIH）授予的资助，包括T32CA009523（TR）、T32OD017863（HIW）、T32 HL086344（HIW。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有任何作用。