将非活性RNA结合小分子编程为生物活性降解剂

摘要

主要

RNA在健康和疾病生物学中的重要性已被充分证明²，分别为化学生物学研究功能或干预功能障碍提供了机会。RNA的基于序列的靶向性通常是通过与核糖核酸酶结合并招募核糖核酶来切割靶点的互补寡核苷酸来实现的^三这种方式最适合靶向RNA中的非结构化区域，因为分子识别是通过碱基配对进行的⁴然而，RNA可以是高度结构化的，其生物功能通常由其结构决定^5,6值得注意的是，这种结构区域易于通过与RNA折叠呈现的囊相互作用的小分子结合来靶向⁷然而，仅由小分子占据RNA结构通常不足以引发生物效应⁸。

在这里，我们开发了一种策略，通过将RNA分子识别元件粘贴到第二种化合物上，该化合物结合并激活核糖核酸酶来切割靶点，从而将生物上不活跃的RNA-结合小分子转化为有效且特异的功能效应器。我们的重点是三个方面：（1）定义小分子和RNA折叠之间的结合相互作用；（2） 以可编程的方式，将生物惰性的高选择性结合相互作用转化为靶向降解的诱导剂，提供有效和选择性的功能抑制剂；（3）建立小分子消除RNA的范式。

RNA结合化学型的鉴定

拥有15000名成员的类似天然产物的小分子化合物集合，具有多种特性⁹研究了与3×3内环文库中存在的RNA 3D折叠文库的结合（ILL；探测了61440000个潜在的结合相互作用）（图。​（图1a）。1a个). 3×3 ILL中4096个独特的RNA折叠包括1×1、2×2和3×3内环以及隆起环和完全配对的RNA。使用荧光染色法评估结合¹⁰其中，库中与RNA结合的化合物取代染料并减少其排放。对15000个小分子（10μM）进行初步分类，得到1584个命中化合物（扩展数据图。​图1a）。1a个). 对前480种化合物的二次验证产生了344个结合小分子。这些不同的化合物包括六种RNA-结合支架，例如1-亚苄基-1-茚和吩噻嗪（图。​（图1b1磅).

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图1

文库-病毒-文库筛查定义了新的RNA-结合小分子和药物靶点。

一，对6100多万个理论相互作用进行2DCS分析，确定小分子和RNA基序之间的新相互作用。b条，新发现的小分子RNA结合物(n个 = 344）包括156种不同的脚手架，根据脚手架的相似性分为79个主要类别。在前10个最丰富的类中（总共覆盖所有点击量的59.6%），有6个是新类（绿色）。c（c），来自用于2DCS筛选的3×3随机RNA库的Motif分布。正如预期的那样，3×3和2×2内部环路构成了库的大多数（总计85.4%）。绑定到的主题C1类–C6级显示了3×3内环的显著富集(P（P） < 0.001）和单核苷酸隆起(P（P） < 0.001）。共有1044个图案C1类–C20个具有Z轴_{光突发事件} > 8.对这些化合物的3×3内环和单核苷酸突起的偏好是共同观察到的。在这1044个基序中，只有23个（2.2%）存在于高表达的人类转录本中(n个 = 2712个总基序），375个是新基序，之前没有已知的小分子粘合剂。Inforna包含超过100000种RNA-小分子相互作用和6453种不同类型的独特RNA基序。天，尽管约6%的miRNAs可以被C1类–C6级，其中只有约30%的靶向位点是功能性的（Drosha或Dicer加工位点），因此被预测会诱导生物效应。另外大约70%是非生产性的相互作用，预计生物沉默。我们发现，48%具有可配体非功能位点的miRNAs是RNase L的潜在底物，RIBOTACs可能会将其作为靶标。因此，生物惰性粘结剂可以转化为生物活性RIBOTACs，从而引发靶向降解。中提到的统计显著性c（c）使用双尾学生的吨-测试。

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扩展数据图1

To-Pro-1染料置换分析验证和新发现的结合RNA的小分子在化学上与先前已知的RNA结合物不同。

一To-Pro分析优化和验证。通过改变染料和RNA的浓度，优化RNA 3×3内环文库（3×3 ILL）中to-Pro-1染料置换的信噪比（左）；n个 = 3个独立重复）。使用Hoechst 33258作为取代to-Pro-1的阳性对照进行验证（中间；n个 = 3个独立的重复）。使用10和100µM Hoechst 33258（右）对筛选条件进行Z因子分析。对于每个浓度，n个 = 在单个独立实验中为690。数据报告为平均值±标准偏差。b条，5’吸收阵列屏蔽-³²P标记的3×3 ILL。化合物以剂量反应（200 nL，10–0.625 mM，log₂稀释）。c（c），对Inforna中发现的404个分子进行Tanimoto分析的热图显示C1–C20在化学上与已知的RNA-结合物质不同。天，平均化学相似性C1类–C20个R-BIND数据库中的化合物(n个 = 104种独特化合物）。e（电子）、理化性质比较C1–C20和Inforna内的分子。本文所鉴定的化合物具有不同的化学性质，具有约35倍的CLogP，极表面积（TPSA）减少约20%，氢键供体和受体数量减少约15%^15,57,58。（f），独特的化学模式表明氮素支架内的化学类似化合物。化合物C7–C10Tanimoto得分范围为0.7至>0.995，并聚集在一起。化合物第12项–第15项它们的化学性质几乎相同，因为它们共享胆固醇衍生的氮原子核，只有其他N-取代基不同。然而，与其余化合物相比(C1–C11和C16–C20)，他们的Tanimoto得分在0.29-0.32之间，表明他们在获得的点击数中是独一无二的。C1类和C11号机组表现出高度相似性（谷本系数=0.82），尽管它们在结构上看起来非常不同。这可能是因为它们的空间取向相似，因为它们的氮原子核上都有烷基取代的苯。化合物补体第四成份,C5级,C6级、和C20个与所有其他热门歌曲相比，它在结构上是独一无二的。

源数据

这344个小分子的结合是用一种称为吸收阵列的正交微阵列方法研究的¹¹，生成26个化合物（扩展数据图。​图1b）。1磅). 值得注意的是，当在模拟所有库成员共同区域的过量未标记竞争寡核苷酸的存在下完成时，AbsorbArray能够并行亲和纯化每个小分子首选的3×3 ILL的精确RNA成员，这是一种称为二维组合筛选（2DCS）的选择方法¹²在初级和验证屏幕上的26个热门化合物中，有6个化合物(C1类–C6级)在这些高度严格的条件下绑定到RNA库（扩展数据图。​图1b1磅和补充表1). 为了确定优选的RNA 3D折叠C1类–C6级，使用RNA测序（RNA-seq）测量所选文库中每个基序的频率，并将其与起始RNA库中的频率进行比较。结果富集的统计显著性通过合并人群比较进行量化，如下所示Z轴_{光突发事件}¹³总的来说，这些研究定义了六个小分子的亲和力景观，即小分子及其首选RNA 3D折叠之间的结构-活性关系（SAR）（补充表1).

三条证据表明，这里识别的六个分子是新的RNA-结合分子。首先，通过计算Tanimoto系数来评估化学相似性¹⁴，其中小于0.7的阈值通常表示不同的分子¹⁵这里确定的六个小分子与两个数据库中所有已知RNA结合物的平均Tanimoto系数（Inforna，404小分子¹⁶; 和R-BIND，104个小分子¹⁷)为0.25±0.07（扩展数据图。1c、d). 第二，比较C1类–C6级已知的RNA-结合小分子在总极表面积（TPSA）以及氢键供体和受体数量上显示出关键差异（扩展数据图。​图1e）。第1页). 最后，支架分析揭示了六种新的RNA结合支架，包括氮盐、双吡咯吡咯盐和染色质（扩展数据图。1d，f).

为了定义SAR，每个小分子的RNA 3D折叠显著丰富Z轴_{光突发事件} > 8-被认为受小分子束缚的统计阈值¹³-进行了分析(n个 = 329个独特的图案；图。​图1c）。1c个). 值得注意的是，这些化合物总体上表现出对3×3内环的偏好（78.4%被小分子结合，而在初始库中为48.3%；P（P） < 0.001）和单核苷酸隆起（5.2%比2.1%；P（P） < 0.001; 图。​图1c）。1c个). 在329个独特的基序中，258个基序没有已知的小分子粘合剂。统计显著富集环中前0.5%的RNA的LOGO分析(Z轴_{光突发事件} > 8） 揭示了每个分子与独特的RNA序列模式结合（扩展数据图。​图22).

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扩展数据图2

C1–C6的LOGO分析，显示首选和可区分的序列和结构。

一、Z区前0.5%的选定RNA的LOGO分析_{光突发事件}以及具有四个最高Z的所选RNA的二级结构_{光突发事件}值。b条、每个小分子识别的RNA的LOGO分析，即.，在Z的底部0.5%_{光突发事件}，RNA的二级结构与最低的四个Z相区别_{光突发事件}值。有趣的是，许多具有GC闭合碱基对，是2×2核苷酸内环。在小分子之间发现了相似性和差异性。例如，在氮支架内，C1类更喜欢在位置1和3处的C和在位置4和6处的A（即，具有两个C的内环与两个A相对），而C3类，其不同之处在于唑鎓核上的取代基，优选在1、3和4位的A，但在6位的C。有趣的是，C1类–C6级尽管在支架上存在化学差异，但所有人都歧视5'GC闭合碱基对（分别位于位置1和位置6处的G和C）。

生成由C1类–C6级，我们将其与折叠人类RNA结构的数据库进行了比较¹⁸数据库包括所有人类初级（pri-）和前体（pre-）microRNA（miRNAs；7436个非标准配对基序）的结构信息，以及具有已知结构的高表达转录物的结构信息。这些转录物包括5S、16S和23S rRNAs、7SL（信号再认知粒子）、RNase P RNA、U4/U6小核RNA和465个非冗余tRNAs。针对RNA折叠-小分子相互作用对这些结构的信息挖掘表明，13个基序与C1类–C6级在111个人类miRNA中出现114次；也就是说，大约6%的人类miRNAs的结构可以通过C1类–C6级在这些目标结构中，只有33个（28.9%）存在于功能性Drosha或Dicer处理站点中，这表明大多数交互作用将导致无效的目标参与，即生物系统中的不活动（图。​（图1d）。1天). 值得注意的是，在本次精选的329个独特图案中，只有4个（1.2%）受到C1类–C6级存在于高表达的人类转录本中(n个 = 2712个图案）。

pre-miR-155 RIBOTAC降解剂的设计

鉴于生物沉默相互作用的优势，因此挑战在于如何将其转化为具有生物活性的小分子。一种策略是通过产生核糖核酸酶靶向嵌合体（RIBOTAC），使结合物具有裂解其特定靶点的能力¹RIBOTACs由与第二个小分子结合的RNA-结合化合物组成，该小分子可招募并局部激活RNase L¹优先切割具有UNN模式的RNA（带有未配对Us）^19–22（图。​（图1d）。1天). 值得注意的是，在预测的功能沉默相互作用中，55个靶向miRNA（48.2%）至少有一个附近的RNase L位点（10 bp以内），因此可能对RIBOTAC敏感（图。​（图1d1天).

已确定的一种预测的生物沉默相互作用是C1类（如前所述^23,24)和5′GA类前miR-155的U/3′C_A隆起，其中粗体表示未配对或非标准配对核苷酸（图。​（图2a）。2a个). miR-155与炎症有关²⁵，乳腺癌²⁶和其他疾病。这个C1类–5′GA类U/3′C_A相互作用是从3×3 ILL的一个成员中确定的，该ILL预计会形成两个凸起，而不是一个内环（扩展数据图。​图3a）。3a年). 此外，5′GA类U/3′C_A结合位点接近5′UU型U/3英尺UC公司预测为RNase L底物的基序^20,21（图。​（图2a）。2a个). 通过微尺度热泳（MST）对2DCS-选择的RNA的结合分析表明C1类仅与5′GAU/3′C_A基序结合(K（K）_天 = 1.1±0.2µM），类似于具有两个凸起的RNA(K（K）_天 = 1.2±0.1µM）和最小化的RNA构建体(K（K）_天 = 0.8±0.1µM）（扩展数据图。​图3b）。3亿). 相比之下，只显示另一个突起或在突起中出现点突变的RNA没有观察到饱和结合C1类-目标定位将A凸起转换为AU对（扩展数据图。3a、b). 这些数据在正交结合试验中得到验证，其中A隆起物被荧光腺嘌呤模拟物2-氨基嘌呤（2AP）取代(K（K）_{d、 应用程序} = 3.9±1µM）（扩展数据图。​图3c3立方厘米).

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图2

Pre-miR-155-RIBOTAC在乳腺癌细胞中以RNase-L依赖的方式选择性降解Pre-miR--155。

一，将与前miR-155结合的惰性粘合剂转化为活性RIBOTAC降解剂的示意图。b条，用于靶向前miR-155的化合物的结构。c（c），前miR-155-RIBOTAC对成熟（mat）的影响(n个 = 4个生物复制品）(n个 = 3个生物复制品）和pri-(n个 = 3个生物复制）miR-155水平，通过增加MDA-MB-231细胞中前miR-155-结合物的浓度来竞争。天，RNase L的siRNA敲除对MDA-MB-231细胞中pre-miR-155-RIBOTAC介导的pre-miR 155裂解的影响，如RT-qPCR所测定。n个 = 3个生物复制。e（电子），在MDA-MB-231细胞中存在前miR-155-RIBOTAC的情况下，使用抗核糖核酸酶L抗体对前-miR-155进行免疫沉淀(n个 = 3个生物复制品）。（f），前miR-155-amide-binder的作用（左；100 nM；n个 = 4个生物复制品）和前miR-155-RIBOTAC（右；100 nM；n个 = 3个生物复制）。FC，折叠更改。克用前miR-155-RIBOTAC处理MDA-MB-231细胞后，对miR-155的直接靶点SOCS1进行Western blot分析(n个 = 3个生物复制品）。小时，前miR-155-RIBOTAC对SOCS1系列3′UTR-荧光素酶报告子转染HEK293T细胞，建立剂量（左）和时间依赖性（右）n个 = 4个生物复制品）。数据为平均值±标准差(c（c）–e（电子）,克和小时). 使用双尾Student’s吨-测试(c（c）–e（电子）,克和小时)或者Wald的测试(（f）).

源数据

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扩展数据图3

前miR-155结合物及其衍生物的体外表征。

一，代表性结合曲线前miR-155-绑定器以及从2DCS选择和通过微尺度热泳（MST）确定的完全基于配对对照中识别的两个A凸起。miR-155前体中发现的凸起以绿色突出显示。b条，代表性结合曲线前miR-155-绑定器以及MST确定的最小a突起构造或完全配对突变体的衍生物。c（c），代表性结合曲线前miR-155-绑定器及其衍生物和用2-氨基嘌呤（2AP）标记的前miR-155的A隆起物或全碱基配对对照(n个 = 2个独立实验）。天，K总结_天第个，共个前miR-155-绑定器2DCS鉴定的类似物和其他咪唑啉盐。的亲和力第19号由于A隆起物在分析条件下聚集，因此无法确定。e（电子），野生型前miR-155，但非基于AU的成对突变RNA可以竞争miR-155-RiboTAC之前（5µM）至2AP标记RNA（1µM_天2.2±0.9μM(n个 = 2个独立实验）。（f）,miR-155-RiboTAC之前用野生型（WT）pre-miR-155构建物诱导体外RNA切割（左），而用突变碱基对控制物诱导无切割（右）(n个 = 3个独立实验）。所有数据均以独立重复的平均值±S.D.报告。使用双尾Student t检验计算所有p值。

源数据

据我们所知，偶氮化合物还没有与RNA结合。因此，对200多种偶氮衍生物的RNA结合能力进行了研究。在这些化合物中，只有14种(抄送7–C20个)在竞争性寡核苷酸存在下与RNA结合（补充表1). 值得注意的是，这14种唑鎓盐中有10种共享胆固醇衍生的甾醇骨架，其中6种与唑鎓环融合抄送7–C20个具有Z轴_{光突发事件} > 8，其中117个是新的，没有已知的小分子粘合剂（扩展数据图。​图44和​和55和补充表1). 将这些与受C1类–C6级，这项研究为RNA与小分子相互作用的当前数据库贡献了375个新的RNA基序。对氮盐选择的RNAs的分析表明，前三个小分子预测与5′G结合A类前miR-155的U/3′C_A基序为第19号,C1类和C20个，按排名。亲和力测量表明，只有C1类和C20个绑定到miR-155的A凸起，同时第19号由于在测定条件下的聚集，结合尚未确定（扩展数据图。​图3d）。三维). 根据观察C1类,C20个在A突起变为AU对的情况下，未显示出和RNA的饱和结合（扩展数据图。​图3d三维).

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扩展数据图4

C7–C13首选和可分辨序列的LOGO分析。

有趣的是，14种偶氮化合物中有10种具有十四氢-1H（H）-环戊基[a]菲取代基，其中六个与氮熔融（补充表1). 总的来说，所有7种化合物都倾向于Cs和As的环，在第六位对a有强烈的偏好，每个位置的偏好程度对每个化合物都是唯一的。同样，所有7种化合物都会对与Us的环进行区分，尤其是在第六位。左侧、Z区前0.5%的选定RNA的LOGO分析_{光突发事件}以及具有四个最高Z的所选RNA的二级结构_{光突发事件}化合物的值抄送7–第13页通常，这些化合物倾向于富含C和A残基的基序，位置6几乎只含A。类似于C1类–C6级，3×3内部回路主要用于抄送7–C20个（75%）（与其在3×3 ILL中的分布相比，p<0.001），单核苷酸隆起，1×1和2×2内环占14%。有趣的是，抄送7和C11号机组更喜欢绑定AU碱基对（粉色框）。赖特、每个小分子识别的RNA的LOGO分析，即.，在Z的底部0.5%_{光突发事件}，RNA的二级结构与最低的四个Z相区别_{光突发事件}化合物的值抄送7–第13页.单核苷酸隆起（18%）（p<0.001，与其在3×3 ILL中的分布相比）和1×1核苷酸内环（29%）（p<0.001，与它在3×3ILL中分布相比）显著丰富了被区分为结合的基序，位置6主要是U，C1类在第6位缺乏对A的强烈偏好。

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扩展数据图5

C14–C20首选和可分辨序列的LOGO分析。

左侧、Z区前0.5%的选定RNA的LOGO分析_{光突发事件}以及具有四个最高Z的所选RNA的二级结构_{光突发事件}化合物的值第14项–C20个通常，这些化合物倾向于富含C和A残基的基序，位置6几乎只含A。类似于C1类–C6级，3×3内部回路主要用于抄送7–C20个（75%）（与其在3×3 ILL中的分布相比，p<0.001），单核苷酸隆起，1×1和2×2内环占14%。赖特、每个小分子识别的RNA的LOGO分析，即.，在Z的底部0.5%_{光突发事件}，RNA的二级结构与最低的四个Z相区别_{光突发事件}化合物的值C1–C20。的首选序列C14–C20富含C和A，其中位置1和6优选分别作为G和A。其中两种唑类化合物，第16号和第17页，与最相似C1类; 在里面第16号，中的取代苯基C1类被甲基取代，而在第17页，烷基链从C缩短₁₅至C₇1,3-二异丙基-2-甲苯基被苄基取代。与其他氮盐一样，对这三种化合物的LOGO分析显示出对C和a核苷酸的偏好，这三种分子的位置都不同。

我们首先测试了以下假设：C1类（以下简称前miR-155-binder）与细胞中的miR-155前体结合，但具有生物惰性；也就是说，它与miR-155前体的结合既不能抑制生物发生，也不能降低成熟miR-155的水平。为了研究靶向结合，我们使用化学交联和下拉分离（Chem-CLIP）²⁷在Chem-CLIP中，用交联部分（氯丁胺嘧啶（CA））和生物素纯化模块修饰RNA-结合分子，以使用链霉亲和素珠进行下拉（扩展数据图。6a、b). 为了安装所需的模块，我们假设n个-十一烷基链对结合没有显著贡献。为了测试这一点n个-用丙酸连接剂取代十一烷基链，得到前miR-155-COOH化合物（图。​（图2b）。2亿). 然后，我们用丙胺将前miR-155-COOH酰胺化，以模拟生成Chem-CLIP探针的反应，生成前miR--155-bind-酰胺（图。​（图2b），2亿)与前miR-155-binder在MST-和2AP-结合分析中与A隆起具有相似的亲和力（扩展数据图。3b、c)支持我们的分子再认知假说。

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扩展数据图6

前miR-155结合物和衍生物直接与MDA-MB-231细胞和体外含有前miR-15和其他A隆起物的miRNA前体结合。

一、用于靶向验证研究的Chem-CLIP探针(miR-155-Chem-CLIP之前)是通过偶联合成的前miR-155-COOH氯丁嘧啶（CA；交联模块；蓝色三角形）和生物素（下拉模块；黄色圆圈）。对照Chem-CLIP探针Ac-CA-biotin包含交联和下拉模块，但缺少RNA-binding模块，并解释了CA模块的非选择性反应。b条，Chem-CLIP是由RNA-binding模块驱动的基于邻近性的反应。处理后，用链霉亲和素珠分离纯化总RNA，并用RT-qPCR进行分析。c（c），MDA-MB-231乳腺癌细胞靶向验证研究结果。用Ac-CA-Biotin（100 nM）或miR-155-Chem-CLIP之前（100 nM）。与起始细胞裂解液相比，拉下组分中前miR-155的富集通过RT-qPCR进行量化（左）。与共同处理前miR-155-化学-CLIP和前miR-155-绑定器导致下拉分数中pre-miR-155的剂量依赖性耗竭，表明Chem-CLIP探针和简单结合化合物前miR-155-绑定器占用同一站点(n个 = 3个生物复制品）。天,miR-155-Chem-CLIP之前通过体外Chem-CLIP-Map-Seq鉴定，在a隆起结合位点的核苷酸5 bp处与前miR-155交联（二级结构中用蓝色箭头表示）。e（电子），的效果前miR-155-绑定器（红色；左侧）和前miR-155-酰胺粘合剂（蓝色；中间）(n个 = 前、前和成熟miR-155水平以及这两种化合物对细胞活力的影响（右）(n个 = 4个生物复制品）。（f），化学CLIP分析（100 nMmiR-155-Chem-CLIP之前)与miR-155前体具有相同隆起的miRNA前体前miR-155-绑定器(n个 = 3个生物复制），其中ND表明在下拉部分中未检测到miRNA。的影响前miR-155-酰胺粘合剂RT-qPCR测定miR-155中含有A突起的miRNAs水平（0.1至10μM）(n个 = 3个生物复制品）。Pre-miR-155-RiboTAC（100 nM）对共享成熟RNA的水平没有影响C1类的miR-155中的一个凸起（扩展数据图6h）。所有数据均报告为平均值±标准差。所有p值均使用双尾Student t检验计算。

源数据

为了确认细胞中的靶向结合，化学CLIP探针pre-miR-155-Chem-CLIP（扩展数据图。6a、b)通过羧酸手柄安装氯丁嘧啶和生物素合成。还合成了一个缺少RNA-结合模块的对照Chem-CLIP探针（Ac-CA-Biotin，其中Ac表示酰化；扩展数据图。​图6a）。第6页). Pre-miR-155-Chem-CLIP（100 nM）在MDA-MB-231细胞（一种异常表达miR-155的三阴性乳腺癌细胞系）中富集了约7倍的Pre-miR--155²⁸，而未观察到Ac-CA-生物素的富集（扩展数据图。​图6c）。第6页c). 重要的是，pre-miR-155-Chem-CLIP的这种前miR-155的下拉和富集是通过与C1类（扩展数据图。​图6c）。第6页c). 总之，这些研究表明C1类直接与细胞中的前miR-155结合。确认C1类在miR-155前体中，我们使用化学交联和下拉分离来绘制小分子RNA结合位点（Chem-CLIP–map-Seq）²⁹事实上，在体外，前miR-155-Chem-CLIP在A隆起结合位点附近交联（扩展数据图。​图6d6天).

通过使用逆转录定量PCR（RT–qPCR）测量miR-155前体和成熟体的水平，评估前miR-155-结合物对miR-155s生物发生的影响。正如预期的那样，在0.01至5µM的浓度范围内，未观察到任何形式的miRNA水平的影响，在该浓度下未观察到毒性；同样，前miR-155-amide-binder也处于非活性状态（扩展数据图。​图6e）。第六版). 值得注意的是，5′GA类在其他11个人类miRNA中也发现了miR-155前体中的U/3′C_A突起，包括三个miRNA，其中A突起位于Dicer加工位点（miR-18a、miR-196a和miR-4435）。事实上，Chem-CLIP研究表明，这11个miRNAs中有4个直接参与MDA-MB-231细胞miR-1226、miR-3168、miR-4435和miR-4700（扩展数据图。​图6f）。第6页). 请注意，剩余的六种miRNAs在本试验中未被检测到，前miR-4640也未被富集。正如预期的那样，由于小分子结合位点也是一个加工位点，前miR-155-amide-binder以剂量依赖性的方式降低了成熟miR-18a、miR-196a和miR-4435的水平，但没有影响其他9个miRNAs的水平（扩展数据图。​图6f第6页).

考虑到前miR-155结合物与前miR-15靶点结合但具有生物惰性，我们通过将前miR-15-COH偶联为RNase-L-重组小分子，将这种RNA结合物转化为RIBOTAC¹，提供前miR-155-RIBOTAC（图。​（图2b）。2亿). 将功能沉默分子转化为功能嵌合分子的方法在蛋白质降解领域得到了很好的研究^30–32但不在RNA降解领域。还合成了两种对照化合物——Ac-RIBOTAC、缺乏前miR-155结合物的RNase L-募集模块和含有活性较低的RNase-L-募集模块的前miR-154-Ctr（图。​（图2b）。2亿). 值得注意的是，前miR-155-RIBOTAC对5′G的亲和力A类无论用MST测量，使用最小结合位点的U/3′C_A与前miR-155结合位点的结合位点相似(K（K）_天 = 分别为0.8±0.1µM和0.53±0.09µM）或使用2AP替代凸起(K（K）_天 = 分别为3.9±1.2µM和4.6±1.2µM）（扩展数据图。3b、c). 此外，在2AP分析中，pre-miR-155-RIBOTAC以2.2±0.9µM的亲和力与pre-miR 155结合，而在a突起突变为AU对的前miR-155突变体中未观察到结合（扩展数据图。​图3e第三版).

体外，pre-miR-155-RIBOTAC将RNase L招募到pre-miR 155并诱导其在预测的切割位点（5′U）进行切割U型U/3英尺UC公司一种剂量依赖性的基序（扩展数据图。​图7a）。第7页). 此外，在添加浓度增加的pre-miR-155粘合剂后，解理减少，呈剂量依赖性（扩展数据图。​图7a）。第7页). 重要的是C1类-结合位点或切割位点的结合位点消除了前miR-155-RIBOTAC的活性，表明这两个位点都是切割所必需的（扩展数据图。​图7b）。第7页). 同样，Ac-RIBOTAC也没有诱导前miR-155的分裂（扩展数据图。​图7b）。第7页). 使用分别在5′端和3′端用荧光素和黑洞猝灭剂标记的前miR-155 a隆起物模型，对前miR-155-RIBOTAC和前miR-15 5-Ctr的这些体外结果进行了验证（扩展数据图。​图3f第3页).

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扩展数据图7

前miR-155-RiboTAC及其衍生物的体外和细胞活性。

一,左边：5′解理的代表性凝胶放射自显影-[³²P] RNase L诱导的前miR-155miR-155-RiboTAC之前及其量化（IC₅₀=~100毫微米；n个 = 3个独立重复）；正确的：代表性凝胶放射自显影miR-155-RiboTAC之前-前miR-155的诱导裂解作为前miR-155-绑定器浓度（IC₅₀=1.9±0.5µM），证明前miR-155-绑定器和miR-155-RiboTAC之前绑定相同的站点，并对其进行相应的量化(n个 = 3个独立重复）。b条，（从左到右）的代表性凝胶放射自显影：由miR-155-RiboTAC之前; 诱导结合位点突变pre-miR-155的核糖核酸酶L裂解前miR-155-RiboTAC; 和由Ac-RiboTAC公司，缺少RNA-binding模块(n个 = 3个独立重复）。对于面板一和b条，“H”表示水解阶梯，而“T1”表示用RNase T1处理，RNase T1裂解鸟苷核苷酸。c（c），的效果miR-155-RiboTAC之前(n个 = 3个生物复制品）或miR-155-Ctr之前(n个 = 4个生物重复）对48小时处理后MDA-MB-231细胞活力的影响。天,前miR-155-RiboTAC（单剂量）以时间依赖性方式降低MDA-MB-231细胞中成熟miR-155水平(n个 = 3个生物复制品）。e（电子），持续时间miR-155-RiboTAC之前治疗48小时后，对miR-155前体水平的影响（洗脱实验；n个 = 3个生物复制品）。处理期结束后，去除含化合物的培养基，并在处理后的指定时间采集总RNA，以提供_1/2 = 19.3 h。观察到的半衰期与报道的miR-155半衰期一致，范围为12.4～28 h¹⁵。（f），的效果Ac-RiboTAC公司（绿色），RNase L招募者缺少RNA-binding模块，以及miR-155-Ctr之前（红色），一种与RNase L招募者活性较低的区域异构体嵌合体，经RT-qPCR测定48小时处理后，miR-155生物发生(n个 = 3个生物复制品）。克，的效果miR-155-RiboTAC之前和前miR-155-绑定器miR-155之前版本（左；n个 = 6个生物复制品）和成熟miR-155（右；n个 = 复合处理细胞的3个生物复制品；n个 = 通过RT-qPCR测定CFPAC-1（胰腺导管腺癌）细胞中载体处理水平的6个生物复制。小时，MDA-MB-231细胞经miR-155-RiboTAC之前（100 nM）或LNA-155型（50纳米）(n个 = 3个生物复制品）。每个miRNA的标准化读取计数的比较miR-155-RiboTAC之前和LNA-155型治疗（左）。的影响miR-155-RiboTAC之前（100毫微米，n个 = 3个生物复制）。我，MDA-MB-231细胞经miR-155-RiboTAC之前（100 nM）或LNA-155型（50毫微米）(n个 = 3个生物复制品）。从左至右：（i）MDA-MB-231细胞经miR-155-RiboTAC之前（100毫微米）与.车辆和LNA-155型（50毫微米）与.48小时治疗期后的车辆；（ii）比较miR-155-RiboTAC之前和LNA-155型治疗；（iii）两种因素共同影响的基因的标准化%变化比较miR-155-RiboTAC之前和LNA-155型处理(n个 = 26个基因，右）。所有数据均以平均值±标准差报告。所有p值均采用双尾Student t检验计算。

源数据

体外研究表明，前miR-155-RIBOTAC通过招募RNase L来特异性降解前-miR-155，研究其对MDA-MB-231细胞中前、前和成熟miR-155水平的影响。100 nM的前miR-155-RIBOTAC以时间依赖的方式降低成熟miR-155水平，没有观察到毒性，48小时后最大降低71±10%（扩展数据图。7c、d和补充图。2和三). 此外，在48小时的治疗期后，观察到所有三种物种都出现了剂量依赖性的减少，并且每种物种都通过与前miR-155结合物的联合治疗得到了挽救（图。​（图2c），2厘米)，表明这两个分子竞争相同的结合位点。此外，在洗脱研究中去除前miR-155-RIBOTAC后，前miR-155水平的时间依赖性恢复，半衰期约为19.3小时（扩展数据图。​图7e），第7页)，根据报道的细胞中miR-155的周转³³控制分子Ac-RIBOTAC和前miR-155-Ctr均不影响细胞中的前或成熟miR-155水平（扩展数据图。​图7f）。第7页). 同样，在CFPAC-1细胞中，一种过度表达miR-155的胰腺癌细胞系³⁴-前miR-155-RIBOTAC使miR-155的前体和成熟水平分别降低约20%和65%，而前miR--155-binder-amide没有降低（扩展数据图。​图7g7克).

为了验证前miR-155-RIBOTAC的作用模式，用靶向RNase L或对照siRNA的短干扰RNA（siRNA）转染MDA-MB-231细胞。值得注意的是，RNase-L-siRNA阻断了前miR--155-RIBOTAC降低miR-155水平的能力（图。​（图2d）；第2天); 因此，复合活性依赖于这种核糖核酸酶。此外，与载体治疗相比，经前miR-155-RIBOTAC处理的MDA-MB-231细胞中RNase L免疫沉淀富集了约2.4倍的前-miR-155，但未富集前-miR-155-Ctr（图。​（图2e）。第二版). 因此，前miR-155-RIBOTAC直接与miR-155前体结合，并招募RNase L来切割转录物。

前miR-155-RIBOTAC是选择性的

miR-155-RIBOTAC前体对miR-155的选择性使用RT–qPCR图谱在miRNome范围内进行评估。对MDA-MB-231细胞中表达的373个miRNAs的分析表明，前miR-155-RIBOTAC以与LNA-155相似的方式选择性降低miR-155水平（扩展数据图。​图7h），7小时)，对任何其他miRNA没有显著影响（图。​（图2f），第2页)，包括具有相同A凸起的那些。注意，在miR-155-酰胺结合物浓度高于1μM的前miR-155-RIBOTAC（100 nM）浓度的10倍时，观察到这些miRNAs的一个子集受到抑制（扩展数据图。​图6f）。第6页). 为了证实这些发现，还使用miRNA-seq评估了前miR-155-RIBOTAC和LNA-155（一种靶向成熟miR-155-5p的antagomir）的选择性。值得注意的是，这两种模式在miRNome中的效果相似（扩展数据图。​图7h7小时).

具有相同A bulge-miR-18a、miR-101-1、miR-1226（受C1类在Chem-CLIP研究中），miR-3945和miR-4435（受C1类在Chem-CLIP研究中）-也有潜在的核糖核酸酶裂解位点（扩展数据图。​图6f）。第6页). 然而，miR-155前体似乎包含优越的RNase L裂解位点。在体外，分裂发生在核苷酸U28–U30处，位于与顶端发夹环并列的1×2不对称环内和附近。RNA二级结构预测表明，这个环可能是动态的，可能会形成一个只有1 kcal-mol的单链核苷酸大发夹⁻¹预测自由能的差异。此外，这五个其他miRNAs中的RNase L裂解位点与结合位点的距离不同于miR-155（7 bp），这表明结合位点和降解位点之间的距离可以用于编程选择性（扩展数据图。​图6f）。第6页). 总之，这些研究表明，前miR-155-RIBOTAC诱导其靶RNA降解需要RNA结合位点和RNase L裂解位点。

为了评估pre-miR-155-RIBOTAC对转录组的选择性，对使用pre-miR 155-RIBOTAC或LNA-155处理的MDA-MB-231细胞进行RNA-seq分析（扩展数据图。​图7i）。第7页). 在检测到的13332个转录物中，29个（0.22%）显著受到miR-155-RIBOTAC前处理的影响(P（P） < 0.05和log₂【折叠变化】>1），其中1个上调，28个下调。值得注意的是，这29个转录物也在相当程度上受到LNA-155治疗的影响（扩展数据图。​图7i）。第7页). 考虑TargetScanHuman（v.7.0）预测的miR-155下游靶点时³⁵(n个 = 前miR-155-RIBOTAC上调了469）、307（65%）。LNA-155也上调了469个靶点中的类似百分比（68%）。值得注意的是，前miR-155-RIBOTAC和LNA-155均上调了263个靶点。对前miR-155-RIBOTAC和LNA-155治疗之间所有基因的归一化读取计数进行的比较显示出高度显著的相关性R（右） > 0.99（扩展数据图。​图7i）。第7页). 总的来说，这些数据表明，前miR-155-RIBOTAC以与靶向miR-155（LNA-155）的寡核苷酸相似的方式影响转录组，并且具有有限的离靶效应，尽管需要进行额外的研究来评估miRNA敲除的选择性。值得注意的是，pre-miR-155-RiboTAC选择性地降低了MDA-MB-231细胞中miR-155的miRnome-wide水平，这些细胞被迫表达野生型pre-miR 155，而不是那些被迫表达结合位点突变的细胞（扩展数据图。​图8a第8页).

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扩展数据图8

手机和体内前miR-155-RiboTAC及其衍生物的活性。

一，的效果miR-155-RiboTAC之前（100 nM）在MDA-MB-231细胞miRNome上强制表达WT pre-miR-155（左；n个 = 3个生物复制品）；和影响miR-155-RiboTAC之前（100 nM）在MDA-MB-231细胞miRNome上强制表达前miR-155结合位点突变（右；n个 = 3个生物复制品）。b条，的效果miR-155-Ctr之前MDA-MB-231细胞迁移的研究(n个 = 3个生物复制品）。c（c），药物代谢和药代动力学（DMPK）分析miR-155-RiboTAC之前在C57BL/6小鼠中(n个 = 每个时间点3只老鼠）。天，体内治疗miR-155-RiboTAC之前（1毫克/千克，数量/天.，30天）减少了Bouin’s溶液染色的肺结节（红色结节）数量(n个 = 5只老鼠）。e（电子），肺组织用miR-155-RiboTAC之前，但不是前miR-155-酰胺粘合剂FISH检测显示成熟miR-155水平下降(n个 = 5只老鼠）。所有数据均以平均值±标准偏差报告。Walds检验表明了统计显著性(一)或双尾学生t检验(b至e).

源数据

miR-155上调通过抑制抑制细胞因子信号传导的SOCS1调节乳腺癌细胞的迁移和侵袭²⁶事实上，miR-155-RIBOTAC（100 nM）前处理使SOCS1水平增加了约50%（图。​（图2g）。2克). 使用融合到SOCS1 3′非翻译区（UTR）的荧光素酶报告子证实了这些数据，建立了RIBOTAC对miR-155直接靶点的去表达的剂量和时间依赖性（图。​（图2h）。2小时). 全球蛋白质组学分析证实，前miR-155-RIBOTAC诱导了选择性作用。在3158种可检测的蛋白质中，385种被上调，其中98种与miR-155相关（图。​（图3a）。3a年). 在这98种蛋白质中，86种（88%）的转录水平也通过RNA-seq分析得到上调。值得注意的是，尽管SOCS1未被检测到，但两种miR-155调节蛋白IRF2BPL和SMARCAD1的变化具有统计学意义(P（P） < 0.01). 最后，对未受前miR-155-RIBOTAC影响的与前miR-18a相关的蛋白质进行检测，发现那些可检测到的蛋白质(n个 = 264例中有42例）未受该RIBOTAC治疗的影响（图。​（图3a3a年).

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图3

Pre-miR-155-RIBOTAC选择性降解Pre-miR 155并减少体内肺部定植。

一与载体相比，经前miR-155-RIBOTAC（100 nM）处理的MDA-MB-231细胞的左侧蛋白质全变化(n个 = 3个生物复制品）。对，miR-155-RIBOTAC前体显著上调miR-155相关蛋白(n个 = 98个蛋白质），如Kolmogorov–Smirnov对其水平与所有蛋白质的分析（右）所示(n个 = 3个生物复制品）。b条，前miR-155-RIBOTAC对MDA-MB-231细胞迁移的影响(n个 = 3个生物复制品）；每个重复量化2个视野。比例尺，0.5 mm。c（c）前miR-155-RIBOTAC抑制体内肺部定植，这是通过肺结节计数确定的(n个 = 5只小鼠），苏木精和伊红（H&E）染色(n个 = 5只小鼠；每个重复量化2个视野）。比例尺，1 mm（左）和0.2 mm（右）。天，通过RT-qPCR使用人类前miR-155选择性引物测定体内前miR-155结合物和前miR-15-RIBOTAC对前miR-15水平的影响(n个 = 3只老鼠）。数据为平均值±标准差(b条和天). 使用Wald检验确定统计显著性(一)或双尾学生的吨-测试(b条–天).

源数据

前miR-155的裂解和随后SOCS1的上调表明，前miR--155-RIBOTAC可能抑制MDA-MB-231细胞的迁移。事实上，使用前miR-155-RIBOTAC治疗，但不使用前-miR-155-Ctr，MDA-MB-231细胞迁移减少约50%（图。​（图3b3亿和扩展数据图。​图8b）。8亿). 为了证实前miR-155-RIBOTAC的这些作用是由于miR-155回路的废除所致，设计了MCF-10a细胞（一种正常乳腺上皮细胞的模型），以表达野生型前miR-55或突变型前miR 155，其中C1类-结合位点被A突起突变为碱基对而消除（扩展数据图。​图9a）。第九章). 两种前miRNAs的强制表达增加了MCF-10a细胞的迁移能力（扩展数据图。​图9b），9亿)表明miR-155确实与先前报道的这种表型有关^28,36值得注意的是，用pre-miR-155-RIBOTAC处理表达WT但非突变的MCF-10a细胞，可以降低pre-miR-155水平以及这些细胞的迁移（扩展数据图。9a–c).

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扩展数据图9

前miR-155-RiboTAC在过度表达miR-155的MCF-10a细胞和HUVECs中的细胞活性。

一，的效果miR-155-RiboTAC之前在MCF-10a细胞中表达野生型前miR-155、前miR--155的结合位点突变（AU碱基对的突起）或RNase L裂解位点突变（嘧啶丰富的不对称环突变为碱基对）(n个 = 3个生物复制品）。b条，强制表达pre-miR-155，一种突变的pre-miR 155，其中前miR-155-绑定器的结合位点发生突变，或者RNase L切割位点被取消的突变前miR-155增强了MCF-10a细胞的迁移特性，MCF-10a细胞是健康乳腺上皮的模型(n个 = 3个生物复制品）。c（c）,miR-155-RiboTAC之前损害MCF-10a细胞的迁移，这些细胞被迫表达WT pre-miR-155，但不影响那些被迫表达结合位点或裂解位点突变体的细胞(n个 = 3个生物复制品）。天,左边：的影响miR-155-RiboTAC之前RT-qPCR检测HUVEC成熟miR-155水平(n个 = 3个生物复制品）。正确的：的影响前miR-155-绑定器关于miR-155-RiboTAC之前通过RT-qPCR测定miR-155前体水平进行评估(n个 = 4个生物复制品）。e（电子），的效果前miR-155-绑定器RT-qPCR检测HUVEC中成熟和前miR-155水平(n个 = 成熟miR-155的3个生物复制品；n个 = 前miR-155的4个生物复制）。（f），控制RiboTAC的效果miR-155-Ctr之前RT-qPCR检测HUVEC中成熟和前miR-155水平(n个 = 3个生物复制品）。克，的效果miR-155-RiboTAC之前RT-qPCR测定的HUVEC中前体中含有miR-155’s A隆起的成熟miRNAs水平（100 nM）(n个 = 3个生物复制品）。小时、代表性Western blot及其对miR-155-RiboTAC之前在前miR-155的下游靶标Von Hippel-Lindau（VHL）上(n个 = 3个生物重复）。我，的效果miR-155-RiboTAC之前HUVEC的血管生成能力(n个 = 2个生物复制品）。所有数据均以平均值±标准差报告。所有p值均采用双尾Student t检验计算。

源数据

在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中对前miR-155-RIBOTAC进行补充分析，其中miR-155通过调节Von Hippel-Lindau（VHL）蛋白控制血管生成³⁷用前miR-155-RIBOTAC（100 nM）处理后，miR-155水平下调，与MDA-MB-231细胞中观察到的下调程度相似，而前miR-55-binder和前miR-154-Ctr则处于非活性状态（扩展数据图。9d–f日). 此外，前miR-155-RIBOTAC对具有前miR-155-结合位点的其他miRNA水平没有影响（扩展数据图。​图9g）。9克). 最后，前miR-155-RIBOTAC减少miR-155使VHL蛋白水平提高约50%，小管分支减少约35%，表明血管生成能力降低（扩展数据图。9小时，i).

为了评估前miR-155-RIBOTAC抑制miR-155介导的乳腺癌肺部定植的能力，通过小鼠尾静脉注射MDA-MB-luc细胞³⁸5天后，通过腹腔注射给小鼠注射pre-miR-155-RIBOTAC（1 mg/kg，每隔一天）。剂量由药物代谢和药代动力学研究确定(C类_最大值 = 血浆中1.2µM，半衰期为1.8小时；扩展数据图。​图8c）。第8页c). 正如结节数量减少所证明的那样，在miR-155-RIBOTAC治疗前组与载体或miR-155-双酰胺治疗前组相比，肺定植明显受到抑制（图。​（图3三和扩展数据图。​图8d）。8天). 肺组织切片的组织学染色显示使用RIBOTAC治疗后肿瘤负担显著减轻（图。​（图3c）。3立方厘米). 由于小鼠pre-miR-155具有不同的二级结构，缺乏pre-miR 155-RIBOTAC的结合位点，因此分别使用荧光原位杂交（FISH）和RT–qPCR来评估人类成熟和pre-miR155的水平。成熟度显著降低（扩展数据图。​图8e）第8页)和pre-（图。​（图3d）三维)用pre-miR-155-RIBOTAC治疗后，小鼠肺组织中的人TBNC细胞中的miR-155，而用pre-mi R-155-binder-amide治疗没有显著效果。总之，这些结果表明，前miR-155-RIBOTAC可以损害体内miR-155介导的肿瘤定植。

RIBOTAC瞄准6月和MYC公司mRNA

为了测试我们将生物沉默相互作用转化为生物活性相互作用的方法是否广泛适用，我们为另外两种致癌RNA设计了RIBOTAC-6月和MYC公司值得注意的是，这两种癌蛋白都是内在紊乱的，被认为是无法理解的。它们的转录本在5′非翻译区（UTR）中有一个内部核糖体进入位点（IRES），可以驱动MYC的cap依赖性翻译^39,40以及依赖cap的JUN专业翻译启动^41,42为了确定这些mRNA是否在其5′UTR中形成靶向结构，我们将Inforna与最先进的RNA结构计算程序ScanFold耦合⁴³，它确定了RNA中异常热力学稳定性的区域，这是功能和潜在进化保守性的指标。事实上，这两种信使核糖核酸在其IRES中形成热力学稳定区，该区容纳可被小分子靶向的结构，并且接近潜在的RNase-L离开位点（图。​（图4a4a类和​和5a5a级).

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图4

JUN-RIBOTAC通过选择性降解抑制胰腺癌细胞增殖和迁移6月mRNA。

一，示意图6月通过瞄准6月爱尔兰共和国。b条，用于靶向的化合物的结构6月mRNA。c（c）JUN-RIBOTAC和JUN-binder对6月用RT-qPCR测定治疗72小时后MIA PaCa-2细胞的mRNA水平(n个 = 6个生物复制品）。天、JUN-RIBOTAC对MIA-PaCa-2细胞JUN蛋白水平的影响(n个 = 4个生物复制品）。e（电子），JUN-RIBOTAC对6月CRISPR敲除RNase L的MIA PaCa-2细胞mRNA水平(n个 = 3个生物复制），并在相应的MIA-PaCa-2控制细胞系中，其中CRISPR编辑是使用打乱的引导RNA进行的(n个 = 4个生物复制品），用RT-qPCR测定。（f）、JUN-RIBOTAC对MIA-PaCa-2细胞增殖的影响(n个 = 6个生物复制品）。克，JUN-RIBOTAC对MIA PaCa-2细胞侵袭力的影响，如使用Boyden小室试验测定的(n个 = 2个生物复制品；每个重复量化2个视野）。数据为平均值±标准差(c（c）–（f）). 使用双尾Student’s吨-测试(天–（f）)以及针对多次比较进行调整的单因素方差分析（ANOVA）(c（c）).

源数据

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图5

MYC-RIBOTAC以依赖RNase-L的方式选择性靶向MYC。

一，目标降解示意图MYC公司爱尔兰共和国。b条，复合结构。c（c）、MYC-粘合剂和MYC-RIBOTAC对MYC公司用RT-qPCR测定HeLa细胞中的mRNA水平。n个 = 3个生物复制。天、MYC-RIBOTAC对HeLa细胞MYC蛋白水平的影响(n个 = 3个生物复制品）。e（电子），MYC-RIBOTAC对HeLa细胞增殖（左）和凋亡（右）的影响(n个 = 3个生物重复）。（f），MYC-RIBOTAC对MYC公司HEK293T细胞中的IRES荧光素酶报告子（左）或缺乏IRES的对照报告子（右）(n个 = 3个生物复制品）。克，MYC-RIBOTAC（10μM）处理48小时后HeLa细胞的转录组全变化(n个 = 3个生物复制品）。表皮生长因子受体1是MYC著名的下游目标⁵⁰。小时、MYC-RIBOTAC效应的累积分布分析和MYC公司-Kolmogorov–Smirnov对其相对于所有蛋白质水平的分析表明，选择性siRNA作用于87个经验证的MYC下游靶点或HIF-1α下游靶点(n个 = 3个生物复制品）。我、MYC-Ctr和MYC-RIBOTAC对MYC公司Namalwa-Burkitt淋巴瘤细胞的mRNA水平(n个 = 3个生物复制品）与载体进行比较(n个 = 6个生物复制品）。j个、MYC-RIBOTAC对Namalwa细胞MYC蛋白水平的影响(n个 = 2个生物复制品）。k个，MYC-RIBOTAC对Namalwa细胞周期的影响。n个 = 2个生物复制。我、MYC-RIBOTAC或MYC-Ctr诱导Namalwa细胞凋亡的能力(n个 = 2个生物复制品）。米、MYC-RIBOTAC对Namalwa细胞集落形成的影响(n个 = 2个生物复制品）。数据为平均值±标准差(c（c）–（f）和我). 使用经多次比较调整的单向方差分析确定统计显著性(c（c）)，双尾学生吨-测试(天–我)，沃尔德试验(克)或Kolmogorov–Smirnov试验(小时).

源数据

这个6月IRES由一个发夹组成，其茎中嵌入了各种内部环和凸起，可被真核细胞起始因子3（eIF3）识别（图。​（图4a）。4a类). Inforna确定了a突起（5′U）的小分子候选物A类U/3′A_A），命名为JUN-binder（图。​（图4b）。4b个). 值得注意的是，该凸起与富含嘧啶的内环（5′G）相邻UCC公司G/3′C城市大学C） ，核糖核酸酶L的可能底物。使用2AP结合分析，JUN-binder以半最大有效浓度（EC₅₀)1.1±0.2µM，与对照RNA无明显结合，其中突起的核苷酸转化为碱基对（EC₅₀ > 50µM）（扩展数据图。10个). 这些数据通过使用Cy-5-标记的RNA的正交结合测定得到证实（扩展数据图。10亿). 在体外和胰腺癌细胞系MIA-PaCa-2中验证了靶向结合（扩展数据图。10摄氏度，天)使用Chem-CLIP及其竞争变体。最后，尽管体外结合试验和靶点验证证实了6月带有JUN-binder的IRES，该分子具有生物惰性，对6月mRNA或蛋白质水平高达2µM（图。​（图4c4厘米和扩展数据图。10秒).

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扩展数据图10

c-Jun-binder及其衍生物的体外和细胞内特性。

一，代表性结合曲线，用于测量亲和力c-Jun-binder公司,c-6月-RiboTAC、和立方年6月对于c的模型-六月A突起被荧光腺嘌呤模拟物2-氨基嘌呤（2AP）取代的RNA(n个 = 2个独立实验）。b条，代表性结合曲线，用于测量亲和力c-Jun-binder公司,c-6月-RiboTAC和立方年6月对于Cy5标记的c模型-六月IRES和完全配对RNA控制(n个 = 2个独立实验）。完全配对的RNA是通过将A隆起结合位点突变为AU对而产生的。c（c），化学结构c-Jun-Chem-CLIP公司探头和控制探头。c的下拉-六月mRNA体外表达c-Jun-Chem-CLIP公司或Ctr-Chem-CLIP公司(n个 = 重复3次）。天,左边：Chem-CLIP在MIA PaCa-2细胞中完成的靶向参与研究(n个 = 3个生物复制品）。c富集的量化-六月mRNA依据c-Jun-Chem-CLIP公司或控制化学CLIP与不受下拉影响的RNA相比，下拉部分；正确的：竞争性Chem-CLIP实验，其中MIA PaCa-2细胞与c-Jun-Chem-CLIP公司在恒定浓度和不断增加的浓度下c-Jun-binder公司，消耗c-六月下拉组分中的mRNA呈剂量依赖性(n个 = 4个生物复制品）。e（电子），的效果c-Jun-binder公司Mia-PaCa-2细胞c-JUN蛋白水平的研究(n个 = 3个生物复制品）。（f）,c-6月-RiboTAC用WT c诱导体外RNA切割-六月构建（左），而未观察到突变碱基对对照（右）的断裂(n个 = 3). 所有数据均以平均值±标准差报告。所有p值均采用双尾Student t检验计算。

源数据

鉴于这些发现，应用RIBOTAC策略，为JUN-RIBOTAC和相应的控制分子提供活性较低的RNase L招募区域异构体JUN-Ctr（图。​（图4b）。4b个). 使用2AP或Cy5标记的RNA，以与JUN-binder相同的方式研究这些分子的结合亲和力。JUN-RIBOTAC和JUN-Ctr绑定到6月在Cy5分析中，IRES与K（K）_天值分别为0.5±0.2µM和0.4±0.1µM，而与完全配对的对照RNA没有饱和结合（扩展数据图。10亿). 为了测试JUN-RIBOTAC是否诱导6月IRES通过招募RNase L6月IRES分别在其5′端和3′端用荧光团和猝灭剂标记（扩展数据图。10英尺). JUN-RIBOTAC增加了荧光强度，表明其能够诱导核糖核酸酶L裂解6月IRES，而对a凸起转化为AU对的突变体没有影响；此外，JUN-Ctr并没有诱导野生型IRES的分裂（扩展数据图。10英尺).

在MIA PaCa-2细胞中，JUN-RIBOTAC减少6月mRNA水平呈剂量依赖性，高达约40%，蛋白质水平在2µM剂量下降低约75%（图。4c，d段和补充图。4)，而JUN-binder处于非活动状态（扩展数据图。10秒). 为了确认作用模式，我们评估了CRISPR敲除RNase L的MIA PaCa-2细胞中JUN-RIBOTAC的活性（补充图。5). 正如预测的那样，JUN-RIBOTAC在RNase L CRISPR细胞系中是不活跃的，而它显示在6月CRISPR对照细胞系中的mRNA水平（图。​（图4e）。第四版). JUN有助于不同肿瘤类型的增殖和侵袭表型，包括胰腺癌^44–46在MIA-PaCa-2细胞中，JUN-RIBOTAC对JUN蛋白水平的降低足以抑制两种细胞增殖（2µM时约40%；图。​图4f）第4页)和侵入（2µM时约60%；图。​图4g4克).

致癌转录因子MYC在许多癌症类型中协调调节细胞周期、增殖和代谢，包括以HeLa细胞为例的宫颈癌^47,48。值得注意的是MYC公司IRES还形成了一个热力学稳定的结构，包括两个发夹和三个内部回路（图。​（图5a5a级)^19–22偶然地，还有一个5′U的内环UC公司G/3′A处科科斯群岛C、 可以使用我们数据库中名为MYC-binder的分子作为目标（图。​（图5b）。5亿). 此外，该环与富含嘧啶的发夹环相邻（图。​（图5a）。5a级). MYC粘合剂的苯撑双苯基脲基团与内环相互作用K（K）_天2.3±1µM，使用基于荧光的结合分析与Cy5标记的RNA测定；未观察到与完全配对的RNA结合（扩展数据图。第11页). 此外，衍生的MYC-Chem-CLIP探针与内源性MYC公司HeLa细胞中的mRNA呈剂量依赖性（在20µM时富集约50%；扩展数据图。11亿)，并且通过添加竞争浓度的MYC粘合剂，这种富集被耗尽（扩展数据图。11亿). 最后，尽管MYC公司IRES是一个功能位点，MYC结合物的参与不会影响MYC蛋白水平或MYC公司mRNA水平（图。​（图5c5厘米和扩展数据图。第11页c).

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扩展数据图11

c-Myc-binder及其衍生物的体外和细胞特性。

一，代表性结合曲线，用于测量c-Myc-binder公司,c-Myc-RiboTAC和c-Myc-Ctr公司c-Myc IRES 5'U的Cy5标记模型UC公司G/3'A号科科斯群岛C2×2内环或完全配对RNA控制(n个 = 2个独立实验）。b条，化学结构c-Myc-Chem-CLIP公司和Ctr-Chem-CLIP公司探针（顶部）和HeLa细胞中的靶点验证研究（底部）。c-Myc-Chem-CLIP公司剂量依赖性富集MYC公司mRNA（左下方；n个 = 3个生物复制品），由c-Myc-binder公司（右下方；n个 = 6个生物复制品）。c（c），的效果c-Myc-binder公司在MYC公司HeLa细胞的mRNA和蛋白质水平(n个 = 3个生物复制品）。天,c-Myc-RiboTAC诱导WT的体外分裂MYC公司IRES（左），而未观察到突变碱基对对照的分裂（中）。Pre-miR-155-RiboTAC和c-Myc-RiboTAC对非同源RNA没有影响（右）(n个 = 所有面板的3个生物复制）。根据同源靶点的细胞活性选择浓度。e（电子），化学结构c-Myc-酰胺粘合剂和Ac-RiboTAC公司。（f），的效果c-Myc-酰胺粘合剂,Ac-RiboTAC公司、和c-Myc-Ctr公司在MYC公司HeLa细胞中的mRNA和蛋白质水平(n个 = 3个生物复制品）。克，RNA酶L（~85%）的siRNA敲除对c-Myc-RiboTAC在HeLa细胞中(n个 = 3个生物复制品）。小时，影响c-Myc-RiboTAC和BRD4降解剂MZ1型48小时处理对HeLa细胞增殖和凋亡的影响(n个 = 3个生物复制品）。我，的影响c-Myc-RiboTAC基因在MYC公司mRNA水平（左侧；n=3个生物复制品）、蛋白质丰度（中间；（n=2个载体的生物复制品（注意，由于气泡，第三条通道被排除在量化范围之外）和n=3生物复制品，用于复合处理样品）和增殖（右侧n个 = 3个生物复制品）。j个，RNA酶L的siRNA敲除对c-Myc-RiboTAC-介导降解MYC公司MDA-MB-231细胞中的mRNA(n个 = 3个生物复制品）。k个，的效果c-Myc-RiboTAC在上c-Myc公司-转染HEK293T细胞中的IRES-luciferase报告子或其结合位点突变(n个 = 4个生物复制品）。我、用载体处理的HeLa细胞中观察到的转录组宽的变化，c-Myc-RiboTAC、打乱的siRNA，或MYC公司小干扰RNA(n个 = 3个生物复制品）。HeLa细胞经MYC公司-小干扰RNA（1nM）与经过48小时的处理（左）后，打乱siRNA（1 nM）。累计曲线MYC公司HeLa细胞中的靶点和HIF-1α靶点c-Myc-RiboTAC（10微米）与.载具（中间）或c-Myc-siRNA（1 nM）与打乱siRNA（1 nM）（右）。米，经处理的HeLa细胞的全蛋白质组变化的火山图c-Myc-RiboTAC（10微米）与.车辆（左侧）或MYC公司-小干扰RNA（1nM）与经过48小时的处理后，打乱siRNA（1 nM）（右）(n个 = 3个生物复制品）。n个，不同细胞系中RNase L mRNA的丰度（左；n个 = 3个生物复制品）。的影响c-Myc-Ctr基因（10μM）和c-Myc-RiboTAC基因（10μM）打开MYC公司淋巴瘤或白血病细胞、Raji和HL-60细胞的mRNA水平（左中；n个 = 6个生物复制品用于载体和n个 = 3个生物复制品用于复合治疗）和凋亡（右中和右中；n个 = 2个生物复制品）。有趣的是，这些数据表明RiboTAC活性与RNase L表达相关。所有数据均以生物独立复制品的平均值±S.D.报告。使用双尾Student t检验计算统计显著性(b-h、n)，沃尔德测试(i、 左和m)或Kolmogorov–Smirnov试验(i、 中间和右侧).

源数据

由于MYC-粘合剂具有生物惰性，因此它被附加杂环RNase-L-再结晶剂以提供MYC-RIBOTAC，或附加活性较低的区域异构体以提供MYC-Ctr（图。​（图5b）。5亿). MYC-RIBOTAC和MYC-Ctr绑定到MYC公司5英尺UUC公司G/3′A处科科斯群岛Cy5分析中的C内环类似于K（K）_天值分别为1.1±0.1µM和0.9±0.2µM，而未观察到与完全配对的对照RNA的饱和结合（扩展数据图。第11页). 类似于双标记6月IRES模型（扩展数据图。​图9f），第9页)，创建了一个体外荧光报告子，以研究MYC-RIBOTAC是否能够招募RNase L并诱导MYC公司IRES降解。事实上，MYC-RIBOTAC而非MYC-Ctr招募RNase L到MYC公司IRES，如由此产生的荧光增加所证明的，并且在将完全配对的RNA与任一分子孵育后再次没有观察到荧光变化（扩展数据图。11天). 值得注意的是，前miR-155-RIBOTAC对MYC公司IRES RNA，反之亦然（扩展数据图。11天)支持RIBOTAC方法对不同RNA-binding模块的选择性。

与MYC粘合剂相比，MYC-RIBOTAC降低了MYC公司HeLa细胞中的mRNA呈剂量依赖性，在10µM剂量下高达50%左右（图。​（图5c5厘米和补充图。6和7)伴随着MYC蛋白水平的降低（图。​（图5d）。5天). MYC蛋白的减少与HeLa细胞增殖减少和凋亡诱导有关（图。​（图5e）。第五版). 值得注意的是，MYC-Ctr和其中RNase-L再裂解模块（Ac-RIBOTAC）或RNA结合模块与丙胺（MYC-酰胺结合物）缀合的两个对照分子是无活性的（扩展数据图。11e，f段). 确认减少MYC公司MYC-RIBOTAC的mRNA水平依赖于核糖核酸酶L，我们用siRNA敲除HeLa细胞中的核糖核酶LMYC公司RNase L敲除后，细胞中的mRNA水平被消融（扩展数据图。11克). 值得注意的是，蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）MZ-1靶向含4（BRD4）的蛋白，BRD4是已知的MYC公司转录；因此，MZ1降解导致MYC公司mRNA和蛋白质水平⁴⁹（补充图。8). 因此，我们评估了0.1至10µM的MZ1和MYC-RIBOTAC在HeLa细胞中的抗增殖和凋亡作用。两个嵌合体在10µM剂量下抑制增殖的程度相似。然而，MZ1在引发细胞死亡方面更有效-1µM MZ1导致细胞活力降低，这在使用10µM的MYC-RIBOTAC处理的细胞中观察到（扩展数据图。11小时). 最后，MYC-RIBOTAC在减少MYC公司MDA-MB-231乳腺癌细胞的mRNA和蛋白水平以及细胞表型（扩展数据图。第11页). 同样，MYC-RIBOTAC对MYC公司RNase L敲除后，MDA-MB-231细胞中的mRNA水平被消融（扩展数据图。第11页). 为了验证这些结果，我们研究了MYC-RIBOTAC对MYC公司转染HEK293T细胞的IRES-核糖核酸酶报告分析。MYC-RIBOTAC降低了荧光素酶水平（约40%），但对缺乏MYC公司IRES（图。​（图5f）。第5页). 此外，突变荧光素酶报告子中的IRES，使5′UUC公司G/3′A处科科斯群岛C结合位点形成碱基对（5′UUC公司克/3′AAG公司C） 使RIBOTAC在mRNA和蛋白质水平上都处于非活性状态（扩展数据图。1100万).

为了评估MYC-RIBOTAC转录组在HeLa细胞中的选择性，我们进行了全局RNA-seq分析。在检测到的21027个转录物中，84个（0.40%）受到显著影响，51个转录物上调，33个转录物下调（图。​（图5g5克和扩展数据图。11升). 值得注意的是，最显著下调的转录本是表皮生长因子受体1MYC的已知下游目标⁵⁰（图。​（图5g）。5克). 从转录组分析中也得到了类似的结果MYC公司siRNA显著影响了检测到的23741个转录物中的90个（0.38%）转录物（扩展数据图。11升). 837个经充分验证的MYC靶基因的累积分布分析^51–53经MYC-RIBOTAC治疗后，这些转录物显著减少(P（P） < 0.001）或MYC公司小干扰RNA(P（P） < 0.001）（扩展数据图。11升). 相比之下，对HIF-1α的63个下游靶点进行了相同的分析，HIF-1是另一种识别类似DNA序列的转录因子（ACGTG）⁵⁴至MYC（CCACGTG）⁵⁵，MYC-RIBOTAC显示无明显变化（扩展数据图。11升).

MYC-RIBOTAC在转录组中的选择性反映在蛋白质组中。2769个可检测蛋白中只有28个（1.0%）受到显著影响（16个下调，12个上调；扩展数据图。1100万). 值得注意的是，16种下调蛋白中有4种是MYC公司16个下调蛋白中有8个与核糖体途径相关，核糖体是MYC靶基因的主要功能途径之一⁵³蛋白质组数据的累积分布分析显示结果与转录组上的结果一致，其中MYC-RIBOTAC治疗显著下调了MYC公司而不是HIF-1α（图。​（图5h5小时和扩展数据图。1100万). 总之，这些结果证实了MYC-RIBOTAC是选择性转录组和蛋白质组。

为了进一步评估其他相关肿瘤细胞系中的MYC-RIBOTAC，对人类Burkitt淋巴瘤细胞系Namalwa和Raji以及白血病细胞系HL-60进行了测试，其中MYC因移位或扩增而过度表达。值得注意的是，RNase L的表达水平在不同的细胞系中相差25倍，在HeLa细胞中高表达，在Raji-Burkitt淋巴瘤细胞中低表达（扩展数据图。11个). 通过RNase L表达追踪MYC-RIBOTAC的活性：MYC公司HeLa细胞中的mRNA水平降低了约50%（图。​（图5c），5厘米)，在Namalwa细胞中为25%（图。​（图5i），5英寸)在HL-60细胞中为10%，Raji细胞没有减少（扩展数据图。11个). 正如预期的那样，MYC-Ctr在Namalwa-Burkitt淋巴瘤细胞中没有活性（图。​（图5i）。第5页). 相比之下，MYC-RIBOTAC减少了MYC公司用5µM处理后，蛋白质水平提高约50%（图。​（图5j），5焦耳)，诱导细胞周期阻滞并激发细胞凋亡（图。5公里，升，扩展数据图。11个和补充图。9)并将菌落形成减少约50%（图。​（图5m）。500万). 值得注意的是，MYC-Ctr不能降解MYC公司mRNA，在任何这些分析中都没有影响（图。5公里).

编程小分子RNA降解物

在这里，我们已经证明，与RNA靶点结合的无活性、生物惰性小分子可以被编程为生物活性降解剂。将该策略应用于miRNA前体表明，RIBOTAC降解剂降低了涵盖两种疾病的多个细胞系和体内miRNA的水平。这种降解抑制了由这种miRNA驱动的细胞表型和定植过程。作为概念的进一步证明，该策略被扩展为将生物沉默的相互作用转化为生物活性的相互作用，以实现另外两个致癌靶点，6月和MYC公司mRNA。他们的RIBOTAC降解物来自Inforna设计的结合物，降解了期望的靶点，并使这些癌蛋白驱动的转录和蛋白质组程序失效。

总的来说，这项研究提供了将功能沉默的结合物转化为能选择性下调致病RNA的有效降解物的例子。据我们所知，所有先前报道的靶向miRNAs的生物活性小分子都结合在功能位点或其附近，而在本研究中，这些小分子仅占人类miRNA的30%左右。人们对mRNA中的功能位点知之甚少，这使得RIBOTAC策略对这类靶点可能更为重要。相辅相成的是，大约50%的给定RNA靶点是非结构化的，为设计寡核苷酸提供了理想的靶点。小分子提供了一种靶向剩余结构区域的方法，使用RIBOTAC方法可能不再局限于功能区域。

方法

在线内容

任何方法、附加参考、Nature Portfolio报告摘要、源数据、扩展数据、补充信息、致谢、同行评审信息；作者贡献和竞争利益的详细信息；有关数据和代码可用性的声明，请访问10.1038/s41586-023-06091-8。

补充信息

致谢

作者贡献

医学博士构思并指导了这项研究。H.W.和S.S.提供了复合筛选平台，以识别带有H.S.H.和M.G.C.的导线。；F.G.、T.Wegner和T.O.P.提供了用于筛选平台的化合物（咪唑盐）和用于SAR研究的其他衍生物。M.G.进行了吸收阵列和2DCS研究。Y.T.、E.L.、Y.L.和X.L.分析了RNA文库中二级结构的分布，从2DCS选择和Inforna中选择的结构。X.L.对所有miR-155相关化合物、体外切割凝胶进行了合成和表征，并在MDA-MB-231和MCF-10a细胞中对miR-155进行了基于细胞的测定。H.S.H.对人类miRNome进行了注释，对HUVEC进行了化学信息和生物信息分析，并进行了除western blotting（由X.L.执行）以外的所有分析。R.I.B.在CFPAC1和MDA-MB-231细胞中进行了分析，并在这些细胞中验证了qPCR引物。Y.L.验证了引物，对MCF-10a细胞中的miR-155靶向化合物进行了RT–qPCR分析，对所有MYC相关化合物进行了合成和表征，并对MYC进行了所有基于细胞的分析，除非另有说明。B.M.S.对所有与JUN相关的化合物进行了合成和表征，JUN J.L.C.、C.Y.和W.L.的所有基于细胞的分析对MYC的Namalwa、HL-60和Raji细胞进行了所有基于细胞实验，RT-qPCR除外。G.C.进行生物信息学分析以生成LOGO。D.A.和A.A.对MDA-MB-231和HeLa细胞进行了全局蛋白质组学分析。T.Wang和Q.M.R.G.协助合成和表征本研究中使用的化合物。Y.T.对miR-155进行了所有体外结合试验、体外荧光切割试验、所有miRNA和RNA-seq分析以及体内研究。M.V.M.对小鼠肺组织进行H&E染色。J.L.C.-D.在所有作者的协助下撰写了手稿。

同行评审

数据可用性

所有数据和材料均可根据合理要求从相应作者处获得。全球蛋白质组学和RNA-seq研究的数据可从门德利数据（10.17632/xgr83xy8pm.1）获得。本研究中使用的质粒测序数据可从门德利数据（10.17632/9zgvv67j7s.1）获得。原始测序数据已保存在生物项目ID下的序列读取档案中PRJNA914317公司.R-Bind数据库¹⁷可公开访问(https://rbind.chem.duke.edu). Inforna数据库在线可用(https://rnaininforna.com). 完成软件许可协议后，学术用户可以自由访问(https://disney.scripps.ufl.edu/wp-content/uploads/2020/05/software-licensing-agreement-1.pdf). 源数据随本文提供。

代码可用性

所述数据分析中未使用唯一代码。

竞争性利益

M.D.D.是Expansion Therapeutics的创始人和顾问。M.D.D.和J.L.C.-D.是Ribonaut Therapeutics的创始人。这些研究的各个方面都是专利的主题，包括US20160188791/WO2015021415和US20220073910/WO2020167811，以及公开号S-T00010US003和S-T00014US002。

脚注

参与者信息

弗兰克·格洛里厄斯，电子邮件：ed.retsneu-minu@suirog（苏罗格）。

赫伯特·沃尔德曼，电子邮件：编辑：gpm.dnumtrod-ipm@nnamdlaw.trebree。

马修·迪士尼，电子邮件：ude.sppircs@yensid。

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