miR-137–LAPTM4B通过RhoA-LIMK-Cofilin途径调节骨肉瘤细胞骨架组织和肿瘤转移

试剂、质粒、抗体和siRNA

Alexa Fluor 568 Phalloidin来自分子探针（类别号A-12380），Hiperfect转染试剂来自QIAGEN（类别号301705）。含PLUS试剂的脂质己内酰胺LTX来自Invitrogen（产品目录号15338100）。LAPTM4B-3′UTR荧光素酶质粒（Cat#HmiT014362-MT01）及其阴性对照品（Cat#CmiT000001-MT01）购自GeneCopoire，两个质粒均从pEZX-MT01载体中克隆。Agomir-137-3p（Cat#miR40000429-4-5）和相关对照品由RiboBio合成和纯化。

小鼠单克隆抗Flag（M2）来自Sigma-Aldrich（Cat#F1804），小鼠单克隆抗体LAPTM4B来自Atlas抗体（Cat#AMAb91356）。来自Cell Signaling Technology（Cat#3671）的磷酸肌球蛋白轻链2抗体、来自Covance（Cat#PRB-440P）的非肌肉肌球蛋白重链II-A抗体、来自Abcam（Cat#ab12866）的Cofilin（磷酸S3）抗体、来自于Abcam的Cofillin抗体（Cat#ab 42824）、来自Cell信号技术（Cat#3841）的磷酸LIMK1（Thr508）/LIMK2（Thr50）抗体、，来自Sigma-Aldrich（Cat#F1804）的标记抗体和来自Cell Signaling Technology（Cat#2601S）的磷蛋白-PAK抗体。来自Proteintech的E-cadherin抗体（Cat#20874-1-AP）、来自ZENBIO的Vimentin抗体（Cat#R22775）、来自Cell Signaling Technology的Phospho-AKT抗体（Cat#1060）、来自Santa Cruz的MMP2抗体（Cat#sc-13595）和来自Proteitech的HA抗体（Cat#51064-2-AP）。

来自Santa-Cruz（Cat#sc-418，用于免疫沉淀和免疫荧光）和Proteintech（Cat#66733-1-lg，用于免疫印迹）的RhoA抗体。Santa Cruz的蛋白A/G琼脂糖珠（Cat#sc-2003），Proteintech的泛素抗体（Cat#10201-2-AP）。Proteintect（Cat#60004-1-lg）的GAPDH抗体，Proteintetect（Cat#66031-1-lg）的α-微管蛋白抗体。

第二抗体山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP（猫号1706516）和山羊抗大鼠IgG（H+L）-HRP（猫号1706515）来自BioRad。交叉吸附Alexa Fluor 488山羊反鼠（Cat#A-11001）来自赛默飞世尔科技公司。预先设计的“消音器选择”LAPTM4B siRNA1（GGAUCAGUAACUUUUCATT）、LAPTM4 B siRNA2（CCUACCUGUUUGUCCUUATT）和Ctrl-siRNA来自Ambion。

定量PCR

对于mRNA表达分析，使用RNA隔离器总RNA提取试剂（Vazyme，Cat#R401-01）从细胞或组织中分离总RNA。使用StepOne实时PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），通过Hifair®V一步RT-gDNA消化SuperMix进行qPCR（Yeasen，Cat#111141ES60）合成cDNA。

对于miRNA表达分析，使用Hifair®III第一链cDNA合成试剂盒（YEASEN，类别号11139ES10）将总RNA反转录到cDNA中，并根据制造商的说明使用Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix（YEASE，类别号11203ES03）进行qRT-PCR分析。我们研究中的所有引物都列在补充表中S1（第一阶段）.

体内转移试验

所有异种肿瘤实验均按照动物实验规程进行，并经安徽医科大学伦理委员会批准（批准号：20200490）。

雌性BALB/c裸鼠（4周）购自Vital River Laboratories（中国北京），并在标准条件下饲养。将动物随机分为不同组。

在一个实验中，小鼠静脉植入U2OS细胞或MG-63细胞（1×10⁶–6 × 10⁶0.2ml PBS中的细胞）分别注入尾部外侧静脉。注射后6周处死这些小鼠。

在另一个实验中，20只小鼠（每组5只）静脉植入143B细胞（WT、CD63-Flag稳定表达或LAPTM4B-Flag稳定表达），并用10μmol/kg agomir-137-3p或对照组每三天腹腔注射一次，连续4周。随后处死小鼠，对不同组的肺转移结节进行组织学检查、计数和统计分析。在动物实验中，研究人员在实验期间没有对组分配盲目。

数据挖掘

TARGET数据库(https://ocg.cancer.gov/programs/target)和基因表达综合(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo网站/)研究骨肉瘤中LAPTM4B的表达。CCLE数据库(https://sites.broadinstitute.org/ccle网站/)用于评估OS细胞系中LAPTM4B的表达、拷贝数和甲基化状态。从EWAS数据中心获得OS肿瘤组织和对照正常组织中LAPTM4B启动子的甲基化百分比(https://ngdc.cncb.ac.cn/ewas/datahub/index). 结合TCGA和GTEx数据库研究LAPTM4B表达与癌症患者生存率的关系。为了评估miRNAs和LAPTM4B的表达水平，我们使用python API“xenaPython”以编程方式访问公共Xena数据（Pancan Atlax Hub）中的数据。基因MANIA预测了LAPTM4B和RhoA之间的共表达/物理相互作用(http://genemania.org/). GeneMANIA通过使用大量功能关联数据，包括基因组学和蛋白质组学数据、蛋白质和遗传相互作用、共同表达、共同定位、蛋白质结构域相似性等，预测基因功能和输入基因的关系[34].

LAPTM4B对应力纤维组织至关重要

由于LAPTM4B在OS中的表达升高，并且在其他癌症中的功能已经确立，我们接下来研究了LAPTM4 B在OS的作用。有趣的是，通过使用两种不同的siRNAs沉默U2OS细胞中的LAPTM4B，诱导了细胞形态和应力纤维模式的类似重塑，如阴茎倍肽染色（图。​（图2a）。2a个). 进一步量化显示LAPTM4B下调后细胞面积和横弧数显著减少（图。​（图2b）。2亿). 重要的是，在CRISPR-Cas9n产生的LAPTM4B敲除（KO）U2OS细胞中也观察到了这些改变（图。2a–c)表明LAPTM4B在压力纤维组织中发挥着重要的调节作用。

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图2

LAPTM4B对应力纤维组织至关重要。

一U2OS细胞中的应力纤维通过所示细胞中的鬼笔肽染色可见。比例尺：50µm。对于siRNA处理的细胞，转染72小时后，固定细胞进行免疫荧光。b条对所示单元格中的单元格面积（左侧面板）和横弧数（右侧面板）进行量化。量化n个 = 3个实验，n个 > 每组53个细胞。平均值±SEM，数据归一化为“NC siRNA”或“WT”。对于单元格区域，第页（NC siRNA，L4B siRNA1）=0.0354，第页（NC siRNA，L4B siRNA2）=0.0238，第页（重量，L4B KO）=0.0395。对于横弧编号，第页（NC siRNA，L4B siRNA1）=0.0093，第页（NC siRNA，L4B siRNA2）=0.0126，第页（重量，L4B KO）=0.0189。WT宽型，L4B LAPTM4B。c（c）通过Western blotting测定LAPTM4B蛋白水平。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“NC siRNA”或“WT”，第页（NC siRNA，L4B siRNA1）=0.0138，第页（NC siRNA，L4B siRNA2）=0.0076，第页（重量，L4B KO）=0.001。d日通过western blotting测定U2OS细胞中NM2A蛋白水平和MLC2磷酸化水平。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“NC siRNA”。对于siRNA处理的细胞，转染72小时后，收集细胞进行Western印迹。e（电子）通过western blotting测定所示细胞中Cofilin的总蛋白水平和磷酸化水平（磷酸S3）。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“NC siRNA”或“WT”，第页（NC siRNA，L4B siRNA1）=0.0256，第页（NC siRNA，L4B siRNA2）=0.0134，第页（重量，L4B-KO）=0.008。（f）通过Western blotting检测所示细胞中LIMK1/2的磷酸化水平。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据标准化为“NC siRNA”或“WT”，第页（NC siRNA，L4B siRNA1）=0.0351，第页（NC siRNA，L4B siRNA2）=0.0242，第页（重量，L4B KO）=0.0213。

应力纤维在对肿瘤进展至关重要的细胞活动中发挥着重要作用，例如细胞增殖和细胞运动[5]. 因此，我们检查了参与应力纤维动力学的主要机械是否受到LAPTM4B的影响。据报道，肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化对应力纤维组装是必要的[35]，并且Ser3处的cofilin磷酸化使其肌动蛋白结合能力失活，从而促进应激纤维的分解[9]. 我们发现，LAPTM4B缺失不会导致非肌肉肌球蛋白2A（NM2A）水平或MLC磷酸化状态的任何显著差异（图。​（图2d）。二维). 相反，在LAPTM4B siRNA处理的细胞和LAPTM4 B KO细胞中，cofilin的磷酸化显著降低，cofillin是应激纤维分解的关键调节因子，而cofilins总量没有改变（图。​（图2e第二版).

因为LIMK可以在Ser3磷酸化cofilin[9]，我们假设LAPTM4B通过LIMK-cofilin途径刺激应力纤维排列。事实上，通过沉默或敲除LAPTM4B（图。​（图2f2英尺).

LAPTM4B通过抑制泛素蛋白酶体降解促进RhoA稳定性

LIMK的磷酸化受到PAK（p21蛋白活化激酶）、ROCK（Rho-associated protein kinase）和MRCK（myotonic dystrophy kinase-related Cdc42-结合激酶）的动态调节[8]. 这些分子可以被GTP酶激活，例如.Cdc42和Rac调节PAK[36]，Cdc42激活MRCK[37]而RhoA/ROCK/LIMK级联在应力纤维形成和OS开发中起着关键作用[8]. 因此，我们质疑这些关键蛋白是否由LAPTM4B调节。Western blotting报告与PAK的磷酸化水平无差异（补充图S2a、b)这与我们最近的发现一致，即Cdc42（PAK1/2的上游GTPase）活性没有被LAPTM4B调节[24]. 我们进一步研究了LAPTM4B是否对RhoA具有任何调节作用。有趣的是，LAPTM4B缺失的U2OS细胞中RhoA蛋白水平显著降低（图。​（图3a），3a年)，在另一个OS细胞系MG-63中也发现了类似的减少（补充图。第3章)这与生物信息学预测的LAPTM4B和RhoA之间的潜在共表达/物理相互作用相一致（图。​（图3b）。3亿). 在此GeneMANIA预测中，分析了LAPTM4B和RhoA之间的功能关系[34]，预测的物理相互作用（蛋白质之间）的网络权重指数表明LAPTM4B可能与RhoA蛋白相互作用。

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图3

LAPTM4B抑制RhoA的泛素蛋白酶体降解。

一在LAPTM4B耗竭的U2OS细胞中通过蛋白质印迹法测量RhoA蛋白水平。左侧面板：代表性实验。右侧面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“NC siRNA”或“WT”。第页（NC siRNA、L4B siRNA）=0.0243，第页（重量，L4B KO）=0.007。对于siRNA处理的细胞，转染72小时后，收集细胞进行Western印迹。b条GeneMANIA的生物信息学预测表明，LAPTM4B和RhoA之间存在潜在的共表达/物理相互作用。c（c）用指示的siRNAs转染U2OS细胞，转染48 h后用Q-PCR检测RhoA mRNA的表达。d日U2OS细胞用50µg/mL环己酰亚胺（CHX）处理指定时间，并通过Western blotting评估RhoA蛋白水平。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM。红色虚线表示内源性RhoA降解一半的时间点。e（电子）U2OS细胞用1µmol/L巴菲菌素A1（Baf）或20µmol/L MG-132以及50µg/mL CHX处理指定时间，并通过蛋白质印迹评估RhoA蛋白水平。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM*第页 < 0.05.（f）用指示的siRNA转染U2OS细胞，然后用50µg/mL CHX处理细胞指定的时间，并通过western blotting评估RhoA蛋白水平。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM*第页 < 0.05.克用指示的siRNA转染U2OS细胞，72 h后收获进行免疫沉淀，收获前用20µmol/L MG-132处理细胞9 h。用RhoA抗体进行免疫沉淀，然后用泛素抗体对裂解产物进行免疫印迹。左侧面板：代表性实验。右侧面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“NC siRNA”。第页（NC siRNA，L4B siRNA）=0.0231。小时HA标记的LAPTM4B稳定表达细胞和对照细胞被HA抗体免疫沉淀，裂解产物随后被RhoA抗体免疫印迹。左侧面板：代表性实验。右侧面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“Ctrl”。第页（控制，笔记本4B）=0.03687。我通过使用抗HA抗体（品红色）和抗RhoA抗体（绿色）在稳定表达HA标记的LAPTM4B的细胞中进行免疫荧光实验。比例尺：20µm。白色虚线框的区域在下面板中放大。

然后我们研究了支持RhoA的LAPMT4B调节的详细机制。Q-PCR实验报告RhoA转录水平没有差异（图。​（图3c），3立方厘米)，表明LAPTM4B可能反而调节RhoA蛋白的稳定性。接下来，我们用环己酰亚胺处理细胞以抑制蛋白质合成，我们的数据显示RhoA在U2OS细胞中的半衰期约为10小时（图。​（图3d三维).

为了进一步分析RhoA降解的关键途径，将U2OS细胞与V-ATP酶抑制剂bafilomycin-A1培养以抑制自噬/溶酶体降解途径，或与MG-132培养以阻止蛋白酶体降解。我们的数据显示，MG-132处理，而不是巴菲菌素-A1处理，可以显著减弱放线菌酮处理的细胞中的蛋白质降解（图。​（图3e），第三版)，表明蛋白酶体系统是RhoA在U2OS细胞中的主要降解途径，与之前在MLE12细胞中的报道一致[38]. 然后我们研究了RhoA的蛋白酶体降解途径是否受到LAPTM4B的调控，有趣的是，LAPTM4 B的缺失增强了放线菌酮处理细胞中RhoA降解（图。​（图3f），第3页)表明LAPTM4B可以通过抑制其蛋白酶体降解来稳定RhoA蛋白。我们通过RhoA抗体免疫沉淀法进一步评估了LAPTM4B对RhoA泛素化的影响，随后测量泛素水平。正如预期的那样，发现LAPTM4B抑制RhoA泛素化（图。​（图3g3克).

为了排除细胞特异性效应的可能性，我们接下来利用另一个OS细胞系143B进行进一步实验。LAPTM4B KO 143B细胞中的应力纤维组织发生改变，定量分析表明，LAPTM4 B的下调显著减少了应力纤维数量和细胞面积（补充图。S4a系列). 此外，RhoA以及LIMK和cofilin的磷酸化在LAPTM4B KO 143B细胞中下调（补充图。S4b系列). 重要的是，在143B细胞中，LAPTM4B抑制了RhoA的泛素化水平（补充图。S4c系列). 这些结果表明，LAPTM4B显示了OS细胞中应激纤维的重要调节功能。

接下来我们询问了LAPTM4B是否与RhoA相互作用。为此，我们在HA标记的LAPTM4B稳定表达细胞中通过HA抗体拉下进行免疫沉淀实验，然后通过western blotting测量RhoA水平。我们的结果发现，与对照细胞相比，RhoA在稳定表达的LAPTM4B细胞中显著富集（图。​（图3h）。3小时). 免疫荧光实验进一步观察到LAPTM4B和RhoA之间的部分共定位（图。​（图3i）。第3页). 我们预计这种相互作用可能是LAPTM4B调节RhoA稳定性功能的潜在机制。

miR-128和miR-137低表达诱导LAPTM4B上调

由于LAPTM4B在OS中的表达显著升高，并在细胞骨架排列中发挥作用，我们接下来研究了支持LAPTM4 B失调的分子机制。由于大多数癌细胞经历基因组不稳定和基因扩增[27]，我们检查了CCLE数据库中的拷贝数变化（CNV），发现OS细胞系没有显示增加的LAPTM4B拷贝数（图。​（图4a），第4页)LAPTM4B CNV在收集的OS肿瘤样本中与正常对照组织相比没有任何显著变化（图。​（图4b4b个).

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图4

miRNAs诱导LAPTM4B的高表达。

一CCLE数据库中不同OS细胞系的LAPTM4B拷贝数得分（CNV得分）。b条收集的OS肿瘤组织样本和邻近正常组织样本中的LAPTM4B拷贝数得分。c（c）来自GEO数据库（GSE125645，探针cg22581831）的OS肿瘤组织和对照正常组织中LAPTM4B的甲基化百分比。d日来自CCLE数据库的代表性OS细胞系中LAPTM4B的甲基化百分比。e（电子）EWAS数据中心分析数据得出的组织样本（OS组织和正常对照组织）中LAPTM4B表达与甲基化百分比之间的相关性。（f）通过TargetScan预测靶向LAPTM4B的miRNAs的生物信息学。克利用其他生物信息学工具预测靶向LAPTM4B的miRNAs。“1”表示“正预测”，“0”表示“负预测”。小时用指示的miRNA模拟物处理U2OS细胞，转染72 h后，用western blotting检测LAPTM4B蛋白水平。左侧面板：代表性实验。右侧面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“模拟NC”，第页（模拟NC，miR-128模拟）=0.0239，第页（模拟NC，miR-137模拟）=0.0341。我用指示的miRNA ASO处理U2OS细胞，转染72 h后，用western blotting检测LAPTM4B蛋白水平。左侧面板：代表性实验。右侧面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“ASO NC”，第页（ASO NC，miR-128 ASO）=0.0457，第页（ASO NC，miR-137 ASO）=0.0386。j个双荧光素酶分析表明miRNAs直接靶向LAPTM4B的3′UTR。左图：用LAPTM4B-3′UTR和不同的miRNA模拟物联合转染细胞，转染后32h，测定相对荧光素酶活性。量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“模拟NC”，第页（模拟NC，miR-128模拟）=0.0374，第页（模拟NC，miR-137模拟）=0.0211，第页（模拟NC，miR-139模拟）=0.0405。右面板：与空载体和不同miRNA模拟物共转染后的相对荧光素酶活性。k个通过q-PCR测定收集的OS手术样本中miR-128、miR-137和LAPTM4B的表达水平。红色代表“OS肿瘤组织”，蓝色代表“邻近正常组织”。左面板：miR-137和LAPTM4B mRNA水平的相关性分析（实线，皮尔逊法，R（右） = − 0.6038,第页 = 0.03656），miR-128和LAPTM4B mRNA水平（虚线，皮尔逊法，R（右） = − 0.1093,第页 = 0.7491). 右图：miR-128和miR-137在OS肿瘤组织（肿瘤）和邻近正常组织（正常）中的表达。对于miR-137，第页（肿瘤，正常）=0.0008。我从TCGA数据库和GTEx数据库中获得组织样本（肿瘤组织和正常对照组织）中miR-128、miR-137和LAPTM4B的表达水平。

DNA甲基化是癌症的主要表观遗传调控[29]. 我们分析了来自GEO数据库（GSE125645，GSE161407）和EWAS数据中心的数据，发现与正常对照组织相比，OS肿瘤组织中LAPTM4B甲基化百分比没有显著改变（图。​（图4c，4c类，补充图。步骤S5a-c). CCLE数据库进一步支持了这一观点，即在OS细胞系中未发现LAPTM4B启动子区域内有意义的甲基化（图。​（图4d）。第4天). 此外，EWAS数据中心的数据分析表明，LAPTM4B的表达与OS肿瘤组织和对照正常组织的甲基化状态没有显著相关性（图。​（图4e）。第四版). 这些数据表明，DNA甲基化不太可能诱导OS中LAPTM4B的失调。

由于LAPTM4B的CNV和DNA甲基化状态在OS中未发生改变，我们接下来质疑是否涉及转录后调控，例如miRNA。MiRNAs通过直接结合3'非翻译区（UTR）中的“种子序列”抑制基因表达[33]. 我们对靶向LAPTM4B的潜在miRNAs进行了生物信息学分析。在TargetScan的电子分析中，发现了四个最有潜力的候选者（图。​（图4f），第4页)其他生物信息学工具，即DIANAmT、miRanda、miRDB、miRWalk和PICTAR5，同时预测了这些信息（图。​（图4g4克).

为了确定这些miRNAs是否下调LAPTM4B的表达，我们用miRNAs-mimics转染细胞，发现miR-128/miR-137-mimices诱导了LAPTM4 B蛋白水平的显著降低（图。​（图4h），4小时)接下来，我们用miRNA反义寡核苷酸（ASO）转染细胞，发现miR-128或miR-137的抑制适度增加了LAPTM4B水平（图。​（图4i）。第4页). 这些数据表明miR-128和miR-137可以下调LAPTM4B蛋白水平。为了进一步验证miRNA是否直接与LAPTM4B mRNA 3'UTR结合，我们通过与miRNA模拟物共同转染LAPTM4 B 3'UTR-荧光素酶载体进行了双重荧光素素酶检测。我们的数据表明，miR-128、miR-137和miR-139模拟物转染诱导了相对荧光素酶活性的显著降低（图。​（图4j），第4节)，但与空载体共转染时，荧光素酶活性没有下降（图。​（图4j），第4节)表明这些miRNAs直接与LAPTM4B mRNA 3'UTR结合。总之，我们通过western blotting和双荧光素酶分析的实验证实，miR-128和miR-137直接靶向LAPTM4B并调节蛋白表达。

在收集的临床OS样本中，miR-137而非miR-128与LAPTM4B表达呈负相关。此外，OS肿瘤样本中miR-137下调（图。​（图4k），4公里)，这与之前的报道一致，即miR-137是OS中最下调的miRNA之一[39,40]. 由于我们收集的组织样本数量有限，我们接下来进行了数据挖掘，以从更多样本中探索关系。通过对TCGA和GTEx数据库的联合分析，我们发现miR-137和LAPTM4B之间存在显著的负相关（图。​（图4l）。4升). 然而，miR-128与LAPTM4B无明显相关性（图。​（图4l4升).

这些数据表明，miRNAs而非DNA CNV或甲基化状态有助于OS中LAPTM4B的上调，靶向LAPTM4 B的miR-137可能参与OS癌症的进展。

miR-137对应力纤维的调节依赖于LAPTM4B

由于miR-128和miR-137直接靶向LAPTM4B并调节其表达，因此我们在此质疑这两种miRNAs是否对应激纤维有任何影响。为此，我们用miRNA模拟物转染细胞，鬼笔环肽染色报告了过表达miR-128和miR-137，但不表达miR-139和miR-590后显著不同的应激纤维模式、细胞面积和横弧数减少（图。5a、b). 然后，我们测量了cofilin和LIMK的磷酸化水平，我们的数据表明miR-128和miR-137的过度表达都降低了磷酸化cofillin的量（图。​（图5c）5厘米)和磷酸化LIMK（图。​（图5d5天).

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图5

miR-128和miR-137调节应激纤维的排列。

一用指示的miRNA模拟物处理U2OS细胞，转染72小时后，用指骨样蛋白染色观察应力纤维。比例尺：50µm。b条量化所示单元格中的单元格面积（上面板）和横弧数（下面板）。量化n个 = 3个实验，n个 > 每组46个细胞。平均值±SEM，数据归一化为“模拟NC”。对于单元格区域，第页（模拟NC，miR-128模拟）=0.0125，第页（模拟NC，miR-137模拟）=0.0341。对于横弧编号，第页（模拟NC，miR-128模拟）=0.0082，第页（模拟NC，miR-137模拟）=0.0114。c（c）通过指示的miRNA模拟物转染的U2OS细胞中cofilin的总蛋白和磷酸化水平（磷酸S3）。转染72小时后收集细胞进行western blotting。左侧面板：代表性实验。右侧面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“模拟NC”，第页（模拟NC，miR-128模拟）=0.0162，第页（模拟NC，miR-137模拟）=0.0243。d日通过指示的miRNA模拟物转染的U2OS细胞中的磷酸化LIMK1/2。左侧面板：代表性实验。右侧面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“模拟NC”，第页（模拟NC，miR-128模拟）=0.0342，第页（模拟NC，miR-137模拟）=0.0224。

一种特定的miRNA能够靶向多种转录物，因此参与调节各种细胞功能[33]. 因此，我们询问这些miRNA对应激纤维的影响是否依赖于LAPTM4B，而不是通过其他靶点。为此，从KO背景中产生了缺乏LAPTM4B的3′UTR的稳定表达LAPTM4B的U2OS细胞。在LAPTM4B稳定表达的细胞中转染miR-128/miR-137模拟物后，我们没有记录到细胞形态和应激纤维模式的任何显著变化（图。6a–c段)表明这些miRNAs调节细胞骨架的功能是通过LAPTM4B介导的。因此，在稳定表达LAPTM4B的U2OS细胞中，miRNAs没有改变cofilin和LIMK的磷酸化水平（图。第6天，第5天).

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图6

miR-137对应力纤维的调节依赖于LAPTM4B。

一用所示的miRNA模拟物处理稳定表达的LAPTM4B U2OS细胞，转染后72小时，通过鬼笔肽染色观察应激纤维。比例尺：50µm。b条对所示单元格中的单元格面积（左侧面板）和横弧数（右侧面板）进行量化。量化n个 = 3个实验，n个 > 每组42个细胞。平均值±SEM，数据归一化为“模拟NC”。c（c）用指示的miRNA模拟物转染LAPTM4B稳定表达U2OS细胞，转染72 h后，用抗病毒抗体进行western blotting检测LAPTM4 B水平。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“模拟NC”。d日通过指示的miRNA模拟物转染的稳定表达的U2OS细胞LAPTM4B中cofilin的总蛋白和磷酸化水平（磷酸S3）。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“模拟NC”。e（电子）通过指示的miRNA模拟物转染LAPTM4B稳定表达U2OS细胞，然后通过western blotting检测磷酸化的LIMK1/2。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“模拟NC”。（f）从WT背景稳定表达LAPTM4B的U2OS细胞，对照细胞用模拟NC或miR-137模拟物处理。转染72h后，用指骨蛋白染色观察应力纤维。比例尺：50µm。上面板：代表性图像。下面板：量化所示单元格中的单元格面积和横弧数。量化n个 = 3个实验，n个 > 每组31个细胞。平均值±SEM，数据标准化为“Ctrl（模拟NC）”。克从WT背景稳定表达LAPTM4B的U2OS细胞，对照细胞用模拟NC或miR-137模拟物处理。转染72小时后收集细胞进行Western blotting。上面板：代表性实验。下面板：量化n个 = 3个实验，平均值±SEM，数据归一化为“Ctrl（Mimic NC）”。

由于收集的OS样本中miR-137和LAPTM4B之间存在显著的负相关（图。​（图4k），4公里)接下来，我们将重点介绍miR-137–LAPTM4B在操作系统过程中的功能角色。为了进一步证实miR-137–LAPTM4B信号轴确实对维持应力纤维至关重要，我们从WT背景中生成了稳定表达LAPTM4 B的U2OS细胞。在对照细胞中，miR-137转染能够诱导失调的应力纤维（图。​（图6f），第6页)，并且相应地观察到RhoA、p-LIMK和p-cofilin的水平降低（图。​（图6g）。6克). 然而，miR-137似乎对稳定表达的LAPTM4B U2OS细胞中的应激纤维组织和相关信号通路没有影响（图。6f，克).

此外，我们从WT背景中生成了稳定表达143B细胞的LAPTM4B。在143B细胞中也可以观察到miR-137–LAPTM4B对应激纤维及其相关分子调节的影响（补充图。S6a、b系列). 这些实验表明，miR-137–LAPTM4B轴通过LIMK-cofilin信号通路对OS细胞中的应力纤维组织具有显著的调节作用。

我们感谢Carol Norris博士（赫尔辛基大学）对这份手稿的语言编辑。我们感谢HiLIFE光学显微镜的技术支持。我们承认本研究中使用的所有公共可用数据库，尤其是TARGET数据库、CCLE数据库、基因表达总表以及GTEx和TCGA项目。我们感谢参与研究的所有患者。本研究得到了安徽省自然科学基金（KZ 2108085QC100）、中国国家自然科学基金会（KZ 32100623、ZY 81960488）和芬兰科学院（TB 303771和266092）的支持。