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项目：13

1
图8。

图8.R277Q和C266Y致病性PISD变体的自催化蛋白水解受损。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

对过度表达所示PISD结构的HEK细胞中PISD片段进行免疫印迹分析，持续96小时。野生型PISD经历自动催化裂解为形成活性PISD酶所需的30-kDβ亚基和12-kDα亚基。未处理的45-kD PISD蛋白是PISD突变结构的主要蛋白形式。结果在三个独立实验中重复。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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2
图S2。

图S2.R277Q PISD蛋白在过度表达24小时后未检测到。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）过表达指示的PISD构建体的HEK细胞中PISD蛋白片段的蛋白质印迹分析。对于野生型PISD，30kDα-亚基和12kDβ-亚基都是可见的，但对于R277Q突变体，没有可见的蛋白质。（B）过度表达所示PISD结构的HEK细胞中PISD mRNA的相对表达表明，转染后96 h仍存在突变转录物。误差条代表SD。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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三。
图S3。

图S3.对照组和患者成纤维细胞以及过度表达PISD的HEK细胞中OMA1、PGMA5、OPA1和MRPL32的相对mRNA定量。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）对照组和患者成纤维细胞OMA1和OPA1的相对mRNA水平相似。患者成纤维细胞PGAM5和MRPL32 mRNA水平下降；然而，这些模式与Western blot分析无关。（B）OMA1、PGAM5、OPA1和MRPL32 mRNA的相对水平在所有治疗中都相似。误差条代表SD。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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4.
图S1。

图S1.替代拼接的证据。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）跨越预测剪接区域的三次定量RT-PCR反应的熔融曲线图显示了对照（红色）或PISD患者（蓝色）成纤维细胞生成的RNA样品的两个不同峰值。（B）对血液中产生的PISD cDNA进行微量测序。在受影响的子代（II-2）和母代（I-2）中检测到与替代剪接产物相对应的低水平替代序列（用红色框住）。轨迹下方显示了对备选转录本序列的基本调用。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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5
图6。

图6.患者成纤维细胞中PISD mRNA选择性剪接和无义介导衰变（NMD）的证据。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

对照组和患者成纤维细胞产生的cDNA通过PCR在含有相关剪接位点的区域进行扩增。如图所示，用环己酰亚胺（CHX）（10μg/ml，持续4 h）处理细胞，以阻止非传感介导的衰变。310-bp产品对应于正常的拼接产品。较小的～234-bp产物对应于预测的选择性剪接产物，在患者cDNA中可见，并且在CHX治疗后更为丰富。RPL13A基因扩增作为负荷控制。结果在三个独立实验中重复。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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图4。

图4.通过补充溶酶体-PE，PISD患者成纤维细胞溶酶体形态发生改变。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）用奥林巴斯SD-OSR共焦显微镜对LAMP1（灰色）免疫荧光染色的溶酶体代表性图像进行成像。如图所示，细胞在正常培养基或添加溶血素-PE（50μM）的培养基中生长48小时。底部面板是上部面板中白色方框区域的放大图。比例尺表示10μm。（B）从三个技术复制中定量溶酶体形态，每个条件下至少计数100个细胞，绘制每个形态的细胞平均百分比。误差条代表SD，以及P（P）-值由非配对双尾确定t吨与对照组溶酶体扩大的细胞数进行比较。在三个独立的实验中也出现了类似的趋势。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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图5。

图5.PISD成纤维细胞的遗传互补在2DG处理的细胞中恢复线粒体形态。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）用Olympus SD-OSR共焦显微镜拍摄的经PISD-FLAG转染的患者成纤维细胞的代表性图像，显示PISD的线粒体定位以及线粒体和溶酶体的正常形态。线粒体、PISD-FLAG和溶酶体分别用IF对TOMM20（绿色）、FLAG（红色）和LAMP1（灰色）进行染色。比例尺表示5μm。右侧面板是装箱区域的放大图。（B）2DG治疗48小时后，对照组和PISD患者成纤维细胞未转染或表达PISD-FLAG的线粒体形态定量。（C）对照组和PISD患者成纤维细胞的溶酶体形态定量（未转染或表达PISD-FLAG）。对于线粒体和溶酶体形态定量，对每种条件下至少50个细胞的三个独立实验的图像进行了量化，并绘制了每种形态的平均细胞百分比。误差条代表SD，以及P（P）-值由非配对双尾确定t吨与对照组成纤维细胞的形态学比较。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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图S4。

图S4线粒体和溶酶体形态定量的代表性图像。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）细胞的线粒体形态分为三类：（i）融合形态的细胞具有高度融合的线粒体网络，（ii）中间形态的细胞主要具有细长的线粒体和一些网络，以及（iii）线粒体碎片的细胞主要包含短线粒体或点状结构。比例尺指示5μm。（B）细胞的溶酶体形态分为两类：（i）具有正常溶酶体形态学的细胞主要具有小点状溶酶体，可能含有一些较大的溶酶体，但从未形成连接的大片溶酶体；（ii）具有扩大溶酶体的细胞包含主要形成大连接片的溶酶体制。底部面板是上面板中显示的白框区域的放大。比例尺指示5μm。（C）对照组成纤维细胞表达高水平PISD-FLAG（红色，抗FLAG）和高度碎片化线粒体（绿色，TOMM20）的代表性图像，用于确定过度表达效应的阈值，并随后排除定量形态学。比例尺指示5μm。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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图3。

图3.通过补充溶血素-PE，PISD患者成纤维细胞中的线粒体碎片得以挽救。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）正常生长条件下线粒体形态的代表性图像，使用TOMM20抗体（绿色）进行免疫荧光染色，使用蔡司共焦显微镜成像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。底部面板放大了上部面板中显示的白色方框区域。比例尺指示10μm。（B）小组（A）中细胞线粒体形态的量化。（C）如图所示，用2-脱氧葡萄糖（20 mM）或溶酶体-PE（50μM）处理48小时的细胞线粒体形态的代表性图像。（D）小组内细胞线粒体形态的量化（C）。在所有统计分析中，对三个技术复制品中的至少50个细胞进行了量化，绘制了每个形态类别中细胞的平均百分比，并独立复制了三次实验。误差条代表SD，以及P（P）-值由非配对双尾确定t吨与对照组中融合细胞的数量进行比较。

Tian Zhao等人，生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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图9。

图9.PISD患者成纤维细胞线粒体蛋白稳态改变。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）用2-脱氧葡萄糖（20 mM）和50μM溶血素-PE处理48小时后，对对照组和患者成纤维细胞中的各种线粒体蛋白进行Western blot分析。VDAC被用作线粒体总信号的标记，而β-肌动蛋白被用作一般负荷控制。开放三角形和实心三角形分别表示未处理和已处理的形状。在患者成纤维细胞中观察到OMA1、OPA1、MRPL32和处理后的PGAM5水平降低，但在溶酶体-PE治疗后得到了挽救。为了获得OPA1条带的最佳分离，运行分离的凝胶并用HSP60作为负荷控制进行印迹。（B）通过Western blot分析过表达野生型或突变PISD结构（如中所示）的HEK细胞的蛋白提取物中与第（A）部分相同的蛋白。野生型PISD的过度表达导致OMA1和MRPL32中的显著降低，当突变PISD蛋白过度表达时，这一点会减弱。类似的结果在三个独立的实验中得到了复制。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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图1。

图1.临床和遗传患者数据。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）患者家庭系谱以及两个兄弟姐妹在婴儿期和成年期的照片。注意斜视、面部中段发育不良和鼻嵴凹陷。（B）两姐妹的头颅MRI扫描。窗格（i）和（iii）为22岁时的个体II-1。窗格（ii）和（iv）是25岁时的个体ii-2。图（i）和（ii）为轴位T2加权图像，缺乏正常的T2低信号，显示髓鞘减退。图（iii）和（iv）为矢状面MRI扫描，显示胼胝体全身髓鞘减退。（C）使用桑格测序法对已识别的变体进行电泳构象，并将突变残基装箱。（D）来自指示物种的PISD同源物的序列比对显示含有R277Q变体的区域，精氨酸277残基以紫色突出显示。酵母Psd1p中一个对自催化至关重要的保守组氨酸残基以绿色突出，是四种错义变体之一对温度敏感的等位基因以黄色突出显示（；；）。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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图2。

图2.患者成纤维细胞PE合成和线粒体功能的特征。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）患者成纤维细胞将PS转化为PE的能力下降[三H] 丝氨酸持续2、4和6小时，之后通过薄层色谱分离总PE，并且[三H] 对PE中的标签进行量化。（B）患者成纤维细胞最大呼吸减少。对照和患者成纤维细胞的耗氧率（OCR）曲线，使用海马细胞外通量XF24分析仪测量。图上的每个点代表四个技术复制品的平均值，实验已经独立复制了三次。误差条代表SD。（C–G）以β-肌动蛋白作为负荷控制（C）的Western blots中线粒体氧磷复合体亚单位的表达在对照组和患者成纤维细胞之间没有差异（显示为一个代表性的blot，实验已独立重复三次），使用油尺分析试剂盒（D）测量的复合物IV活性变化，qPCR（E）测量的相对mtDNA拷贝数，TMRE（F）测量的膜电位，或Mitotracker Green（G）测量的线粒体质量。对于面板（D–G），图表表示三个独立生物重复的平均值，每个重复都有三个技术重复。误差条代表SD，而P（P）-值由非配对双尾确定t吨测验。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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图7。

图7.在酵母Psd1p中建模时，R277Q变体干扰自催化蛋白水解。。来源：PISD是一种线粒体疾病基因，可导致骨骼发育不良、白内障和白质改变。

（A）本研究中检查的PISD和Psd1p结构示意图，变体编号用红色表示。两种结构的C末端都添加了3XFLAG标签，以便能够在生成PISD原酶所需的保守LGST位点进行自催化裂解后检测α亚基。（B）相对PSD1型mRNA转录水平通过两步逆转录定量PCR测定。CT值被归一化为核看家基因行动1褶皱变化与WT相关，WT设定为1（n=4，SEM）。（C）通过免疫印迹法分析在指定温度下培养的细胞提取物中Psd1p的α（抗FLAG小鼠单克隆）和β（抗Psd1p兔抗血清）亚单位；Pic1p用作加载控件。α-β表示未经历自催化蛋白水解的Psd1p。f2和f3标记从未处理的Psd1p前体产生的蛋白水解片段。基洛道尔顿的分子质量标记迁移如左图所示。（D）的预培养物（30°C）psd1级Δpsd2型将未转化或如图所示转化的Δ酵母点在含有或不含有2mM乙醇胺的合成完整葡萄糖板上，并在30°C或37°C下孵育3d。在三个独立实验中复制了类似的趋势。线粒体靶向信号；TM，跨膜结构域。

田钊等。生命科学联盟。2019年4月；2（2）：e201900353。

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