23589569【PMID】-PMC-NCBI

突变NF-E2表达小鼠和对照动物的组织病理学。福尔马林固定和石蜡包埋器官切片的H&E染色。（A–E）脾脏。（A）空的。（B） WT NF-E2。（C） NF-E2-248aa。（D） NF-E2-262aa。（E） NF-E2-Δ-297-300。棒材：（左）50µm；（右）100µm。（F–J）骨髓。（F）空的。（G） WT NF-E2。（H） NF-E2-248aa。（一） NF-E2-262aa。（J） NF-E2-Δ-297-300。棒材：（左）100µm；（右）分别为200µm。（K–N）肺。（K）重量单位NF-E2。（五十） NF-E2-248aa。（M） NF-E2-262aa。（N） NF-E2-Δ-297-300。棒材，50µm。（O–R）肝脏。（O） WT NF-E2。（P） NF-E2-248aa。（Q） NF-E2-262aa。（R） NF-E2-Δ-297-300。棒材，100µm。

Jonas S.Jutzi等人，《实验医学杂志》，2013年5月6日；210(5):1003-1019.

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图6。来源：MPN患者存在转录因子NF-E2的周期性截断突变。

NF-E2突变体对血统承诺及造血干细胞和祖细胞群体的影响（A–D）用抗Gr-1、Mac-1、B220和CD3抗体对外周血白细胞进行染色，并用FACS进行分析。（A） Gr-1的百分比⁺/Mac-1型⁺双阳性细胞。（B）淋巴细胞百分比（CD3⁺和B220⁺). （C和D）淋巴细胞亚群。（C） B220型⁺B细胞。（D） CD3（CD3）⁺T细胞。（E–I）BM细胞用抗血统标记鸡尾酒以及抗c-kit、Sca-1、CD34、Fc-gammaR和Flt3/Flk2的抗体染色。血统阴性、c-kit阳性、Sca-1阳性（KSL）细胞（E）和血统阴性的、c-kit-阳性的、Sca-1-阴性（KL）的细胞（F）表示为总BM细胞的百分比。（G-I）CMP、GMP和MEP表示为BM细胞总数的百分比。（A–I）n个如图所示，每种基因型=5–17。显示了平均值和SEM。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

Jonas S.Jutzi等人，《实验医学杂志》，2013年5月6日；210(5):1003-1019.

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图8。来源：MPN患者存在转录因子NF-E2的周期性截断突变。

JAK2共表达的影响^V617F型和体内突变NF-E2。（A）实验设计。用表达JAK2的载体逆转录小鼠骨髓^V617F型并移植到致死性照射的balb/c动物体内。移植后10周，采集骨髓并感染空白对照慢病毒pLeGO-iC2或表达262aa NF-E2截短突变的慢病毒（pLeGO-iC2-NF-E2-262aa）。表达JAK2的细胞^V617F型对262aa NF-E2突变体或空对照病毒进行FACS分类。随后，将50000个双阳性细胞与300000个骨髓支持细胞一起移植到受致命辐射的受体小鼠中。（B–E）通过逆行穿刺获取外周血，并在Advia 120系统上进行分析。(n个=每个基因型3-7只小鼠）。显示了平均值和SEM。（B）血红蛋白。（C）平均红细胞体积（MCV）。（D）平均红细胞血红蛋白（MCH）。（E）白细胞计数。使用Student’st吨测试*，P<0.05；***，P<0.001。福尔马林固定和石蜡包埋器官切片的（F–I）H&E染色。（F和G）表达JAK2的小鼠^V617F型单独（使用空的pLeGo-iC2控件）。（H和I）小鼠同时表达JAK2^V617F型和NF-E2-262aa突变体。棒材：（F和H）100µm；（G和I）50µm。

Jonas S.Jutzi等人，《实验医学杂志》，2013年5月6日；210(5):1003-1019.

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图5。来源：MPN患者存在转录因子NF-E2的周期性截断突变。

骨髓移植小鼠的血液学参数。（A）实验设计。将慢病毒转导的FVB/N-45.2骨髓移植到FVB/N小鼠（45.1）的股骨内，感染空载体或表达WT NF-E2的载体或显示的NF-E2突变体(n个=4–11只小鼠/构造，如图所示）。移植后12周，移植率均超过90%。（B）用识别人和鼠NF-E2的抗体对用所示NF-E2构建物转导的小鼠骨髓的总细胞提取物进行检测。通过复制抗β-肌动蛋白的抗体来确保负载相等。具有代表性的污点n个显示了=3个独立实验。（C）通过Western blotting检测转导NF-E2-262aa突变体（左车道）的小鼠骨髓总细胞提取物以及携带NF-E2-262/aa截断突变（UPN 202）患者的蛋白提取物中NF-E2（顶部）和β-肌动蛋白（底部）的表达。右外车道作为阳性对照，显示慢病毒转导的CB3细胞表达WT和262aa截短的NF-E2。填充箭头标记全长WT NF-E2，开放箭头指向较小的截短的NF-E2蛋白，星号标记非特异性条带。显示了两个独立实验的代表性印迹。（D–G）通过逆行穿刺获取外周血，并在指定的时间点在Advia 120系统上进行分析(n个=每个基因型4–11只小鼠）。显示了平均值和SEM。（D）血小板计数。（E）红细胞压积。（F）红细胞计数。（G）非国大。使用Student’s进行统计分析t吨测试。，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001与WT。

Jonas S.Jutzi等人，《实验医学杂志》，2013年5月6日；210(5):1003-1019.

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图4。来源：MPN患者存在转录因子NF-E2的周期性截断突变。

NF-E2突变通过增强细胞增殖，使MPN克隆具有增殖优势。（A–D）将所示MPN患者的单核细胞接种在甲基纤维素中，并在14天后采集单个红系和髓系集落。分析集落中是否存在JAK2^V617F型NF-E2突变BsaXI公司PCR-扩增DNA的限制（）和分别通过GeneScan分析（患者202、209和532）或直接测序（患者209和409）。图中描绘了各个群体的基因型，每个群体由一个点表示。（E）携带JAK2的FDCP-1-EpoR细胞（左）和BaF3细胞（右）^V617F型用表达262aa NF-E2截短突变的载体或空白对照载体转导突变。用识别人和鼠NF-E2的抗体检测总细胞提取物。通过复制抗GAPDH抗体来确保负载量相等。携带JAK2的（F和G）FDCP-1-EpoR细胞（F）和BaF3细胞（G）^V617F型如图所示，突变并表达262aa NF-E2截断突变体或携带空白对照载体的细胞在没有生长因子（左）或存在1 IU/ml Epo或5 ng/ml IL-3的情况下培养。显示了四个独立实验的平均值和SEM。**，P<0.01；***，P<0.001。（H）携带空白对照载体（左）或表达262aa NF-E2截断突变（右）的FDCP-1-EpoR细胞用Hoechst 33342染色，并用FACS分析DNA含量。代表性斑点n个=6个独立实验。（一）的统计分析n个=6个独立实验。*，P<0.05；**，学生的P<0.01t吨测试。（J）如图所示，用抗CDK4、CDK6和细胞周期蛋白D3的抗体询问携带空对照载体（左泳道）或表达262aa NF-E2截短突变体（右泳道）的FDCP-1-EpoR细胞的细胞提取物。通过复制抗β-肌动蛋白的抗体来确保负载相等。代表性斑点n个=6个独立实验。（K）的统计分析n个=6个独立的Western blot实验。显示了平均值和SEM。*，Wilcox配对检验P<0.05。

Jonas S.Jutzi等人，《实验医学杂志》，2013年5月6日；210(5):1003-1019.

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图2。来源：MPN患者存在转录因子NF-E2的周期性截断突变。

突变体NF-E2蛋白的反激活活性及其对野生型NF-E2活性的影响。将编码β-珠蛋白启动子-荧光素酶结构体（a；）或编码5.2 kb的β1-微管蛋白启动子的报告子结构体的质粒与MafG（白色条）、WT NF-E2（黑色条）或各种NF-E2突变体（灰色条）的表达载体共转染到HEK-293细胞中。转染后16 h测量荧光素酶活性，并通过测定共转染载体中的Renilla荧光素酶活性对转染效率进行标准化。MafG单独的活性设置为1，并描述了与该控制相关的折叠活性。条形图表示四个独立实验的平均值±SEM，每个实验重复进行。使用Bonferroni的事后多重比较检验，通过单因素方差分析进行统计分析。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。（C）缺乏内源性NF-E2的CB3细胞被WT NF-E2或各种NF-E2突变体转染。转染72小时后，收集RNA，并通过qRT-PCR检测β-珠蛋白和β-2-微球蛋白看家基因的表达。结果表示四个独立实验的平均值±SEM，并报告为在100时WT NF-E2转染CB3细胞中β-珠蛋白表达的相对表达水平。使用Bonferroni的事后多重比较测试，通过单因素方差分析对数据进行统计显著性分析。***，P<0.001。（D）实验设计。用pLeGO-iG-NF-E2转导CB3细胞，筛选GFP表达，并选择显示WT NF-E2表达的单个克隆（CB3-NF-E2wt）。随后，用空pLeGO-iT2载体或编码所示NF-E2突变体的pLeGO-iT2载体转导CB3-NF-E2wt细胞。（E） FACS对双阳性细胞进行分类，并通过qRT-PCR检测β珠蛋白和β2-微球蛋白看家基因的表达。结果表示四个独立实验的平均值±SEM，并报告为在1。使用Bonferroni的事后多重比较测试，通过单因素方差分析对数据进行统计显著性分析。**，P<0.01。（F）表达所示NF-E2突变体的移植小鼠和对照小鼠的外周血经FACS分类为CD71、Ter-119双阳性细胞。用qRT-PCR检测分选细胞的RNA中β-珠蛋白和β-2-微球蛋白看家基因的表达。结果表示每组四到五只动物的平均±SEM，并以相对表达水平报告，该相对表达水平设置了用空pLeGO-iG转导的小鼠中β-珠蛋白表达为1。根据Student’st吨测试*，P<0.05；**，P＜0.01。

Jonas S.Jutzi等人，《实验医学杂志》，2013年5月6日；210(5):1003-1019.

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图3。来源：MPN患者存在转录因子NF-E2的周期性截断突变。

突变NF-E2对WT NF-E2 mRNA水平和蛋白质稳定性的影响。（A）从五名携带NF-E2突变的患者、七名携带WT NF-E2的MPN患者和三名健康对照的纯化粒细胞中分离出RNA，并对人类NF-E2和β-2-微球蛋白看家基因表达进行定量RT-PCR分析。每个平板上都包含一条已知NF-E2拷贝数的标准曲线。根据标准曲线测定NF-E2和β-2-微球蛋白的样本拷贝数，并用相对比率表示（拷贝数NF-E2/10^三β-2-微球蛋白分子）。显示了平均值和SEM。*，P<0.05；**，P＜0.01（B）通过qRT-PCR检测表达所指示的NF-E2突变体的小鼠和对照小鼠的小鼠骨髓中NF-E2和β-2-微球蛋白持家基因的表达。结果代表每组四到五只动物的平均值±SEM(n个=2空），并以相对比率报告（副本号NF-E2/10^三β-2-微球蛋白分子）。根据Student’st吨测试*，P<0.05；**，P<0.01。表达WT NF-E2的（C和D）CB3细胞与表达262aa NF-E2截短突变体的病毒或空对照病毒共同转染。如图所示，用20µg/ml环己酰亚胺处理细胞以抑制从头合成蛋白质，并通过Western blotting对细胞提取物进行长达6小时的NF-E2蛋白质水平检测。污点代表了n个=4个独立实验。（D）使用非线性最佳拟合回归模型计算WT NF-E2蛋白在262aa截断突变存在或不存在时的半衰期。图表描述了n个=4个独立实验。*，P<0.05。

Jonas S.Jutzi等人，《实验医学杂志》，2013年5月6日；210(5):1003-1019.

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图1。来源：MPN患者存在转录因子NF-E2的周期性截断突变。

MPN患者的NF-E2突变导致DNA结合的截断和丢失。（A） NF-E2蛋白的示意图（顶部）和MPN患者中检测到的突变导致的截短（底部）。点缀条表示由p.E261RfsX44和p.P79LfsX32的移码突变引起的氨基酸序列改变。一个缺口标记了p.E297-R300del中缺失的四种氨基酸。WT NF-E2和NF-E2突变体的（B和C）EMSA。（B）用编码WT NF-E2（通道2）、MafG（通道3）或两者（通道4-8）的表达载体转导的HEK-293细胞的核提取物与³²含有NF-E2结合位点的P标记寡核苷酸（）。在通道5和6中，添加了100倍过量的非放射性寡核苷酸，即共识NF-E2（通道5）或阴性对照NF-κB（通道6）。或者，添加NF-E2抗体（通道7）或对照NF-κB抗体（通道8）。（C）用编码WT NF-E2（泳道1）或指示的NF-E2突变体（泳道2-4）以及MafG的表达载体转导的HEK-293细胞的核提取物。（B和C）一个填充的箭头表示特定的NF-E2–DNA复合物。开环显示与DNA探针的非特异性结合。EMSA中经常观察到非特异性条带的可变结合（）。（D）对B和C中用于EMSA的细胞提取物中的蛋白质表达进行SDS-PAGE分析，并通过Western blotting检测NF-E2（顶部）和β-肌动蛋白（底部）的表达。填充箭头表示全长的WT NF-E2，而开放箭头表示较小的截短NF-E2蛋白质。B–D分别代表三个独立实验。（E）通过Western blotting检测健康对照组（HC）和两名携带NF-E2截断突变的患者的蛋白提取物（UPN 202:262 aa截断；和UPN 241:248 aa截断，见）的NF-E2（顶部）和β-肌动蛋白（底部）表达。右外侧泳道用作阳性对照，并描绘了表达WT和262aa截短的NF-E2的慢病毒转导的CB3细胞。填充箭头表示全长WT NF-E2，开放箭头表示较小的截短NF-E2蛋白，星号表示非特异性带。显示了三个独立实验的代表性印迹。

Jonas S.Jutzi等人，《实验医学杂志》，2013年5月6日；210(5):1003-1019.

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