11032806【PMID】-PMC-NCBI

图来源：MEKK2基因破坏导致细胞因子产生减少，以响应ES细胞源性肥大细胞的IgE和c-Kit配体刺激。

图5。RPA结果显示野生型和MEKK1中用KL刺激1小时后IL-4和TNF-α的mRNA生成^–/–ESMC。肥大细胞被剥夺c-Kit配体（KL）16小时。对于c-Kit结扎，细胞暴露于重组KL（250 ng/ml）1 h并裂解。通过磷成像仪分析进行定量，并将结果归一化为每个样本的L32和GAPDH mRNA表达水平。结果表明，野生型与MEKK1相比，细胞因子mRNA的产生没有显著差异^–/–ESMC。

Timothy P.Garrington等人，EMBO J.2000年10月16日；19(20):5387-5395.

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图来源：MEKK2基因破坏导致细胞因子产生减少，以响应ES细胞源性肥大细胞的IgE和c-Kit配体刺激。

图3。MEKK2公司^–/–与野生型ESMC相比，ESMC具有正常的肥大细胞形态、颗粒含量和FcεRI和c-Kit受体表达。(A类)野生型和MEKK2的电子显微照片^–/–ESMC。细胞培养4周。存在肥大细胞颗粒。细胞表面也可见典型的肥大细胞的短绒毛突起（）。(B类)野生型和MEKK2小檗碱染色^–/–肥大细胞。小檗碱可将肥大细胞颗粒的成分肝素染色（；）。中性粒细胞染色用作阴性对照（未显示）。(C类)塞浦路斯^三-野生型和MEKK2标记抗体染色^–/–肥大细胞的糜蛋白酶，一种对肥大细胞颗粒特异性的酶（）。（D和E）流式细胞术。用于c-Kit染色(D类)用FITC-抗c-Kit抗体处理细胞。阴性对照（阴影）未经治疗。FcεRI染色(E类)，用抗DNP IgE处理细胞，清洗，然后用FITC–抗IgE进行处理。阴性对照组（阴影）仅接受FITC–抗-IgE治疗。野生型和MEKK2^–/–细胞表达两种受体的数量相等。在测试时，ES-derived肥大细胞培养物的培养时间为50-60天。

Timothy P.Garrington等人，EMBO J.2000年10月16日；19(20):5387-5395.

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三。

图。来源：MEKK2基因破坏导致细胞因子产生的损失，以响应ES细胞衍生的肥大细胞的IgE和c-Kit配体刺激。

图2。MEKK2的基因靶向。(A类)敲除矢量设计。外显子显示为填充框，并显示用作Southern blot分析探针的DNA片段的位置。起始位点（ATG）位于第一外显子的3′端。敲除区包括第一个外显子的一部分，该外显子包含起始位点以及下游内含子和以下外显子部分。B、，巴姆你好；N、，不是我；不，Nhe公司我；X、，Xba公司我；X小时，Xho公司我；Neo、新霉素耐药基因；胸苷激酶基因。(B类)Southern blot分析使用Xba公司我消化了基因组DNA。野生型DNA的片段大小为9kb。在敲除细胞中，片段大小为4.5 kb。(C类)蛋白质印迹分析。细胞裂解物中的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，转移到硝化纤维过滤器中，并用识别MEKK2 N末端的抗体进行检测。MEKK2 C末端的抗体也未能在MEKK2中检测到MEKK1^–/–单元格（未显示）。

Timothy P.Garrington等人，EMBO J.2000年10月16日；19(20):5387-5395.

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图来源：MEKK2基因破坏导致细胞因子产生减少，以响应ES细胞源性肥大细胞的IgE和c-Kit配体刺激。

图1。MEKK2受FcεRI连接刺激，并能刺激TNF-α启动子活性。(A类)将含有小鼠5′-TNF-α的萤光素酶报告基因构建体电穿孔到MC/9肥大细胞中。然后用抗卵清蛋白IgE处理细胞过夜，洗涤并用卵清蛋白（IgE-ova）处理。卵清蛋白刺激后6小时，细胞被裂解，荧光素酶活性被测定。经IgE-ova处理的细胞活性比未经处理的细胞高3-4倍。(B类)为了确定MC/9细胞的IgE-ova刺激对内源性MEKK2活性的影响，使用前面描述的方法进行了MEKK2-激酶分析（）。在20分钟的时间过程中，经IgE-ova刺激的MEKK2活性是对照MEKK1活性的两倍，在10分钟时达到峰值。(C类)为了确定MEKK2对TNF-α荧光素酶活性的直接影响，用野生型MEKK2[MEKK2-（WT）]、激酶活性MEKK2-[MEK02（KM）]或对照质粒（pCMV5）以及TNF-β荧光素瘤酶对MC/9细胞进行电穿孔。虽然激酶激活的MEKK2对荧光素酶活性没有影响，但野生型MEKK 2的转染导致荧光素素酶活性增加60倍，表明MEKK 2中的激酶活性对TNF-α启动子活性的正向调节很重要。累积起来，这些结果表明MEKK2参与了从FcεRI激活到TNF-α基因表达的通路的调节。

Timothy P.Garrington等人，EMBO J.2000年10月16日；19(20):5387-5395.

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图来源：MEKK2基因破坏导致细胞因子产生减少，以响应ES细胞源性肥大细胞的IgE和c-Kit配体刺激。

图4。(A类)c-Kit配体（KL）刺激后ESMC中IL-4 mRNA表达的时间进程。肥大细胞被剥夺KL 16小时。对于c-Kit结扎，细胞暴露于重组KL（250 ng/ml），然后在每个指定的时间点进行裂解和RNA提取。然后进行核糖核酸酶保护分析。结果显示，与MEKK2相比，野生型在刺激后0、30、60、90和120分钟产生IL-4 mRNA^–/–ESMC如图所示。结果通过磷成像仪分析进行量化，并归一化为每个样本的L32和GAPDH mRNA表达水平。野生型ESMC中IL-4 mRNA的表达是MEKK2的5到10倍^–/–ESMC。(B类)IgE ova和/或KL刺激后ESMC中五种不同细胞因子mRNA表达的RNase保护分析。肥大细胞被剥夺KL 16小时。对于c-Kit结扎，细胞暴露于重组KL（250 ng/ml）1 h。对于FcεRI结扎，细胞与抗卵清蛋白IgE（0.8µg/ml）孵育过夜，清洗并在37°C下孵育2小时。然后用10µg/ml的卵清蛋白处理它们1 h并进行裂解。对于共同刺激，用两种刺激物处理细胞1小时并进行裂解。(C类)通过磷成像仪分析进行定量，并将结果归一化为每个样本的L32和GAPDH mRNA表达水平。结果显示，MEKK2刺激1 h后，IL-4、TNF-α、IL-6和GM-CSF的mRNA生成减少^–/–ESMC与野生型ESMC相比，IL-9 mRNA的产生保持不变。

Timothy P.Garrington等人，EMBO J.2000年10月16日；19(20):5387-5395.

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图来源：MEKK2基因破坏导致细胞因子产生减少，以响应ES细胞源性肥大细胞的IgE和c-Kit配体刺激。

图6。刺激ESMC或MC/9肥大细胞中的ERK、JNK、p38和BMK1/ERK5，以响应c-Kit和/或FcεRI结扎。肥大细胞被剥夺c-Kit配体（KL）16小时。对于c-Kit结扎，将细胞暴露于重组KL（250 ng/ml）30 min并进行裂解。对于FcεRI结扎，细胞与抗卵清蛋白IgE（0.8µg/ml）孵育过夜，清洗并在37°C下孵育2小时。然后用10µg/ml的卵清蛋白处理15分钟并进行裂解。对于与KL和IgE-ova共同刺激，在卵清蛋白治疗前15分钟用KL处理细胞，因此用KL刺激30分钟，用ova刺激15分钟。对于紫外线刺激（UV-C），将细胞在2厘米的距离（100焦耳/米）下暴露32秒²)并在37°C下额外孵育一小时后裂解。使用GST–c-Jun的激酶分析测定JNK活性_(1–79)结合谷胱甘肽–作为底物的Sepharose珠。(A类)MEKK2对UV-C的JNK活性正常^–/–ESMC与野生型ESMC的比较。(B类)MEKK2中的JNK活动^–/–经KL、IgE-ova或KL和IgE-oba联合治疗后，ESMC显著降低。(C类)在MEKK1中还测量了FcεRI连接引起的JNK活性变化^–/–ESMC。JNK活性无差异，表明对JNK活动的影响是MEKK2特异性的。(D类)使用抗磷酸化p44/p42 MAPK抗体通过western blot评估ERK磷酸化程度。与JNK相反，野生型和MEKK2之间的磷酸化没有显著差异^–/–看到了ESMC。(E类)为了测量p38活性，使用ATF-2作为底物的激酶分析（；）。与ERK相似，野生型和MEKK2之间p38-MAPK无差异^–/–看到了ESMC。这些结果通过使用抗磷酸p38抗体的western blotting得到了证实。(F类)使用western blot分析测定MC/9肥大细胞中BMK1/ERK5的活性，以显示受刺激细胞中BMK1/ERK5蛋白的凝胶位移，表明BMK1/ER K5磷酸化。先前已经证明BMK1/ERK5的凝胶位移与激酶活性相关（）。如上所述，用IgE-ova和KL刺激MC/9细胞。作为阳性对照（），用0.4 M山梨醇处理细胞30分钟。结果表明，IgE-ova和KL均可增加受刺激肥大细胞的BMK1/ERK5活性。

Timothy P.Garrington等人，EMBO J.2000年10月16日；19(20):5387-5395.

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