1.简介
近年来，随着基因治疗的发展，尤其是CRISPR/Cas系统，质粒作为治疗工具的应用正在兴起。这种新方法的主要缺点是核酸的不稳定性，核酸在体内被核酸内切酶迅速降解[1]以及细胞对外源裸质粒的低效内化。此外，CRISPR/Cas系统的成分（导向RNA和CRISPR相关内切酶）通常被传递到大质粒载体（9–19 kb）编码的细胞中[2]. 由于其体积大，这些载体很难转染，并且具有潜在的细胞毒性[3]. 因此，开发高效、安全的基因转移载体对基因治疗的成功至关重要。 基于病毒载体和非病毒载体的不同基因传递系统已经出现，如脂溶蛋白或聚合物纳米颗粒[4,5,6,7]尽管到目前为止没有一个是完全令人满意的。病毒提供了高效的转导、持久性和细胞向性，但它们有一些重要的缺点，阻碍了它们在临床实践中的应用。这些包括货物遗传物质的有限尺寸（包装容量）、它们在基因组中的随机整合、重复给药后产生的免疫原性反应及其潜在毒性[8]. 非病毒载体由于其相对于病毒的优势，如可预测的安全性、易于大规模生产和质量控制、增强的多功能性、持续的货物释放和大规模核酸装载能力，目前受到了关注。然而，它们的特异性和传递效率目前低于病毒系统。 从这个意义上讲，聚乳酸-聚乙二醇纳米颗粒（PLGA-NP）由于其高生物相容性和低毒性，已成为科学和生物医学研究领域的重要载体[9]. PLGA的主要优点之一是在水解时产生乳酸和乙醇酸，这两种内源性代谢产物可以通过克雷布斯循环降解[10]. 这使得毒性最小，并使PLGA成为人体最容易代谢和耐受的聚合物之一。此外，PLGA-NP可以封装不同的货物，从小型疏水性和亲水性药物到核酸和蛋白质[11,12,13,14,15]. 此外，PLGA-NP可以很容易地与改变其电荷、疏水性、血液循环半衰期的分子结合，甚至可以选择性结合到某些细胞类型[16]. 这些特性增强了PLGA纳米粒作为纳米药物递送系统（nanoDDS）在多种疾病中的应用，包括心血管疾病[17,18]、神经变性[19,20]炎症和免疫系统疾病[21,22]，感染[23]，癌症[24,25]、再生医学[26,27]甚至在不可知论和疫苗领域[28,29]. 这些基于PLGA的纳米DDS的功效已经在临床试验中得到验证[30]以及阿特拉多等药物的制造®（为牙周治疗提供强力霉素）、善得定®（含奥曲肽治疗肢端肥大症）和Lupron仓库®（与亮丙瑞林合用治疗前列腺癌）已获FDA和EMA批准，并已上市[31]. 与纳米DDS封装药物PLGA不同，PLGA纳米粒作为基因治疗载体的应用仍处于起步阶段。事实上，除了少数例外，研究仅限于体外检测和传递小的非编码RNA，如siRNA[32,33,34]. 此外，值得注意的是，大多数PLGA纳米粒子用于质粒封装的研究都采用了小尺寸结构（小于6 kb）[35,36,37]然而，如上所述，编码基因编辑成分（即Cas9和导向RNA）需要更大的（9–19 kb）质粒。 PLGA纳米粒可以使用不同的技术合成，从而获得在尺寸、水解时间、形状、表面电荷、货物完整性和后续细胞吸收效率方面具有不同性质的纳米粒子。
油水双水法合成PLGA纳米粒子(w个/o个/w个)乳剂是亲水性药物封装的金标准，根据每种应用的规格和需求，已开发出衍生的改良方法，因为乳剂可以最大限度地控制所制备纳米粒子的物理化学性质[35,38,39,40,41]. 该技术包括通过超声乳化一种水不溶性有机相（油），该有机相含有溶解的聚合物，可与表面活性剂或稳定剂（水）形成纳米粒子。第一种乳液有助于形成小聚合物液滴。将所得乳液添加到较大的水相中并搅拌数小时，使溶剂蒸发并触发纳米颗粒的形成[40]. 如果药物是疏水性的（当使用单油包水乳剂时），则可以溶解到有机相；如果是亲水性的（对于双水相w个/o个/w个乳液）。在以PLGA为基础的核酸纳米粒子用作基因治疗载体的情况下，已报道了使用不同有机和水溶剂/表面活性剂的双乳液溶剂蒸发法，如聚乙烯醇（PVA）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、Span 80、十二烷基硫酸钠（SDS）、Triton X-100、，吐温20和吐温80[35,42]. 然而，超声波超声乳化有几个缺点：（1）可扩展性有限，因为它只对小批量制剂有效高电压产生高温，可能影响对温度敏感的货物[43]. 或者，纳米沉淀（或溶剂置换法）依赖于有机和水溶性溶剂的混合物，利用聚合物在其中一种溶剂中的低溶解度，在有机溶剂蒸发时诱导聚合物沉淀为纳米粒子，通常通过搅拌或减压。尽管这种方法最初是为疏水性化合物包埋而设计的[44]，它最近被改性为亲水化合物，如DNA[45,46]. 基于超声波的乳化和纳米沉淀大多在不连续的批处理过程中进行，批处理之间的再现性和可扩展性有限，阻碍了快速转移到临床。另一方面，微流体技术是一种新技术，可以根据需要使用单乳液、双乳液和纳米沉淀制备聚合物纳米粒子，具有连续制造和严格控制合成参数的巨大优势。微流体技术允许利用两相之间的界面张力作为驱动力，利用集成在微反应器中的微通道通过分子扩散形成纳米颗粒[47]. 这些微通道的几何形状（即T形结、交叉结、Y形结和流动聚焦装置）能够实现多个接触方向、表面和相之间的流速，从而产生具有不同性质的纳米颗粒[48]. 连续流微反应器可以更好地控制合成过程，从而降低多分散性并促进多级处理[49]. 这项技术相对较新，据我们所知，只有一篇关于以微流体为基础合成核酸负载的PLGA NPs的报告，该NPs使用siRNAs作为载体[50]. 重要的是，与超声波辅助的双乳化技术相比，微流体辅助的纳米沉淀和乳化技术更温和（这需要超声和延长搅拌速度以允许溶剂蒸发，并且可以达到高温），这有利于保存负载的核酸结构，因此，功能性。
为了将其用于基因治疗，这些技术主要用于封装小核酸，如siRNAs（20-25个核苷酸）。然而，如前所述，新的基因编辑系统，如CRISPR/Cas9，需要能够容纳更大核酸的载体，如高分子量质粒。这些质粒的物理化学性质不同于小的非编码RNA，不仅在大小上不同，而且在电荷、结构和对压力的敏感性上也不同，这对于验证和优化先前建立的PLGA NP合成协议以封装这类核酸至关重要。
在这项工作中，我们评估了两种不同的合成方法（双乳液法和纳米沉淀法），用于将9.4kb的大质粒封装在PLGA纳米粒中。在这些技术中，我们测试了两种不同的分批辅助合成技术（超声波超声和磁力搅拌），并将结果与使用连续流动微流体辅助双乳液技术获得的结果进行了比较。
任何纳米疗法的疗效都很大程度上取决于纳米颗粒在靶细胞中的有效内化，这在很大程度上依赖于纳米颗粒的表面功能化和粒径，纳米颗粒的最佳直径在70~200nm之间[51,52,53]. 表面电荷对细胞摄取、影响内化途径和允许内体逃逸也至关重要[54,55]. 最后，在纳米载体作为基因表达载体载体的情况下，必须实现DNA保存。总的来说，所有这些因素都使最佳纳米颗粒载体的概念成为一项复杂的任务。 具体而言，我们比较了所制备纳米粒子的物理化学性质（形态、粒径、纳米粒子形成效率、表面电荷、包裹效率和负载质粒DNA的结构完整性），以显示当前可用技术的优缺点。值得注意的是，这篇手稿将首先讨论基于微流体的质粒DNA-负载PLGA-NP的合成。
综上所述，我们的数据表明，当加载高分子量核酸时，根据先前报告的方案合成的PLGA NP的生物物理特性和体外行为存在重大差异。这些结果为该领域的科学家提供了基因加载程序的详细比较，并强调了在使用纳米载体作为高分子量核酸的传递载体（如CRISPR/Cas基因编辑系统）时需要进一步完善。
2.材料和方法
2.1. 试剂
消光镜®RG 503H聚乙烯(d日,我-丙交酯-有限公司-乙交酯）（PLGA-COOH）、二氯甲烷（DCM）、胆酸钠、聚乙烯醇（PVA，分子量：85000–124000 Da）、吐温®20、吐温®80，α-巯基-ω-羧基-PEG（聚乙二醇），Triton™X-100，Pluronic®F-127、二甲基甲酰胺（DMF）、6,13-二（三异丙基硅烷基）并五苯（TIPS并五苯）和无水四氢呋喃（THF）购自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）。PLGA-NH公司2（50:50，20kDa）购自Genochem World（西班牙巴伦西亚）。
质粒DNA（pDNA）从DH5中获得α细菌（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）经DC-RFP-SH01质粒（pRFP质粒）转化（GeneCopoeia™，马里兰州罗克维尔，美国）。pRFP长度为9431 bp。
运动神经元样NSC-34细胞系，用于pDNA-负载的PLGA NPs的细胞内化分析，从雪松实验室购买，并在高糖（4.5 g/L）Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）中生长，10%(v（v）/v（v）)胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100μg/mL）。当将这些细胞接种在涂有胶原蛋白a的塑料表面上，并在37°C、95%相对湿度和5%CO的条件下培养时，这些细胞会粘附生长2.
2.2. 质粒DNA的分离
pDNA是从在Luria–Bertani（LB）培养基中生长的O/N细菌细胞培养物中分离出来的，并使用Endofree提取®Plasmid Mega试剂盒（QIAGEN，Germantown，MD，USA）符合制造商的协议。
2.3. 表面活性剂对pDNA构象测定的影响
pDNA在RT下与以下溶剂混合物孵育3小时：DCM、DCM+0.01%胆酸钠、DCM+0.3%胆酸纳、DCM+6.6%胆酸钠，DCM+1%胆酸钠盐、DCM+1%PVA、DCM+1%（41%吐温80+59%吐温20）和DCM+1%Triton X-100，模拟双乳化过程中的条件。随后加载到含有gel-Green核酸染色剂（Biotium，Fremont，CA，USA）的TBE缓冲液（8.9 mM Tris，8.9 mM硼酸，0.2 mM EDTA，pH 8.4）中的1%琼脂糖凝胶上，电泳解决了每个样品中存在的不同构象。使用在不含脱氧核糖核酸酶的Milli-Q水中纯化的pDNA储备作为对照，证实样品中仅存在超螺旋功能构象。通过在60 V下使电泳凝胶运行至少40 min，可以充分分离超螺旋、线性和开放圆形质粒DNA的带。使用紫外线透射仪（Vilber Lourmat，TCX-20C，Collégien，法国）获取图像。
2.4. 双乳液溶剂蒸发法结合分批超声法（超声辅助w/o/w）合成DNA负载PLGA纳米粒子
使用超声波浴将总共50 mg PLGA-COOH溶解在3 mL DCM中。随后，1 mL水相（900μL 33.33μg/mL质粒，置于Milli-Q水中，再加100μL 0.1%胆酸钠(w个/v（v）))在4°C下添加，并在冰浴中用精密声波发生器（Branson数字声波发生器®西班牙马德里Fisher Scientific）20 s，振幅40%。8 mL，1%(w个/v（v）)加入胆酸钠，再次以40%的振幅对混合物进行超声处理40s。添加12 mL 0.3%后(w个/v（v）)胆酸钠，纳米颗粒溶液在通风橱中室温下蒸发3小时。最后，在8500×克RT下每分钟转数15分钟，倒出上清液并保存以量化DNA封装，并将颗粒重新悬浮在2mL Milli-Q水中。因此，这种方法将被命名为“标准超声辅助双乳液”。
本研究包括一种改进的双乳液法，即“改进的超声辅助双乳液法”。该变体使用了上述合成方法，并进行了以下修改。pDNA先前与PEG孵育（比例1:15w： w个)之前有报道称，它可以在合成过程中改善质粒结构的保存[56]，在室温（RT）下保持1小时。此外，超声处理时间减少到10秒和20秒，以最大限度地减少pDNA的超声暴露时间，同时仍允许形成NP。 2.5. 微流体辅助双乳液溶剂蒸发法合成DNA负载PLGA纳米粒子（微流体辅助w/o/w）
所使用的微流体系统与我们小组（Larrea等人，2017）之前描述的生产系统类似w个/o个/w个连续流动的双乳液。两个狭缝叉指微混合器串联组装，以促进双乳液的连续形成。在我们之前的手稿中，我们将金前体和柠檬酸钠装入第一个微混合器（w/o乳液）中，并在形成双混合器后w个/o个/w个在第二个微混合器中对乳液进行加热，以促进金离子前体还原为金纳米粒子。这一过程产生了192±58nm直径的PLGA NP，其内腔选择性地负载有Au NP。内部体积为8µL的狭缝叉指微混合器（德国美因茨Micro4Industries GmbH）与一根聚四氟乙烯（PTFE）管（外径=1/1600，内径=1 mm）连接。微流体系统中的入口流标记为I1、I2和I3，I1和I2在第一个微混合器中混合，所得流在第二个微混合剂中与I3混合。使用三个注射泵（美国马萨诸塞州霍利斯顿市哈佛仪器公司）注射试剂。
通过选择不同的有机溶剂和货物（金纳米粒子前体被pDNA取代），合成条件根据先前的研究进行了调整，如下所示。I1流是内部水相，由0.01%组成(w个/v（v）)胆酸钠和30μg pDNA溶解在3 mL Milli-Q水中。通过向20mL DCM中加入50mg PLGA-COOH来制备有机流I2。在第一个微混合器中分别以4.5和13.5 mL/min的流速注入I1和I2。产生的初级乳液(w个/o个)将I1和I2混合后产生的产物注入第二个微混合器中以形成双乳液(w个/o个/w个)借助I3流。在这一点上，我们引入了表面活性剂作为合成变量。因此，为该方法建立了两种变体：一种使用胆酸钠，另一种使用聚乙烯醇。这两种表面活性剂的选择是基于表面活性剂对pDNA构象测定的影响结果。因此，通过溶解1%的胆酸钠（微流体辅助）制备I3流w个/o个/w个含胆酸钠）或1%聚乙烯醇(w个/v（v）)（微流体辅助w个/o个/w个在50 mL Milli-Q水中加入PVA），并以36 mL/min的流速注入相同体积的0.3%胆酸钠（用于微流体辅助w个/o个/w个使用胆酸钠）或1%聚乙烯醇（用于微流体辅助w个/o个/w个PVA）(w个/v（v）)添加到最终收集的乳液中。最后，在开瓶中以600 rpm的速度连续搅拌蒸发有机溶剂3 h，在8500×克RT条件下每分钟转数15分钟，收集上清液以量化pDNA包封，并将颗粒重新悬浮在Milli-Q水中(图1). 2.6. 分批磁混合纳米沉淀法合成DNA负载PLGA纳米粒子
负载DNA的PLGA纳米粒子是通过Jo等人（2020年）之前描述的改进的纳米沉淀法制备的，对纳米粒子沉淀步骤进行了轻微修改。简单地说，通过涡流将100 mg Pluronic F127溶解在20 mL Milli-Q水中，然后在超声波浴中超声30 min，在600 rpm下磁力搅拌30 min。在磁力搅拌期间，分别制备溶于DMF（44.48 mg/mL）中的PLGA溶液和溶于THF（0.667 mg/mL）的TIPS并五苯溶液。随后，在1.5 mL离心管中合并562μL PLGA储备液、562μL TIPS并五苯储备液和126μL TE缓冲液中的质粒DNA溶液（4.07 mg/mL），并轻轻混合，直至外观均匀。使用输液泵将所得混合物滴入Pluronic F-127水溶液中（30 mL/h），同时以600 rpm的转速进行磁力搅拌。将最终溶液留在冰上搅拌5 h，覆盖以保护TIPS并五苯免受光照，最后在4°C和8500×克15分钟(图1). 收集上清液以量化pDNA包封，将颗粒重新悬浮在2mL Milli-Q水中，并保存在4°C下。 在本实验中，测试了两种类型的PLGA：阳离子氨基端化PLGA（PLGA-NH2)和阴离子羧基终止的PLGA（PLGA-COOH）。
2.7. 纳米粒子形态
使用CSEM-FEG Inspect 50场发射扫描电子显微镜（SEM）（美国俄勒冈州希尔斯堡FEI公司）在高真空和20kV加速电压下观察纳米颗粒形态。对于样品制备，将相应的纳米颗粒分散液滴放在载玻片上，用碳带固定在SEM显微镜支架上，空气干燥并用钯溅射以促进电子传导。
2.8条。粒度测量
为了确定得到的粒径，使用透射电子显微镜（TEM）测量颗粒（Tecnai F30，FEI公司，俄勒冈州希尔斯堡，美国）。使用溶于Milli-Q水（30 mg/mL）中的磷钨酸，以1:1的比例混合，对纳米粒子分散体进行有机染色(v（v）:v（v）)与聚合物样品的比例，并孵育45分钟。清洗以去除多余的磷钨酸后，将样品放置在TEM网格上（碳纤维铜显微镜架，电子显微镜科学FCF200-Cu），并使用FEI Tecnai T20显微镜拍摄图像。图像以不同的放大倍数拍摄，并使用ImageJ软件v.1进行处理（公开网址：https://imagej.nih.gov/ij/（于2021年10月7日访问），以确定每个颗粒的最小Feret直径。每个样品中至少测得100个纳米粒子。结果表示为直径大小分布和平均直径±SD。 2.9. 纳米粒子合成产率
为了量化PLGA NP合成产率，对3个金属盘进行称重，一式三份，以最小化误差（TYPUYA超微天平，TYP MEDICIONES™，西班牙阿尔巴塞特）。随后，将25μL相应NPs分散液添加到每个孔中。允许溶液在80°C的烘箱中蒸发过夜，然后重新称量金属盘，以通过质量平衡计算PLGA NP浓度。
PLGA NP的总产率由PLGA NP浓度计算，并通过应用以下方程与用于合成的PLGA聚合物的初始量相关： 2.10. 纳米粒子Zeta电位
Zeta电位通过使用Brookhaven 90Plus粒度分析仪和BIC PALS Zeta电位分析仪软件（均可从美国纽约州Brookhavin Instruments Corp获得）的相位分析光散射测定。参数设置如下：运行次数（5）、循环次数（30）、再悬浮液（水）。还设置了pH值和颗粒性质。为了使读数有效，电导和样品计数率分别高于20μS和320 kcps。
2.11. pDNA封装效率和结构完整性分析
通过测量合成过程中添加的pDNA总量与纳米粒子离心后从上清液中回收的游离pDNA量之间的差异，确定加载到PLGA纳米粒子中的DNA量。根据制造商的说明，使用Qubit™1X dsDNA高灵敏度试剂盒（Thermo Fisher Scientific Q33231，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和Qubit®4荧光计设备（Thermo-Fisher scientification，美国马萨诸塞州沃瑟姆）定量上清液中的pDNA浓度。
通过琼脂糖凝胶电泳分析评价了负载质粒的结构完整性。为此，20μL PLGA NP在20000×克合成后，将NP颗粒在4°C的水中孵育45分钟，促进PLGA水解并将封装质粒释放到水相中。将含有释放的pDNA的水相装入1%琼脂糖凝胶中。凝胶电泳和图像采集的条件如上所述。
如所示补充图S1质粒可以采用各种空间构象，形成超螺旋、线性、松弛、缺口开环和变性超螺旋亚型。超螺旋DNA指数（SCI）定义为超螺旋DNA带的集成密度与样品中所有带的总集成密度之比。类似地，每个质粒亚型的相对存在可以通过将预期带的集成密度除以样品中所有带的总密度来计算。 通过从给定波段的净积分强度中减去相同区域的净背景积分密度，计算出每个SCI波段的积分密度。
2.12. DNA释放曲线
在量化Qubit™1X dsDNA高灵敏度试剂盒释放的pDNA浓度之前，通过20000×克并RT 45分钟，收集上清液用于DNA定量。pDNA释放率用以下等式表示为包裹质粒数量的百分比： 2.13. 细胞活性测定
将NSC-34细胞以5000个细胞/孔的速度接种在96 well板中，并与通过PLGA-NH纳米沉淀合成的pDNA负载或空纳米粒子孵育2在37°C和5%CO条件下，以不同浓度（0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL和0.4 mg/mL）持续24小时2因此，将雷沙祖林（Sigma，R7017）以0.1mM的最终浓度添加到每个孔中并孵育6小时。最后，在Synergy 4荧光光谱仪（BioTec Instruments，Winooski，VT，USA）中使用530nm激发滤光片和590nm发射滤光片测量荧光。
本试验中的对照组包括未经处理的细胞（阴性对照）、在磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育12小时的细胞（诱导细胞死亡，阳性对照）以及在无细胞（背景）的微孔中以0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL和0.4 mg/mL稀释在生长培养基中的PLGA NPs。
2.14条。细胞内化分析
2.14.1. 荧光定量分析pDNA负载的PLGA-NPs细胞内化
将NSC-34细胞以280500个细胞/孔接种在6孔板中，并在37°C下培养过夜。第二天，将0.2mg/mL通过用氨基封端的PLGA进行纳米沉淀合成的pDNA负载的NP添加到培养基中，并与细胞孵育24或48小时（每个条件三次重复）。未经处理的细胞作为对照。培养后，用PBS清洗细胞两次，以去除非内部化NP。随后，用刮刀机械去除细胞，进行计数，并将其重新悬浮在500µL蒸馏水中进行溶解。将每个p6孔对应的裂解体积分配到96 well板中（每个裂解物重复5次）。同时，用不同浓度的TIPS负载PLGA纳米粒在蒸馏水中制备校准曲线。最后，在Synergy4荧光分光光度计中记录平板的荧光，并通过插入标准曲线计算每个细胞中内化PLGA NP的数量。
2.14.2. 用共焦显微镜观察pDNA负载的PLGA-NPs细胞内部化
将NSC-34细胞以15000个细胞/孔接种在µ-载玻片8孔ibiTreat板中，并在37°C下培养过夜。因此，在不同的时间点（4小时、8小时、12小时、24小时和48小时），用用氨基终止的PLGA纳米沉淀法合成的载pDNA的NP处理细胞，并用4%多聚甲醛固定在PBS中。未经处理的细胞作为对照。
固定后，细胞渗透并用1%BSA溶液染色(w个/v（v）)，0.1%皂苷(w个/v（v）)和1:200 Alexa Fluor™488鬼臼苷在PBS中于黑暗条件下放置1小时，用PBS洗涤并在共焦显微镜下制备，添加带有DAPI的安装介质（16滴Vectashide中含有10µL DAPI®防褪色安装介质，矢量实验室）。最后，使用共焦显微镜（Spectral Zeiss LSM 880，卡尔蔡司显微镜GmbH，Jena，Germany，Aragón生物医学研究中心显微镜和成像服务处提供）分析pDNA-loaded PLGA NPs细胞摄取。
2.15. 细胞转染试验
将NSC-34细胞接种在24孔板（100000个细胞/孔）中，将对应于2μg封装质粒的pDNA负载纳米粒子添加到培养基中，并培养72 h（24 h摄取+48 h表达）。按照制造商的方案转染脂质体胺和2μg pDNA的细胞，并允许质粒表达48小时，作为阳性对照。还包括未处理细胞的阴性对照。每种情况都执行了两次。
对于免疫荧光分析，用10%福尔马林固定细胞30分钟，用1X PBS洗涤两次，并向每个孔中添加500μL 1X PBS和0.5μL DAPI。用倒置荧光显微镜（IX81 Olympus inverted Optics microscope，Olympus Europa Holding GmbH，Hamburg，Germany，Aragón生物医学研究中心显微镜和成像服务处提供）检查细胞转染情况。
2.16. 统计分析
结果显示为平均值±标准偏差。为了确定三种pDNA负载PLGA NP合成技术之间的显著差异，对本研究中分析的每个数值特性进行了三元方差分析统计分析。在95%置信区间内考虑了显著差异(第页<0.05）或99%(第页<0.01），如每种情况所示。
3.结果和讨论
如上所述，许多因素可以影响纳米载体作为基因表达载体的功效。在这些因素中，纳米粒子尺寸、表面电荷、装载能力、货物完整性保存和释放具有特别的相关性，将在本工作的整个过程中对每个合成程序进行分析。
3.1. 不同溶剂对pDNA构象的影响
虽然研究了三种PLGA NP合成程序（超声波和微流体辅助w个/o个/w个和纳米沉淀）依赖不同的物理原理，它们都使用含有溶解PLGA的有机溶液、含有亲水性物质（即pDNA）的水缓冲液和表面活性剂来促进乳液的形成、稳定性和尺寸控制。DCM被广泛用作PLGA溶剂；然而，基于水的缓冲液的性质和浓度在不同的方案中是高度可变的[42]. 所用溶剂类型对质粒的结构完整性至关重要，可能会将pDNA的天然超螺旋亚型修饰成线性、松弛或变性构象。过冷构象具有最高的转染能力，被认为具有转录活性，而其他亚型则会导致功能的显著丧失。 鉴于质粒的高分子量（9.4 kb）和pDNA结构完整性对维持功能的重要性，我们首先旨在分析最常用的有机和水缓冲液对质粒构象的影响。
结果表明，与DCM单独孵育如何产生变性超螺旋pDNA的构象变化(图2，泳道2），与未处理的对照相比，导致琼脂糖凝胶中更快的迁移。这可能是由于DCM的极性较低，因此pDNA是一种亲水性极性分子，其构象可以最大限度地减少与这种有机溶剂的接触。当pDNA暴露于除DCM外还含有胆酸钠或PVA等水溶液的混合物中时，这种效应不存在(图2（分别为3至6车道和7车道）。相反，用DCM加1%（41%吐温80和59%吐温20）培养可在50.18%的质粒中诱导变性过螺旋构象(图2，车道8）。同样，与Triton X-100一起孵育也会产生pDNA的构象变化，在这种情况下，pDNA会变成松弛形式(图2，车道9）。有趣的是，我们的结果表明，大多数非离子表面活性剂（吐温80、吐温20和Triton X-100，但不包括PVA）在接触DCM时无法保持质粒的超螺旋构象。 我们的发现与Doolaanea及其同事所描述的不同，他们报告Triton X-100是一种良好的pDNA结构保护剂[42]. 这些差异可能是由于不同的质粒大小或我们直接将pDNA暴露在溶剂混合物中，而Doolaanea在合成反应中进行了质粒结构分析。 根据我们的结果，在我们的合成条件下，聚乙烯醇和胆酸钠被选为最佳的质粒结构保存剂，并进一步用于超声波和微流体辅助的PLGA NP合成w个/o个/w个程序。
3.2. 载DNA PLGA纳米粒子的形貌、粒径、浓度和Zeta电位
SEM成像证实，所有三种合成程序都能形成球形完整的纳米粒子(图3). 如前所述，任何纳米疗法的疗效都依赖于纳米颗粒在靶细胞中的有效内化，而这又在很大程度上取决于纳米颗粒的大小和表面电荷（zeta电位）。已经证明，尺寸在70~200nm之间的PLGA NP在循环中是稳定的，与尺寸较大或较小的不同[51,52]. 据报道，小于70nm的纳米粒子在肝脏中积聚，并在那里快速代谢。另一方面，大于200 nm的颗粒优先位于脾脏，在那里被巨噬细胞吞噬[53]. 根据TEM图像的测量结果，按照这个顺序，我们的结果表明，与超声波辅助相比，微流体技术产生了更大的纳米粒子（胆酸钠和聚乙烯醇合成分别为212±87和258±140 nm）w个/o个/w个以及纳米沉淀技术，后两种技术在本研究所需的70-200nm尺寸范围内。超声波辅助w个/o个/w个导致中等粒径（标准和改良程序分别为116±24和123±67），纳米沉淀是获得较小纳米粒子的最佳方法（PLGA-COOH和PLGA-NH分别为88±21和93±29 nm2）(表1,图4). 超声辅助双乳液（标准与改性）和纳米沉淀（PLGA-COOH与PLGA-NH）的任何变体合成的纳米颗粒之间均未发现有统计学意义的差异2)方法论。然而，当使用微流体辅助的与胆酸钠或聚乙烯醇的双乳液合成纳米颗粒时，发现两者之间存在显著差异(表1,图4). 与微流体相比，双乳液和纳米沉淀方法的NP尺寸多分散性较低(表1,图3和图4). 有趣的是，通过微流体辅助乳液合成的纳米颗粒的多分散性高于我们之前的研究[43]，即使使用相同的流体动力学参数。这可以用DCM作为有机相中的PLGA溶剂而不是乙酸乙酯来解释，因为乙酸乙酯以前曾被报道会导致DNA降解。两种DCM的不同密度（1.33 g/cm3)和乙酸乙酯（0.90 g/cm3)，不同粘度（DCM和乙酸乙酯分别为0.413 cP和0.428，25°C）和不同极性（DCM与乙酸乙酯的极性指数分别为3.1和4.4）可能会影响剪切应力、通道润湿性、混合效率，从而影响合成过程中的乳液控制，这导致了两个作品之间所产生的多分散性的差异。这些结果也证明了需要特定的NP合成方案和试剂来封装大的pDNA，以保护pDNA结构和控制NP形态。 就NP形成效率而言，基于双乳剂(w个/o个/w个)这些方法的NP产率约为PLGA输入的40%。在微流体辅助的情况下，该产率较低（27.20±10.68%）w个/o个/w个以胆酸钠为表面活性剂的合成方法(表1). 此外，使用氨基端化PLGA的纳米沉淀过程也显示出相对较低的效率（28.48±10.57%），而使用羧基端化PLGA的纳米沉淀效率高达54.96%。 另一方面，NP表面电荷（也称为zeta电位）会影响悬浮颗粒的稳定性，从而影响血液中颗粒的稳定性。接近零（等电点）的Zeta电位促进聚集，而高于30 mV的绝对值使NP在悬浮液中稳定。此外，电荷的符号及其值也决定了粒子与细胞质膜相互作用的方式，因此也会影响其内部化[57]. 尽管当纳米粒子带正电荷时（由于它们与细胞质膜的负电荷残基相互作用），观察到了更好的细胞内化，但带负电荷的纳米粒子也可以内化。目前的假设表明，这种内化是通过受体介导的内吞机制发生的[58]或与细胞膜上带正电荷的特定位点相互作用[59]. 除了内化外，带负电荷的PLGA NP还被证明会经历快速的内溶酶体逃逸，这是由于它们在内溶酶体区室内的表面电荷（从阴离子到阳离子）的选择性反转[54]. 这允许NP与内溶酶体膜相互作用并逃逸到胞浆中，避免溶酶体内货物降解，并允许多种治疗剂（包括DNA等大分子）在细胞内持续释放。 在这项工作中，所有合成方法都得到了带负电荷的PLGA纳米粒子，其zeta电位范围为-33至-57 mV，在改进的超声辅助双乳液法（−57.32±10.16 mV）和使用氨基终止阳离子PLGA法的纳米沉淀中更为负（−46.22±12.49 mV）(表1). 这些差异在改良超声辅助下具有统计学意义w个/o个/w个(第页除使用阳离子PLGA的纳米沉淀法外，所有比较结果均<0.01，第页=0.1653），而它们仅是PLGA-NH纳米沉淀的趋势2. 鉴于氨基端化PLGA的阳离子性质，zeta电位预计为正；然而，高分子量pDNA和PLGA-NH之间的静电相互作用2很可能有利于质粒在纳米粒子表面的积聚，这是pDNA负载的PLGA纳米粒子所观察到的负电荷的原因。DNA是一个带负电荷的分子，这种电荷通常与大小有关（越长，越负）。因此，可以合理地假设，粒子中捕获的质粒数量越大，留在NP表面的pDNA数量就越大，因此，其表面电荷趋于越负。这与观察到的Z电位与不同合成的每个重复获得的包封率之间呈负相关的趋势一致(补充图S2). 当汇集来自不同合成方法和聚合物的数据时，也观察到了这种相关性，尽管引入的更大变异性妨碍了统计显著性。 3.3. PLGA纳米粒子中负载DNA的pDNA封装效率和结构完整性分析
PLGA纳米粒子已证明对许多不同的生物分子具有负载能力，包括核酸、蛋白质和诊断剂，以及传统上用作治疗药物的小分子[11]. 文献中描述的药物的封装效率变化很大，从10%到96%不等，具体取决于纳米粒子类型及其物理化学特性、合成过程和药物性质[37,41,60,61]. 我们的研究也反映了这种可变性，质粒DNA的封装效率在20%到60%之间(表1)，通过微流体辅助合成的NP显著更高w个/o个/w个含PVA（50.91±23.27%）(第页<0.01）和使用PLGA-NH的纳米沉淀2(56.84 ± 16.09%) (第页< 0.01). 有趣的是，与双乳液程序相反，用羧基终止的PLGA进行纳米沉淀合成，结果没有形成包封。这可能是由纳米沉淀过程中聚合物和pDNA之间的静电斥力解释的，与双乳液和微流体不同，在双乳液和微型流体中，其他力，如基于声波的乳化和微反应器通道内的界面张力，起到促进包封的作用。 当使用纳米颗粒作为基因治疗载体时，保持封装基因材料的结构完整性和功能性至关重要。从这个意义上说，我们的结果表明，由于精细的声波作用，超声波辅助的双乳液法导致pDNA分裂成小片段(图5，车道1和补充图S3). 改变超声时间和振幅并不能阻止质粒降解（数据未显示）。从这个意义上说，在分批超声辅助双乳液合成过程中，用聚乙二醇孵育可以保护pDNA的完整性[56]. 然而，在这些条件下，我们的数据显示了广泛的质粒降解（占总pDNA的73.64%），并展开为有缺口的开环亚型（占总p DNA的18.86%）(图5，车道2）。 或者，一些作者已经包括使用均质器代替精细探针超声乳化，报道了开环和超螺旋构象[42]. 然而，在我们手中，均质器的使用并没有保持包裹的高分子量pDNA的结构(补充图S3通道2、3和4），并产生较大的纳米粒子（数据未显示）。 尽管已经报道了超声辅助双乳液溶剂蒸发法用于合成功能性核酸负载的PLGA纳米粒子，但核酸结构并未得到普遍分析，用于制备乳液的声波发生器或均质器可能会引起机械剪切。这种应激导致核苷酸序列中断或将质粒的超螺旋功能构象改变为开放的圆形或线性亚型[62,63]. 此外，这些研究通常使用中到低分子量质粒（通常约5.5kb，但高达7.3kb）进行[35,42,64,65,66]与较大的核酸链相比，它可能对展开或超声撕裂不太敏感。事实上，据我们所知，这是首次验证超声或微流体辅助的大pDNA（9.4 kb）双乳液封装的研究，类似于编码CRISPR/Cas基因编辑系统的研究（通常大小约为9.10 kb）[2]. 另一方面，基于微流体的方法不依赖超声乳化，而是依赖于通过小尺寸微通道的流动。使用微流体辅助的双乳液封装pDNA会产生高剪切应力，从而改变质粒的超螺旋结构。
具体而言，使用胆酸钠进行的基于微流体的合成显示线性和缺口开环异构体分别为64.80±1.99%和35.20±1.99%(表1和图5，车道3），当使用PVA时，结果分别为45.01±26.28%和54.99±26.28%(表1和图5，车道4）。据报道，这两种亚型都能阻止细胞转染[67]再加上大质粒尺寸，这也降低了“本身”的转染效率[3]，导致体外细胞实验中缺乏pDNA表达（数据未显示）。 假设用于双乳液的试剂在分批超声波和微流体辅助合成中很常见，并且不会影响质粒结构(补充图S3)，这可能是通过微通道时机械应力的结果。不幸的是，已经观察到通过降低流体流速来降低剪切应力可以增加纳米颗粒的尺寸和多分散性[68]. 反过来，用氨基终止的PLGA进行纳米沉淀，保留了部分质粒的超螺旋和功能亚型（约42%），而剩下的58%显示出松弛的构象(图5，车道6）。构象松弛可能是由于暴露于合成试剂的组合中所致(补充图S4). 然而，鉴于所获得的高包封率（56.84±16.09%，相当于4.12±1.09 wt.%），并且只要NPs是非细胞毒性的，并且能够实现有效的细胞内化和货物释放，这些纳米结构就有可能在体外诱导pDNA细胞表达。因此，进一步分析了NP细胞毒性、细胞内化和货物释放。 3.4. pDNA-负载NPs的DNA释放谱、体外毒性和细胞内化
用氨基端化PLGA纳米沉淀法合成的纳米粒子的pDNA释放追踪显示，在4℃和37℃下的前24小时内，仅释放了约2.2%和4%的封装pDNA。这一结果可以通过大pDNA和带正电荷的氨基端接的PLGA在水性环境中的静电相互作用来解释，这种静电相互作用的强度足以防止质粒从颗粒中释放或在释放后快速重新吸附，正如之前报道的其他聚合物和货物一样[69,70,71]. 我们小组的初步研究表明，纳米粒子释放的货物也可能因使用的再悬浮液而异。从这个意义上讲，在不同pH值下使用磷酸盐缓冲盐水（PBS），在最初24小时内，pDNA在4°C时的释放率达到40%，在37°C时达到70%(补充图S5A、 B）。这些结果也可以用静电相互作用来解释，因为PBS中含有的盐类会产生与水不同的离子环境，从而改变pDNA和PLGA之间的相互作用。事实上，这些数据与文献一致，在文献中，其他作者报道了在合成后的最初几个小时内，PLGA纳米粒子在PBS中稀释，pH值在4.5到7之间，pDNA释放率高达50%[45,46]. 最后，对于给定的合成方法，所用表面活性剂的改性有助于促进货物的释放[42]; 然而，NP的其他物理化学特性，例如粒径，也会发生变化。 引人注目的是，在37°C的Milli-Q水中孵育72小时后，测得的释放pDNA浓度急剧下降，这与琼脂糖凝胶电泳中观察到的pDNA裂解相一致(补充图S6). 因为这一事件在使用高压灭菌和/或灭菌的不同试剂库存进行的几次合成中被重复观察到，而且还因为pDNA库存在37°C的水中直接培养没有显示质粒降解(补充图S6，通道1），由于试剂和/或缓冲液的DNA酶污染，这种现象不太可能发生。然而，有报道称，在含有伯胺的溶液中，DNA螺旋会发生脱氨基作用[72]例如PLGA-NH2聚合物，在37°C的实验条件下可能会加剧。因此，我们不能排除这种核苷酸裂解是可测量的低质粒DNA释放的基础。 事实上，这一假设与使用PLGA NPs在不同pH值的PBS中稀释的释放试验中获得的结果一致，在37°C、5.5和6 pH值的条件下，也可以观察到质粒降解，尽管是在一周的培养时间(补充图S5D） 但不是在4°C时(补充图S5C） ●●●●。根据文献，排尿依赖于pH；酸性越强，排尿越多[73]. 此外，高温（37°C）有利于PLGA降解为乳酸和共乙醇酸，从而逐步酸化培养基[74,75]. 综上所述，这些数据与37°C高温培养促进PLGA水解导致NP周围介质的渐进酸化相一致。已知高于3的酸pHs可促进DNA链在富含胺的环境（如氨基终止的PLGA）中的去排尿，从而解释了在琼脂糖凝胶中观察到的降解。与水相比，PBS是一种更好的pH缓冲溶液，因此酸化过程可能会减慢，导致pDNA降解较晚（培养一周vs.72小时）。
还根据体外细胞活力和摄取分析了pDNA负载的PLGA纳米粒与细胞之间的相互作用。空的和载pDNA的纳米粒子均被证明对NSC-34细胞无细胞毒性(图6). 这一结果支持了PLGA NP具有高生物相容性和低毒性的文献[9]. 值得注意的是，当浓度高于0.2 mg/mL时，观察到细胞活力增加(图6A） ，这可能与细胞生长途径的质粒激活有关，因为空NP处理没有任何效果(图6B） ●●●●。或者，pDNA-NP处理细胞的代谢活性的诱导增加可能会导致这些浓度下的瑞沙唑啉降低更高。有必要进行进一步的研究，以了解这些结果背后的分子机制。 在治疗后24小时和48小时通过荧光测定法对平均单细胞PLGA和pDNA内化进行量化。结果表明，大多数pDNA负载的PLGA NP在最初24小时内被内化(图7A、 B）。具体而言，在24和48小时时，每个细胞分别内化0.127±0.029和0.137±0.016 PLGA纳克。基于pDNA包封效率，这相当于每个细胞的pDNA的2.282和2.469微克，代表每个细胞的质粒超过235000个拷贝。 pDNA负载的PLGA NPs内化也通过共焦显微镜证实(图7C） ●●●●。在处理的4小时内，NSC-34细胞膜和细胞质表面的一些小的纳米颗粒聚集体已经可见。在8小时时，纳米粒子的吸收率较高，很少观察到表面纳米粒子。治疗后12、24和48小时，细胞质纳米颗粒数量最多。此外，静止细胞和分裂细胞都能内化纳米粒子(图7C、 8小时）。 不幸的是，根据RFP蛋白检测，未观察到质粒表达(补充图S7)这可能是在水环境中观察到这些纳米粒子从PLGA中缓慢释放质粒的结果。然而，pDNA的摄取和表达高度依赖于细胞系，并且神经元细胞模型通常相对难以内化，即使使用商业试剂如lipofectamine也是如此。另外，还应考虑其他方面来实现质粒表达，即增加NP负载能力或改善功能性质粒结构保存和细胞内化。从这个意义上讲，pDNA PLGA NP细胞的内化在很大程度上取决于颗粒大小和zeta电位，依赖于和不依赖于氯氰菊酯的内吞作用是90-120nm颗粒的主要途径[76]. 如上所述，pDNA负载的PLGA NP具有负zeta电位（即使PLGA-NH2阳离子）；然而，正表面电荷将允许细胞膜相互作用并有利于NP的内化。或者，阳离子聚合物涂层和/或配体结合可能促进这种相互作用和细胞摄取，但在这些条件下应重新评估pDNA的结构完整性和功能。 4.结论
本研究中评估的三种合成技术均已被证明部分或全部改变了大质粒DNA的结构。
在双乳剂中，由声波仪和均质器诱导的机械剪切应力可能是核苷酸序列中断或质粒超螺旋功能构象转变为开放圆形或线性亚型的原因。此外，这项工作首次使用微流控系统分析了pDNA的封装，其中机械应力较温和，并且限制于pDNA溶液通过微通道的流量。然而，在所研究的条件下，促进乳化过程达到高装载量所需的高剪切应力与防止质粒损伤所需的低剪切应力之间的平衡是不可承受的。
或者，使用氨基终止的PLGA进行纳米沉淀可以获得高（57%）的封装效率，并部分保存pDNA超螺旋结构。然而，由于PLGA和pDNA之间的强静电相互作用，pDNA货物在水中的释放可能会减少，从而限制了其在体外和体内方法中的使用。如果成功克服了最后一个缺点，基于其尺寸、封装效率和pDNA超螺旋构象的保守性，本研究中制备的纳米沉淀合成纳米粒子有望成为大型质粒载体。
此外，尽管证明了这些纳米粒子在细胞中的显著摄取，但这种大尺寸pDNA的封装导致了带负电荷的纳米粒子，这可能会阻碍细胞膜的高度相互作用和摄取。诸如配体结合或纳米颗粒的阳离子聚合物涂层（即使用聚赖氨酸）等策略可用于还原这种电荷并促进细胞内部化。然而，应考虑随后对粒径或质粒构象的修改。
值得注意的是，有许多技术要求较高的变量和载体要求可能会影响细胞转染，即纳米粒子大小、货物完整性保存和释放、表面电荷或负载能力。这些参数通常很难作为一个整体来完成，正如本研究在大质粒上观察到的那样，这使得大多数传统的纳米粒子合成方法不适合封装编码序列的基因编辑机器。
总之，我们的工作比较了文献中最常见的将药物和核酸封装在PLGA聚合物纳米颗粒中的方法，包括一种新的微流体乳液系统。然而，基因编辑技术中使用的质粒在大小和电荷方面的特殊性使其对某些过程和最常用的试剂敏感。因此，目前需要进一步优化或替代合成方法来将PLGA纳米粒子用作基因编辑治疗技术的载体。
补充资料
以下内容可在线获取，网址为https://www.mdpi.com/article/10.3390/nano11102723/s1图S1：pDNA琼脂糖凝胶电泳示意图，图S2：zeta电位与pDNA包封效率之间的关系，图S3：双乳液合成法辅助分批超声程序中触发pDNA降解的试剂概念证明，图S4：纳米沉淀过程中触发pDNA降解的试剂的概念证明，图S5：纳米沉淀与氨基终止的PLGA合成的纳米粒子的体外DNA释放曲线。图S6：用琼脂糖凝胶电泳法对从pDNA-负载的PLGA纳米粒子中获得的上清液进行电泳，该纳米粒子是通过分批磁混合程序辅助纳米沉淀和37°C培养的氨基终止聚合物合成的，图S7:用pRFP-PLGA NP转染NSC-34细胞。 作者贡献
T.L.-R和R.M.在C.Y.和V.S.（用于SEM和TEM分析）、L.M-M.（用于质粒纯化）和L.U.和T.A.（用于双乳液合成）的协助下进行了所有实验。R.M.在M.A和V.S.R.M.的帮助下监督工作并设计实验，T.L.-R构思并设计了手稿的结构。T.L.-R写下了正文，准备了表格并制作了图表。M.A.、P.Z.和R.O.讨论并审阅了手稿。所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。
基金
这项研究得到了卡洛斯三世研究所的支持，批准号PI17/00949；来自欧盟的欧洲发展基金会（FEDER）“Una manera de hacer Europa”；生物研究中心（CIBERNED612-CB18/05/00037）；地平线2020框架计划玛丽·居里（Marie Curie）向R.M.提供个人奖学金计划（奖学金752349）；和来自Gobierno de Aragón的合并集团。V.S.感谢LMA-INA提供其工具的使用权，以及Innovación y Universidades Ciencia部、Programa Retos Investigacionón、项目REF:RTI2018-099019-A-I00的财务支持。CIBER-BBN是一项由VI National R&D&i Plan 2008-2011、Iniciativa Ingenio 2010、Consolider Program、CIBER Actions资助的倡议，由Salud Carlos III研究所（西班牙）在欧洲区域发展基金的协助下资助。
致谢
作者承认仪器的使用以及“萨拉戈萨大学阿拉贡研究所”和萨拉戈萨大学ELECMI ICTS国家设施“Avanzadas显微镜实验室”提供的技术建议，并感谢E.Fernandez的技术援助。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。此外，资助者在研究设计中没有任何作用；收集、分析或解释数据；撰写手稿时；或者在决定公布结果时。
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