Intracellular redistribution of truncated La protein produced by poliovirus 3Cpro-mediated cleavage

doi:10.1128/JVI.73.3.2193-2200.1999

.1999年3月；73(3):2193-200.

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脊髓灰质炎病毒3Cpro-mediated裂解产生的截短La蛋白的细胞内再分布

K Shiroki公司¹, T等山, S库格, T石井, S欧姆, S哈塔, K铃木, Y高崎, 野本牌汽车

附属公司

PMID： 9971802
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DOI（操作界面）： 10.1128/JVI.73.3.2193-2200.1999

脊髓灰质炎病毒3Cpro-mediated裂解产生的截短La蛋白的细胞内再分布

K Shiroki公司等。 J维罗尔. 1999年3月.

.1999年3月；73(3):2193-200.

doi:10.1128/JVI.73.3.2193-2200.1999。

作者

K Shiroki先生¹, T等山, S库格, T石井, S欧姆, S哈塔, K铃木, Y高崎, 野本牌汽车

附属

¹日本东京大学医学科学研究所微生物系，日本东京都区南町白冈代4-6-1号，邮编：108-8639。kshiroki@ims.u-tokyo.ac.jp

PMID： 9971802
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摘要

La自身抗原（也称为SS-B）是一种细胞RNA结合蛋白，可以在细胞核和细胞质之间穿梭，但它主要位于细胞核中。脊髓灰质炎病毒感染后，La蛋白重新分布到细胞质中。一项体外翻译研究表明，La蛋白刺激了脊髓灰质炎病毒翻译的内部启动。在本研究中，部分La蛋白在脊髓灰质炎病毒感染的HeLa细胞中被裂解，这种裂解似乎由脊髓灰质病毒特异性蛋白酶3C（3Cpro）介导。通过与纯化的3Cpro在La蛋白408-氨基酸（aa）序列中仅一个Gln358-Gly359肽键处裂解，在体外从重组La蛋白生成截短La蛋白（dl-La）。在L细胞中表达的dl-La位于细胞质中。然而，与La蛋白的C-末端50-aa序列相连的绿色荧光蛋白定位在细胞核中，表明该C-末端区域有助于完整La蛋白在未感染细胞中的稳态核定位。dl-La在兔网织红细胞裂解物中保留了脊髓灰质炎病毒RNA驱动的翻译起始增强活性。这些结果表明，在脊髓灰质炎病毒感染过程中，La蛋白被3Cpro裂解，dl-La重新分布到细胞质。dl-La和La蛋白可能在刺激细胞质中脊髓灰质炎病毒翻译的内部启动中发挥作用。

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数字

图1
携带Cre重组酶诱导3C的HeLa细胞的建立^{赞成的意见}表达式单元。（A）建立3C-HeLa9和3C-HeLa12细胞的策略。这些细胞株产生脊髓灰质炎病毒3C^{赞成的意见}当细胞感染AxCANCre时。（B） 3C的表达^{赞成的意见}。在AxCANCre感染后，将细胞培养至图中所示的时间。Cre重组酶和3C^{赞成的意见}用Cre重组酶和3C抗体对细胞裂解液进行免疫印迹分析^{赞成的意见}如材料和方法所述。

图2
3C裂解La蛋白^{赞成的意见}将HeLa细胞在脊髓灰质炎病毒感染后37°C下培养1、3、5、7和10小时（2至6道）。在AxCANCre感染后，将3C-HeLa9细胞孵育5、7、10和15小时（7至10道）。HeLa细胞在Ad5感染后孵育7、12和23小时（12至14道）。模拟感染细胞用“M”表示（1号和11号道）。在RIPA缓冲液中对细胞进行裂解，并使用材料和方法中描述的单克隆抗体La4B6和SW5进行免疫印迹分析。

图3
重组3C体外切割La蛋白^{赞成的意见}（A）HeLa细胞提取物与重组3C在30°C下孵育5小时（1至4道）和10小时（5至8道）^{赞成的意见}，加热3C^{赞成的意见}（70°C，10分钟）和*大肠杆菌*BL21（DE3）提取物与载体DNA在孵育缓冲液（5%甘油、150mM NaCl和1mM DTT）中。样品在SDS样品缓冲液中煮沸，以进行材料和方法中所述的免疫印迹分析。（B）重组La蛋白在30°C下无蛋白培养5小时（1道），重组3C^{赞成的意见}准备工作1（车道2和4）和2（车道3和5），以及*大肠杆菌*BL21（DE3）提取物与培养缓冲液中的载体DNA（通道6）。如上所述对样品进行免疫印迹分析。

图4
La蛋白及其相关蛋白在HeLa细胞中的分布。（A）显示了La蛋白的一种可能功能。脊髓灰质炎病毒3C^{赞成的意见}劈开了Gln₃₅₈-格莱₃₅₉肽键。（B）突变La蛋白的结构。（C） HeLa细胞中La蛋白的免疫染色。列：1，HeLa细胞；2、脊髓灰质炎病毒感染后6h的HeLa细胞；3、pCIneo-La转染L细胞；4，pCIneo-dl-La-转染L细胞；5、pCIneo-GFP转染L细胞；6，pCIneo-GFP-C′50-La转染L细胞；7，pCIneo-GFP-SV40 NLS转染L细胞。MAb La4B6用于免疫染色（第1列至第4列）。使用共焦激光扫描显微镜（Bio-Rad）在480nm处检测GFP荧光（第5至7列）。顶行，免疫染色或GFP荧光；最下面一行，用PI染色。在中间一行，图片被合并。

图4
La蛋白及其相关蛋白在HeLa细胞中的分布。（A）显示了La蛋白的一种可能功能。脊髓灰质炎病毒3C^{赞成的意见}劈开了Gln₃₅₈-格莱₃₅₉肽键。（B）突变La蛋白的结构。（C） HeLa细胞中La蛋白的免疫染色。色谱柱：1、HeLa细胞；2、脊髓灰质炎病毒感染后6h的HeLa细胞；3、pCIneo-La转染L细胞；4，pCIneo-dl-La-转染L细胞；5、pCIneo-GFP转染L细胞；6，pCIneo-GFP-C′50-La转染L细胞；7，pCIneo-GFP-SV40 NLS转染L细胞。MAb La4B6用于免疫染色（第1列至第4列）。使用共焦激光扫描显微镜（Bio-Rad）在480nm处检测GFP荧光（第5至7列）。顶行，免疫染色或GFP荧光；最下面一行，用PI染色。在中间一行，图片被合并。

图5
dl-La对RRL中脊髓灰质炎病毒RNA翻译的影响。（A）重组La蛋白对无细胞翻译的影响。模板RNA（0.5μg）在含有[³⁵S] 如材料和方法中所述，蛋氨酸和1μg N′-La、0.7μg dl-La、0.9μg La或50μg HeLa S100提取物。将混合物在SDS样品缓冲液中煮沸，以进行免疫印迹，如图3图例所示。（B）重组La相关蛋白的纯度。按照材料和方法中的描述纯化La相关蛋白（1号巷，La；2号巷，dl-La；3号巷，N′-La），并用SDS-PAGE分离。显示了凝胶（a）的银染和MAb La4B6（b）的免疫印迹分析结果。每个图右侧的箭头表示La蛋白、dl-La和N′-La的位置。

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1. Bachmann M，Pfeifer K，Schröder H C，Müller W E G。在CV-1细胞中，La抗原在细胞核和细胞质之间穿梭。分子细胞生物化学。1989;85:103–114.-公共医学
1. Bachmann M，Pfeifer K，Schröder H C，Müller W E G。自身抗原La作为核酸依赖型ATP酶/dATP酶的熔融特性表征。单元格。1990;60:85–93.-公共医学

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[2] Ali N，Siddiqui A.La抗原在启动子AUG密码子的上下文中结合丙型肝炎病毒RNA的5′非编码区，并刺激内部核糖体进入位点介导的翻译。美国国家科学院院刊1997；94:2249–2254.-项目管理咨询公司-公共医学

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[9] Bachmann M，Pfeifer K，Schröder H C，Müller W E G。自身抗原La作为核酸依赖型ATP酶/dATP酶的熔融特性表征。单元格。1990;60:85–93.-公共医学

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