The small Mr Ras-like GTPase Rap1 and the phospholipase C pathway act to regulate phagocytosis in Dictyostelium discoideum

doi:10.1091/mbc.10.2.393

.1999年2月；10(2):393-406.

doi:10.1091/mbc.10.2.393。

小Mr-Ras-like GTPase Rap1和磷脂酶C途径对盘状网柄菌的吞噬作用进行调节

D J海斯通¹, L Zhang先生, G布钦斯基, P Rebstein先生, G周, G斯皮格曼, J卡德利

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PMID： 9950684
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小Mr-Ras-like GTPase Rap1和磷脂酶C途径对盘状网柄菌的吞噬作用进行调节

D J海斯通等。分子生物学细胞. 1999年2月.

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.1999年2月；10(2):393-406.

doi:10.1091/mbc.10.2.393。

作者

D J海斯通¹, L张, G布钦斯基, P Rebstein先生, G周, G斯皮格曼, J卡德利

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¹微生物和免疫学系，美国路易斯安那州什里夫波特71130。

PMID： 9950684
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摘要

小Mr Ras-like GTPase Rap1的功能基本上尚不清楚，但该蛋白已被证明可调节网柄菌中基于皮质肌动蛋白的形态学变化和哺乳动物中性粒细胞的氧化爆发。为了测试Rap1是否调节吞噬作用，我们对盘状芽孢杆菌Rap1的野生型[Rap1 WT（+）]、组成活性[Rap1G12T（+）]]和显性阴性[Rap1-S17N（+）】形式的细胞株进行了生化分析。Rap1 WT（+）和Rap1 G12T（+）细胞的细菌吞噬率和乳胶粒吞噬率显著高于Rap1 S17N（+）。添加蛋白激酶A、蛋白激酶G、蛋白酪氨酸激酶或磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂不会影响野生型细胞的吞噬率。相反，添加U73122（磷脂酶C抑制剂）、钙磷蛋白C（蛋白激酶C抑制剂）和BAPTA-AM（细胞内钙螯合物）后，吞噬率分别降低了90、50和65%，表明磷脂酶C信号通路的双臂在这一过程中发挥了作用。其他蛋白激酶C特异性抑制剂，如白屈红素和双吲哚甲酰亚胺I，没有降低对照细胞的吞噬率，这表明钙磷锡C通过干扰含有二酰基甘油结合结构域的蛋白质而影响吞噬作用。钙磷蛋白C的加入并没有降低Rap1 G12T（+）细胞的吞噬率，这表明推测的二酰甘油结合蛋白在与Rap1的信号通路中发挥上游作用。令人惊讶的是，与对照细胞相比，Rap1 WT（+）和Rap1 G12T（+）细胞的大胞饮作用显著降低。总之，我们的结果表明，Rap1和Ca2+可能共同作用，以协调重要的早期事件调节吞噬作用。

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数字

图1
Rap1突变体的表达模式。顶部，西部在没有叶酸的情况下培养的细胞的杂交分析48小时诱导各种突变型Rap1的表达控制*迪斯科定I*发起人。用针对Rap1的多克隆抗体。相对表达式级别按所述进行计算（见材料和方法）。Rap1重量，Rap1G12T和Rap1 S17N的表达水平分别为1.5、3.1和6.7倍分别为叶酸重压对照。底部，考马斯每个Western blot的总蛋白载量的蓝色染色凝胶上面显示的用于计算相对表达式的样本水平。

图2
Rap1调节乳胶吞噬速率珠。吞噬作用的速率是通过将细胞与1-μm荧光乳胶珠，在不同时间收集细胞，裂解它们，并使用荧光分光光度计。样品的荧光归一化为总蛋白来解释细胞大小的差异菌株；该值报告为每微克的荧光蛋白质。（A）一次吞噬试验显示不同Rap1过度表达细胞系的吞噬率在30分钟内几乎呈线性。（B）显示平均值的条形图每个菌株每微克蛋白质的荧光30分钟时间点±SD。统计：Ax2，19.7±3.7（n= 8); Rap1重量（+），43.7±7.3（n=8）；Rap1 G12T（+），43.0±12.9（n=8）；活塞1 S17N（+），11.8±2.63（n= 3). 学生的双尾t吨使用统计程序Instat（1.12a版；IBM，White Plains，纽约州）。

图3
Rap1调节FITC公司-*大肠杆菌*顶部，条形图，显示细菌摄取和每种蛋白质每微克的平均荧光30分钟时间点±SD时的菌株。吞噬试验为按照图2执行，但标有FITC-的除外*大肠杆菌*是用以代替荧光乳胶珠。底部，培养细胞带有FITC-标签*大肠杆菌*10分钟，清洗并放置盖玻片。将溴化乙锭（5μg/ml）添加到中等，安装盖玻片并使用绿色（F-通道）或红色（R-通道）。低于所有受检菌株的实验条件，FITC公司-*大肠杆菌*很容易被细胞内化（参见F通道），但<5%的细菌粘附在细胞外部（参见R通道）。

图4
Rap1在磷酸钙蛋白C下游发挥作用调节吞噬作用的靶蛋白。细胞经预处理钙磷蛋白C（0.75μM）20分钟，添加荧光乳胶珠吞噬率的测定如材料和方法。速率（每微克蛋白质的荧光）在30分钟的时间点，每个菌株的未经处理的对照组为归一化为吞噬值100相应地对各自的药物处理菌株进行了归一化。值为报告为药物处理细胞的吞噬指数比率30分钟时）/（30分钟时未经处理培养物的吞噬指数）±SD针对每个菌株。按照中所述进行统计分析图1以确保报告的下降幅度显著。用钙磷蛋白C处理的对照Ax2细胞显示60%抑制珠子摄取，而Rap1 WT（+）细胞显示40%抑制珠子吸收。相反，吞噬作用在经药物处理的Rap1 G12T（+）细胞表明钙磷蛋白C敏感蛋白在信号转导中作用于Rap1上游调节吞噬作用的途径。

图5
Rap1负调节液相胞饮作用。用2 mg/ml FD培养细胞，在指定的时间，用1-ml FD采集、清洗和溶解样品按照材料和方法中所述对细胞进行分析。荧光将其归一化为每个样品的总蛋白质，以说明潜在的菌株间细胞大小的差异。此处描述的是三个独立试验的代表性试验。Rap1 WT（+）和Rap1 G12T（+）细胞以60%的速率内化FD控制Ax2细胞。相反，Rap1 S17N（+）细胞没有表现出抑制作用与对照Ax2细胞相比，在液相摄取。学生的双尾t吨对荧光数据进行了测试从30分钟和45分钟的时间点（当摄取率为线性），以确保报告的减少显著（参见图1图例）。以下数值为平均值30分钟内每微克蛋白质的荧光±标准偏差点。统计：Ax2，19.9±3.7（n=4）；Rap1重量（+）12.2±0.6（n=3）；活塞1 G12T（+），12.0±3.7（n=4); 撞击S17N（+），17.6±5.5（n=3）。

图6
Rap1负调节流体期大胞饮症。控制Ax2细胞（A和B），Rap1 WT（+）细胞（C和D）和Rap1 G12T（+）细胞（E和F）从175厘米²组织培养瓶，通过离心收集，放置在盖玻片上并与荧光黄一起孵育5分钟。在新鲜培养基中清洗细胞，并准备进行相位对比（A、C、，和E）或荧光（B、D和E）显微镜。控制Ax2细胞将荧光素黄色内化为大水泡（大小可达5μm）代表大松果体（B；见箭头）。单独控制Ax2细胞平均含有三到五个大松果体脉搏5分钟后含有荧光素黄色。没有大松果体在Rap1 WT（+）或Rap1 G12T（+）细胞系（D和F，分别）。棒材，5μm。

图7
Rap1在处理或将α-甘露糖苷酶靶向溶酶体。对生长细胞进行脉冲处理带有[³⁵S] 蛋氨酸在HL5培养基中放置20分钟，然后进行追踪在未标记的介质中放置指定的时间。离心后细胞颗粒和细胞外培养基与α-甘露糖苷酶单克隆抗体（Mierendorfet（等）其他。，1983). 免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE和放射自显影术用于显示标记的蛋白质。所检测的Rap1过表达细胞系均未显示加工动力学、靶向性或分泌性缺陷α-甘露糖苷酶。

图8
Rap1在流体相。生长细胞与FITC-右旋糖酐（2mg/ml）持续3小时，使内溶酶体系统达到稳定状态水平。清洗细胞，将其重新悬浮在新鲜培养基中，然后进行培养再持续2小时，在不同的时间，取1ml样品收获了。与细胞相关的荧光计算如下材料和方法中所述。与对照Ax2细胞相比，所检测的Rap1过表达细胞系均未显示液相胞吐速率的显著变化。

图9
解释信号的当前工作模型调节吞噬功能的转导途径*粘液菌*.颗粒或细菌与异三聚体G蛋白偶联受体发出信号导致磷脂酶C活化的转导级联PIP裂解₂至DAG和IP_三.路径分叉和IP_三导致钙的释放²⁺从细胞内储存。同时，DAG与鸟嘌呤交换结合该因子反过来激活Rap1。这两种途径结合在一起导致招募其他调节形成的蛋白质吞噬杯。

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