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.1999年2月；67(2):496-503.
doi:10.1128/IAI.67.2.496-503.1999。

大肠杆菌细胞毒性坏死因子1对Cdc42和Rac的脱酰胺作用：HeLa细胞中c-Jun N末端激酶的激活

M勒姆 1, J塞尔泽, 霍夫迈耶, U R敲击, K阿克托利斯, G施密特
附属机构

大肠杆菌细胞毒性坏死因子1对Cdc42和Rac的脱酰胺作用：HeLa细胞中c-Jun N末端激酶的激活

M勒姆等。 感染免疫. 1999年2月.

摘要

最近，发现大肠杆菌细胞毒性坏死因子1（CNF1）通过Gln63脱酰胺激活低分子量GTPase RhoA，从而抑制内源性和GTPase激活蛋白（GAP）刺激的GTPase活性（G.Schmidt，P.Sehr，M.Wilm，J.Selzer，M.Mann，and K.Aktories，Nature 387:725-7291997；G.Flatau，E。Lemichez、M.Gauthier、P.Chardin、S.Paris、C.Floorentini和P.Boquet，《自然》387:729-7331997）。在这里，我们报告，除了RhoA，Cdc42和Rac也是CNF1在体外和完整细胞中的靶点。CNF1处理HeLa细胞可诱导小孢子的瞬时形成和膜皱褶的形成。CNF1导致c-Jun N末端激酶活性瞬时增加10到50倍。与对照肽相比，通过免疫沉淀法从CNF1处理的细胞中获得的Cdc42色氨酸肽的质量增加了1Da，表明该毒素使谷氨酰胺61脱酰胺。从CNF1修饰的重组Cdc42和Rac1中获得的相应肽也观察到同样的质量增加。CNF1对重组Cdc42和Rac1的修饰抑制了内源性和GAP刺激的GTPase活性，并延缓了2'（3'）-O-（N-甲基蒽酰）GDP的结合。数据表明，重组以及细胞Cdc42和Rac是CNF1的底物。

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数字

图1
图1
CNF1处理的HeLa细胞的相控显微照片。用GST-CNF1（500 ng/ml）处理生长在网格玻璃盖玻片上的HeLa细胞，并在0（A）、6（B）、12（C）和24（D）h（40倍物镜）后拍照。
图2
图2
CNF1处理HeLa细胞的肌动蛋白染色。用GST-CNF1（500 ng/ml）处理HeLa细胞0（A）、6（B）和24（C和D）h。然后，固定细胞并用罗丹明-卟啉染色F-actin。（C和D）同一细胞的显微照片，聚焦在细胞顶端表面（C）下方和细胞顶端表面上（D）。对于所有面板，使用100×油浸物镜。
图3
图3
（A） CNF1诱导JNK活化的时间过程。用每毫升500 ng GST-CNF1培养HeLa细胞0至5 h。裂解后，内源性JNK从透明裂解物中免疫沉淀。在激酶分析中测定JNK的活性，其中免疫复合JNK与[γ-32P] ATP和GST–c-Jun作为底物。对样品进行SDS-PAGE和Western blotting。GST–c-Jun的磷酸化通过磷成像仪（分子动力学）的Image Quant程序进行量化。（B） 通过增强化学发光法测定沉淀JNK的量。
图4
图4
体外修饰Cdc42（A）和Rac1（B）的质谱分析。纯化的重组Cdc42和Rac1在与CNF1（GTPase与毒素的摩尔比为5:1）孵育后用糜蛋白酶消化，作为对照，不含毒素。在质谱仪中测定所得肽的质量。氨基酸。
图5
图5
CNF1处理对Cdc42和Rac1的GTPase活性和核苷酸结合的影响。（A和B）野生型（WT）Cdc42、野生型Rac1和相应的Q61E突变体在不含（WT和Q61E）和含有（WT-32P] 全球贸易伙伴关系。数据以平均值和标准偏差的形式给出(n个= 3). （A） 负载的GTPase在无（内源性）和p50的情况下培养间隙（p50的摩尔比间隙至Cdc42/Rac，1:50），在37°C下保持4分钟。然后通过硝化纤维素过滤样品，并对过滤器上残留的放射性进行计数。（B） 用Cdc42在不同p50下测定GTPase活性间隙/Cdc42比率。（C） 用2μM mant-GDP孵育野生型Cdc42、Q61E Cdc42和CNF1处理的Cdc42（每个0.5μM），并记录444 nm处荧光的增加（由于在357 nm处激发的结合mant-GDP的强度较高）。这个k个值是GDP的分离率。
图5
图5
CNF1处理对Cdc42和Rac1的GTPase活性和核苷酸结合的影响。（A和B）野生型（WT）Cdc42、野生型Rac1和相应的Q61E突变体在不含（WT和Q61E）和含有（WT-32P] 全球贸易伙伴关系。数据以平均值和标准偏差的形式给出(n个= 3). （A） 负载的GTPase在无（内源性）和p50的情况下培养间隙（p50的摩尔比间隙至Cdc42/Rac，1:50），在37°C下保持4分钟。然后通过硝化纤维素过滤样品，并对过滤器上残留的放射性进行计数。（B） 用Cdc42在不同p50下测定GTPase活性间隙/Cdc42比率。（C） 将野生型Cdc42、Q61E Cdc42和CNF1处理的Cdc42（各0.5μM）与2μM mant GDP一起孵育，并记录到444nm处荧光的增加（由于在357nm处激发的结合mant GDP的更高强度）。这个k个值是GDP的分离率。
图5
图5
CNF1处理对Cdc42和Rac1的GTPase活性和核苷酸结合的影响。（A和B）野生型（WT）Cdc42、野生型Rac1和相应的Q61E突变体在不含（WT和Q61E）和含有（WT-32P] 全球贸易伙伴关系。数据以平均值和标准偏差的形式给出(n个= 3). （A） 负载的GTPase在无（内源性）和p50的情况下培养间隙（p50的摩尔比间隙至Cdc42/Rac，1:50），在37°C下保持4分钟。然后通过硝化纤维素过滤样品，并对过滤器上残留的放射性进行计数。（B） 用Cdc42在不同p50下测定GTPase活性间隙/Cdc42比率。（C） 用2μM mant-GDP孵育野生型Cdc42、Q61E Cdc42和CNF1处理的Cdc42（每个0.5μM），并记录444 nm处荧光的增加（由于在357 nm处激发的结合mant-GDP的强度较高）。这个k个值是GDP的分离率。
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