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.1999年1月19日；96(2):736-41.
doi:10.1073/pnas.96.2.736。

视紫红质敲除小鼠的形态、生理和生化变化

J Lem（莱姆） 1, N V克拉斯诺佩罗娃, P D卡尔弗特, B科索沃, D A卡梅隆, M尼科尔, C L马基诺, R L西德曼
附属公司

视紫红质敲除小鼠的形态、生理和生化变化

J Lem（莱姆）等。 美国国家科学院程序. .

摘要

视杆蛋白（视杆感光细胞的视觉色素蛋白）的突变约占所有遗传性人类视网膜变性的15%。然而，疾病过程背后的生理和分子事件还不清楚。解决这个问题的一种方法是研究表达含有特定突变的视蛋白基因的转基因小鼠。这种方法的一个警告是，即使正常视蛋白的过度表达也会导致感光细胞退化。为了克服这个问题，我们通过靶向基因破坏来减少或消除内源性视杆蛋白含量。缺乏两种视蛋白等位基因的小鼠的视网膜最初发育正常，但杆外段未能形成。出生后数月内，感光细胞完全退化。具有单一视紫红质基因拷贝的小鼠的视网膜发育正常，而视紫红质棒的外段大小正常，但含有正常补体的一半。视网膜中的感光细胞也会退化，但退化的时间要慢得多。生理和生化实验表明，与野生型对照组相比，具有单一视蛋白基因的小鼠的视杆对光的敏感性降低了约50%，具有加速闪光反应动力学，并且含有约50%的幻觉。

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数字

图1
图1
通过替换Xho公司基因组视蛋白与新霉素抵抗基因（PGK-Neo）的I位点，并在第二内含子中插入胸苷激酶基因（MC1-TK）。目标视蛋白基因中的密码子1-111被删除。使用图底部所示的两种限制性消减策略来鉴定所需的同源重组体。
图2
图2
(A类)Southern印迹生态从嵌合体视紫红质敲除创始人的同窝动物中制备的RI消化DNA。+/+，−/−，和+/-分别指定野生型、纯合子和半合子小鼠。+/+小鼠表现出5.1kb的带，表明基因组视蛋白DNA小鼠表现出6.5kb的条带，表明目标基因。+/-小鼠同时表现出这两种特性。(B类)反转录-PCR。从30天大的+/-+或+/--小鼠的视网膜中制备的RNA被逆转录，并用杆状T特异性引物扩增α或视杆蛋白。引物对跨越一个内含子。尽管Tα在−/−视网膜中未检测到opsin mRNA。RNA和DNA的转基因PCR产物分别为370 bp和846 bp。RNA和DNA的Opsin-PCR产物分别为397 bp和513 bp。G代表扩增的基因组DNA。(C类)用视紫红质特异性Ret-P1抗体进行Western blot检测。在前三个车道（从左到右）装载等量的视网膜匀浆；在最右侧车道装载50倍以上的匀浆。
图3
图3
(A类)视网膜提取物的不同光谱。+/-视网膜匀浆的视紫红质含量约为年龄匹配（4周）+/+视网膜的一半。(B类)+/+（开环）棒质量的归一化平均吸收光谱；n个=6）和+/-（闭合圆；n个=5）小鼠。将模板与+/+光谱进行拟合，得出吸收峰（λ最大值)约为505 nm。(C类)单棒的显微分光光度分析。每个棒的OD光谱除以棒外段的宽度（单位：μm）。圆圈表示30+/+杆（开放圆圈）和32+/-杆（闭合圆圈）的平均比吸光度值。这些行显示了中的模板B类，缩放以适应+/+和+/-结果。
图4
图4
视网膜形态。光学显微镜显示15天大的视网膜(A类)，30日龄(B类)和90天(C类)动物(左侧，+/+窝鼠；居中，+/-窝鼠；赖特，−/−同窝小鼠）。INL，内核层；ONL，外核层；IS，内段；OS，外段；视网膜色素上皮。（巴=20μm）(D类)用光学显微镜所用的相同组织块制备电子显微照片。箭头表示异常取向的膜。箭头指向−/−视网膜的外段。（对于+/+和+/-，Bar=200 nm；对于−/−，Bar=1μm。）
图5
图5
+/+棒的平均响应(A类)和+/-杆(B类)强度不断增加的500纳米闪光。响应被归一化为最大响应振幅（+/+棒为18 pA，+/-棒为12 pA）。下面的痕迹是来自闪光监视器的信号。+/-棒中的光响应恢复更快。(C类)标准化响应幅度A类和B类相对于闪光强度绘制。线显示数据对饱和指数的拟合：第页/第页最大值= 1 −e（电子）−ki（基色），其中我是闪光强度，k个=ln（2/我0)、和我0是引起半最大响应的闪光强度。对于+/+杆，我0为30.6光子●μm−2; 对于+/-杆，我0是182个光子●μm−2.
图6
图6
(A类)T水平α，T型β在−/-（开条）和+/-（灰条）小鼠中，PDEα、PDEβ、phosdosin（PDC）、视紫红质激酶（RK）、arrestin（ARR）和recoverin（REC）归一化为+/+值（平均值±SD）。(B类)用磷酸腺苷抗体探测来自30天和56天龄的+/+、+/−和−/−小鼠的等量视网膜匀浆的这种蛋白质印迹。
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