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.1999年2月；19（2）：1547-57。
doi:10.1128/MCB.19.2.1547。

核转运蛋白和核孔复合体蛋白子集之间的相互作用依赖于Ran GTPase

M西多夫 1, M Damelin女士, J卡哈纳, T陶拉, P A银色
附属公司

核转运蛋白和核孔复合体蛋白子集之间的相互作用依赖于Ran GTPase

M西多夫等。 分子细胞生物学. 1999年2月.

摘要

转运到细胞核的蛋白质被重要核蛋白核转运受体家族成员识别。在与核孔复合体（NPC）对接后，货物受体复合体通过水性孔道移动。一旦货物放行，进口货物就会通过新一轮的运输通道返回。因此，导入蛋白和导出蛋白，这个家族中另一个参与输出的成员，被认为在细胞核内部和细胞质之间不断穿梭。为了了解核转运蛋白如何穿越NPC，我们在酵母导入蛋白家族的几个成员之间构建了功能性蛋白融合，包括Pse1p、Sxm1p、Xpo1p和Kap95p，以及绿色荧光蛋白（GFP）。使用高度特异的抗GFP抗体分离出含有核转运体的复合物。对Pse1-GFP进行了最详细的研究。Pse1-GFP与重要蛋白α和β（酵母细胞中的Srp1p和Kap95p）形成复合物，对Ran GTPase的核苷酸结合状态敏感。此外，Pse1p与核孔蛋白Nsp1p、Nup159p和Nup116p相关，而Sxm1p、Xpo1p和Kap95p与核孔蛋白的相互作用模式不同。Pse1p与核孔蛋白的结合也依赖于Ran的核苷酸结合状态；当Ran处于GTP结合状态时，核通道蛋白结合丧失。一种不结合Ran的突变型Pse1p也不能与核孔蛋白相互作用。这些数据表明，像Pse1p这样的转运受体与某些核孔蛋白以Ran依赖的方式相互作用。这些核孔蛋白可能代表Pse1p通过NPC进出核时的主要对接位点。

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数字

图1
图1
Pse1p、GFP标记的Pse1p的表达和野生型的生长特性，PSE1-GFP公司、和第1-1页–GFP菌株。（A） 来自野生型菌株（PSY580）和PSE1型被替换为PSE1-GFP公司用SDS-PAGE在8%凝胶上分离，转移到硝化纤维素中，并与Pse1p特异性抗体（74）（1和2道）或GFP特异性抗体培养（3和4道）。（B） 野生型酵母菌株的生长PSE1型被替换为PSE1-GFP公司、和第1-1页突变株的C末端第1-1页替换为的C端子部分PSE1型-GFP。细胞在YEPD平板上划线，并在25或37°C下培养60 h。
图2
图2
重要蛋白-β同系物的细胞内定位。（A） 包含的单元格PSE1型,SXM1系列,KAP95标准，或XPO1型用GFP标记的替代品在25°C的选择性培养基中生长，并用荧光显微镜进行分析。（B） GFP标记的Pse1p在野生型中的定位，rna 1-1、和第20-1页突变细胞。细胞在25°C的选择性培养基中生长，并转移60分钟至37°C。将所有细胞转移到载玻片上并立即进行检查。
图3
图3
GFP标记的importin-βs的表达和免疫沉淀。（A） 来自具有以下特性的菌株的等量酵母裂解物（总蛋白10μg）PSE1型（车道1），SXM1系列（车道2），XPO1型（车道3），或KAP95标准用GFP标记的版本替换（通道4），用SDS-PAGE在8%凝胶上分离表达LacZ-GFP的野生型细胞（通道5），并转移到硝化纤维上。使用抗-GFP微球从裂解产物中沉淀复合物。PSE1型（6号车道），SXM1系列（7号车道），XPO1型（第8车道），KAP95标准分离含有复合物和对应于250μl酵母裂解物（约1 mg/ml）的LacZ-GFP（车道10），并将其转移到膜上。最上面一行显示了用GFP特异性抗体探测的斑点。将具有相同样品的第二个印迹切成两半，用Kap95p特异性抗体探测上部，用Srp1p特异性抗体探测下部。（B） 基因组学PSE1型被替换为PSE1-GFP公司在野生型中，rna 1-1、和第20-1页菌株。细胞在25°C的液体培养中生长，一半细胞移动90分钟至37°C。用抗GFP珠免疫沉淀Pse1-GFP，用GFP-、Kap95p-和Srp1p-特异性抗体探测结合部分。
图4
图4
核蛋白存在于重要蛋白-β-GFP复合物中。（A） 来自表达Pse1 GFP的菌株的酵母裂解物（泳道1）和来自导入蛋白-β基因被PSE1-GFP公司,SXM1-GFP公司,XPO1-GFP公司，或KAP95-GFP标准SDS-PAGE分离，免疫印迹分析。从上到下用GFP特异性抗体、Nup159p特异性抗体、Pom152p特异性、Nup116p特异性和Nsp1p特异性抗体探测相同印迹的重复物。（B） 野生型，rna 1-1、和第20-1页基因组所在的细胞PSE1型被替换为PSE1-GFP公司在25°C下生长，每种培养物的一半转移90分钟至37°C。用SDS-PAGE在8%凝胶上分离带有沉淀的Pse1-GFP复合物的相同样品，转移到硝化纤维素上，并与GFP-、Nup159p-、Nup 116p-或Nsp1p-特异性抗体孵育。
图5
图5
Pse1-1蛋白的细胞内定位。（A） 示意图（未按比例绘制）描述了pPS1538，其中包含PSE1型与GFP融合，并在更换第1-1页C末端的等位基因PSE1-GFP公司显示了由于突变引起的氨基酸变化。（B） 表达Pse1-GFP或Pse1-1-GFP的细胞在25℃的选择性培养基中生长，一半培养物转移30分钟至37℃。将细胞转移到载玻片上并立即进行显微镜分析。Pse1-1细胞的GFP信号的检测时间是野生型细胞的三倍。（C） 用MAb 414探测表达Pse1-1-GFP的细胞以显示核膜，用抗Nop1p探测细胞以显示细胞核，然后用DAPI染色以显示其DNA（在37°C后）。箭头表示Pse1-1-GFP，较小的箭头表示核仁，由Nop1p定位决定。
图5
图5
Pse1-1蛋白的细胞内定位。（A） 示意图（未按比例绘制）描述了pPS1538，其中包含PSE1型与GFP融合，并在更换第1-1页C末端的等位基因PSE1-GFP公司。指出了突变引起的氨基酸变化。（B） 表达Pse1-GFP或Pse1-1-GFP的细胞在25℃的选择性培养基中生长，一半培养物转移30分钟至37℃。将细胞转移到载玻片上并立即进行显微镜分析。Pse1-1细胞的GFP信号的检测时间是野生型细胞的三倍。（C） 用MAb 414探测表达Pse1-1-GFP的细胞以显示核膜，用抗Nop1p探测细胞以显示细胞核，然后用DAPI染色以显示其DNA（在37°C后）。箭头表示Pse1-1-GFP，较小的箭头表示核仁，由Nop1p定位决定。
图6
图6
突变体Pse1-1p不与Ran/Gsp1p相互作用。（A） 表达Pse1-GFP或Pse1-1-GFP的细胞在25℃下生长。裂解物被分离，每个裂解物的一半与1 mM GMP-PNP孵育。免疫沉淀Pse1-GFP和Pse1-1-GFP，用SDS-PAGE在12%凝胶上分离结合蛋白并转移到硝化纤维素中，将膜切成两半。顶部用GFP特异性抗体进行检测，底部用Ran/Gsp1p特异性抗体检测。（B） 用GMP-PNP处理Pse1-1-GFP和Pse1-GFP表达细胞的裂解液并进行免疫沉淀。为了匹配等量的Pse1-GFP，需要增加10倍第1-1页–GFP裂解物用于免疫沉淀。结合蛋白按A组所述进行分析。
图7
图7
核通道蛋白和导入蛋白存在于Pse1 GFP和Pse1-1–GFP复合物中。细胞在25°C下生长，每种培养物的一半移动1 h至37°C。沉淀含有Pse1-GFP-和Pse1-1-GFP-的复合物，并用SDS-PAGE在8%的凝胶上分离相同的样品并转移到硝化纤维素。用GFP-、Nsp1p-、Nup116p-或Rat7/Nup159p-特异性抗体培养印迹。一个斑点被切成两半；上半部用Kap95p孵育，下半部用Srp1p特异性抗体孵育。
图8
图8
Pse1p交互总结图。在野生型细胞中或当Prp20p不活动时，Pse1p位于NPC，与Nup159、Nup116和Nsp1p复合。
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