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.1999年2月;47(2):229-36.
doi:10.1177/002215549904700211。

共焦激光扫描荧光显微镜分析人下丘脑神经肽的双重免疫标记

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共焦激光扫描荧光显微镜分析人下丘脑神经肽的双重免疫标记

H J Romijn先生等。 组织化学与细胞化学杂志. 1999年2月.

摘要

本研究的主要目的是开发一种更好的光学显微镜程序,用于定量研究神经肽在成人脑组织中的细胞共定位。为了达到这一目标,我们选择了一种方法(证明在大鼠脑中是最佳的),在这种方法中,用两种不同的荧光团结合二级抗体对切片进行双重免疫标记,并用共焦激光扫描荧光显微镜进行分析。我们面临的主要问题之一是切片的强自体荧光,主要是由成人脑组织中常见的脂褐素颗粒引起的,这使得无法对特定荧光进行任何分析。这个问题可以通过用苏丹黑B染料对免疫标记后的切片进行染色来解决,这完全阻断了这种自体荧光。我们最终开发的完整优化程序可以总结如下。在4%刚解聚的多聚甲醛中固定时间相对较短(6-14天)后,切除的脑组织最好保存在4C时添加0.05%NaN3的30%蔗糖溶液中。在这些条件下保存,组织冰冻切片仍然显示出良好的组织学,并允许在6个月后成功进行免疫细胞化学染色。双重免疫标记是通过将冷冻切片或石蜡切片培养在两种针对靶抗原的一级抗体的混合物中,然后与两种不同的荧光团结合的二级抗体培养来完成的。用生物素化二级抗体进行扩增,然后用荧光结合链霉亲和素进行扩增是可能的。最后,用苏丹黑B对切片进行染色,将其装入普通的80%三缓冲甘油中,并用共焦激光扫描荧光显微镜进行研究。以这种方式处理的切片非常适合于对人脑组织中共定位的神经肽进行定性和定量分析。

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