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.1998年12月14日；143(6):1591-601.
doi:10.1083/jcb.143.61591。

逆行鞭毛内转运（IFT）的不同突变体具有相似的形态和分子缺陷

G Piperno公司 1, E Siuda公司, S亨德森, M Segil公司, H瓦纳宁, M萨萨罗利
附属公司

逆行鞭毛内转运（IFT）的不同突变体具有相似的形态和分子缺陷

G Piperno公司等。 J细胞生物学. .

摘要

蛋白质复合物的微管运输是双向的，发生在基体周围的空间和鞭毛衣原体的远端之间，被称为鞭毛内运输（IFT）。IFT涉及由17S蛋白复合物组成的分子马达和颗粒。为了鉴定IFT机器不同部件的功能，我们分离并鉴定了四个鞭毛集合的温度敏感（ts）突变体，它们代表基因座FLA15、FLA16和FLA17。这些突变体是在鞭毛集合的其他ts突变体中选择的，因为它们显示出鞭毛膜的特征隆起作为非条件表型。一种新的IFT分析方法显示，每个突变体在粒子的逆行速度和双向传输频率方面都有明显缺陷，但在粒子的顺行速度方面没有明显缺陷，该方法允许跟踪视频图像序列中的单个粒子。此外，每个突变体的17S复合体的相同四个亚基都有缺陷，该复合体早先被鉴定为IFT复合体a。由于三个位点中的任何一个发生突变，出现了相同的表型集，提出了复合物A是IFT颗粒的一部分，特别参与逆行鞭毛内运动的假设。

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数字

图4
图4
在允许温度下发生的颗粒鞭毛内运输的典型图示。光强沿鞭毛纵向线扫描的合成图(一)功率因数15和(b条)弗拉15功率因数15.以30帧/秒的速度获取视频序列中的每个连续图像，测量鞭毛近端到远端的一次线扫描。然后对线扫描集合进行奇异值分解，并按照文本所述进行重建。处理后的行扫描进行堆叠和显示，以便x个轴对应于序列的第一行扫描和鞭毛的近端部分。距离年轴线是相对于鞭毛近端测量的。经历顺行或逆行运输的颗粒可分别识别为向右和向左倾斜的脊。(一和b条)红脊和绿脊的例子分别表示正经历顺行和逆行运输的粒子。
图1
图1
温度敏感突变体的鞭毛组装弗拉15,弗拉16，和弗拉17-1在允许温度下有缺陷。野生型菌株和弗拉15,弗拉16，以及弗拉培养17-1，用pH休克法去鞭毛，并在允许温度下对鞭毛再生过程进行相差显微镜分析。固定后测量鞭毛长度。垂直条表示25次测定平均值的标准误差。方形，野生型；钻石,弗拉17-1;三角形,弗拉16;X（X）,弗拉15
图2
图2
弗拉15导致鞭毛膜隆起。的缩微照片弗拉15在允许温度下培养和固定。(一)微分干涉对比显微照片。(b–d段)相位对比显微照片。棒材，10μm。
图3
图3
鞭毛形状的变形弗拉15与细胞质基质的积累有关(一和b条)电子显微照片。(一)穿过中央一对微管的纵切面。在轴丝的一段中，细胞质积聚在外双层微管和鞭毛膜之间。(b条)纵切面切穿积累在鞭毛膜隆起处的细胞质。棒材，0.1μm。
图5
图5
弗拉鞭毛细胞质基质中17S沉淀组分的两种多肽15有缺陷。的自动射线照片35经凝胶电泳分离后，蔗糖梯度组分6–16中含有S标记多肽。分子量标准如左图所示。(一)来自野生型菌株的蛋白质。车道之间的线9和10表示存在两个17S络合物的成分1-13。(b条)蛋白质来自弗拉15.车道之间的星号9和10指出两种多肽的缺失位置弗拉15.线表示17S复合物的其余亚基。
图6
图6
弗拉15,弗拉16和弗拉在相同的三种多肽中，17-1有不同程度的缺陷。的自动射线照片35野生型和突变菌株鞭毛17S沉淀组分的S-标记多肽，经高分辨率一维电泳。第一条车道一和b条，来自野生型菌株的蛋白质。第二条车道一，蛋白质来自弗拉15.第二和第三车道b条，蛋白质来自弗拉16和弗拉17-1. 在每条车道上分析了等量的cpm。图中左侧的数字和线条表示17S复合体的13个亚基。两个面板之间的线表示每个突变体中缺乏的电泳带，并代表复合物A的假定亚基b条指仅存在于17S沉淀组分中的多肽弗拉16和弗拉17-1. 标准品的分子量显示在右侧。
图7
图7
17S沉淀馏分弗拉15和弗拉17-1对相同的四种多肽的缺失程度不同。二维地图的自动放射自显影35鞭毛17S沉淀组分中的S标记多肽(一)野生型(b条)弗拉15，和(c（c）)弗拉17-1. 左侧的数字和线条一指17S复合物亚基的位置，由一维电泳测定。每个面板中的斜线表示在弗拉15和弗拉17-1. 17S沉淀组分中存在的新多肽弗拉17-1由中的箭头表示c（c）多肽在地图中以从左到右的酸度递增顺序出现。
图8
图8
鞭毛中缺乏的四种多肽弗拉15,弗拉16，和弗拉17-1表现为复合物的亚单位。二维地图的放射自显影术35野生型菌株鞭毛经蔗糖梯度沉淀和DEAE-Sepharose柱层析后的S-标记多肽。斜线表示四种多肽缺乏弗拉15,弗拉16，和弗拉17-1. 多肽在图中以从左到右的酸度递增顺序出现。
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