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.1999年1月；73（1）：251-9。
doi:10.1128/JVI.73.1.251-59.1999。

从cDNA中产生牛呼吸道合胞病毒（BRSV）：BRSV NS2对病毒在组织培养中的复制不是必需的，人RSV先导区充当BRSV基因组的功能启动子

U J Buchholz大学 1, S芬克, K K康泽尔曼
附属公司

从cDNA中产生牛呼吸道合胞病毒（BRSV）：BRSV NS2对病毒在组织培养中的复制不是必需的，人RSV先导区充当BRSV基因组的功能启动子

U J Buchholz大学等。 J维罗尔. 1999年1月.

摘要

为了制备重组牛呼吸道合胞病毒（BRSV），克隆了BRSV株A51908的变异株ATue51908的基因组。我们在这里提供了BRSV基因组末端和整个L基因的序列。这就完成了BRSV基因组的序列，该基因组共包含15140个核苷酸。为了建立无痘苗病毒回收系统，我们构建了一个稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK衍生细胞系（BSR T7/5）。在T7 RNA聚合酶驱动表达转染质粒中的抗原感觉RNA和BRSV N、P、M2和L蛋白后，重组BRSV可从cDNA构建物中重复恢复。其中BRSV前导区被人类呼吸道合胞病毒（HRSV）前导区取代的嵌合病毒在细胞培养中的复制效率与非嵌合病毒的复制效率一样高，这表明HRSV启动子的所有顺式作用序列都能被BRSV聚合酶复合物忠实地识别。此外，我们报道成功恢复了一个BRSV突变株，该突变株缺乏完整的NS2基因，该基因编码一个功能未知的非结构蛋白。NS2缺陷型BRSV可以自主复制并传代，这表明NS2对细胞培养中的病毒复制不是必需的。然而，与野生型BRSV相比，突变株的生长速度明显慢于，最终感染滴度降低了至少10倍，表明NS2提供了完全复制能力所需的支持因子。

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图1
图1
BRSV ATue51908基因组的示意图（按比例绘制）。转录物（阴影条）和蛋白质编码框（开放条）的位置显示为相对于病毒RNA（vRNA）（实心条）。在放大过程中，比较了重组病毒和ATue51908的组织结构。3′端45-nt BRSV先导区用水平条纹标记，44-nt HRSV A2先导区用垂直条纹标记。遗传标签(不是一） 以及重组病毒NS1非编码区（阴影部分）的核苷酸缺失。给出了NS1、NS2和N的基因起始点以及NS2缺失两侧的核苷酸的相对位置。vRNA的总长度如右图所示。
图2
图2
BRSV ATue51908 3′先导区（A）和5′末端（B）序列与其他肺炎病毒序列的比对。DNA序列以3′-5′病毒RNA的形式显示。对于HRSV菌株A2（28）和TRTV（33），只显示了与ATue51908序列的偏差。缺口用圆点表示，第一个基因的开始信号（BRSV和HRSV中的NS1，TRTV中的N）和L基因的结束信号用下划线表示。尾部序列的编号从L基因转录停止信号下游的第一个核苷酸开始。（C） 含有不是我用ATue51908共识序列和发布的A51908序列标记（装箱）。序列显示为DNA阳性链。仅显示与重组序列不同的核苷酸。缺口用圆点表示，NS1基因启动信号和翻译启动密码子下划线。
图3
图3
演示不是I标记重组BRSV的基因组RNA。采用正反义引物退火至基因组3′末端和NS1基因中的负义引物结合，对感染标准BRSV ATue51908或重组病毒的BSR T7/5细胞的总RNA进行RT-PCR。省略RT步骤时未检测到PCR产物。消化不是来自重组病毒的324-bp（计算大小）RT-PCR产物的I产生了两条计算大小为82和242 bp的条带，而来自标准BRSV菌株ATue51908的RT-PCR产品没有被裂解。
图4
图4
通过RT-PCR证明NS2基因缺失。用感染标准BRSV ATue51908或重组病毒的BSR T7/5细胞的总RNA进行RT-PCR，用阳性引物与BRSV基因组RNA的3′端杂交，并用N基因中的阴性引物结合。来自全长重组体和野生型病毒的产物产生了跨越NS2基因的1179 bp（计算大小）的产物，而缺失突变体产生了666 bp（计算）片段，反映了513-nt缺失。省略RT步骤时未检测到PCR产物。
图5
图5
通过Northern杂交证明病毒转录本。感染rBRSV或标准ATue51908的BSR T7/5细胞的总RNA在感染后2-4天分离出来，并在2%变性琼脂糖凝胶上分离。将该印迹与针对BRSV N基因（nt 1429至2277）（A）和NS2基因（nt 574至1026）（B）的PCR-衍生探针杂交。显示了与N mRNA（vRNA）、双顺反子N/P读入转录物和NS2 mRNA相对应的转录物。
图6
图6
重组BRSV在BSR T7/5细胞（A）和MDBK细胞（B）中的CPE。（A） 在BSR T7/5培养物中，所有重组体在感染后56 h以0.01的MOI诱导细胞从单层分离，与标准ATue51908的细胞无明显区别。（B） 在MDBK细胞中，全长重组病毒rBRSV和rH/BRSV以及标准ATue51908病毒在感染后5天产生了类似的扩大细胞灶，而NS2缺失突变体只产生了小的退化细胞灶。
图6
图6
重组BRSV在BSR T7/5细胞（A）和MDBK细胞（B）中的CPE。（A） 在BSR T7/5培养物中，所有重组体在感染后56 h以0.01的MOI诱导细胞从单层分离，与标准ATue51908的细胞无明显区别。（B） 在MDBK细胞中，全长重组病毒rBRSV和rH/BRSV以及标准ATue51908病毒在感染后5天产生了类似的扩大细胞灶，而NS2缺失突变体只产生了小的退化细胞灶。
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