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.1998年11月；66(11):5089-98.
doi:10.1128/IAI.66.11.5089-5098.1998。

内毒素血症时细胞因子上调肝细胞CD14的表达

S刘 1, L S Khemlani公司, R A夏皮罗, M L约翰逊, K刘, D A盖勒, S C沃特金斯, S M戈耶特, 万亿美元
附属公司

内毒素血症时细胞因子上调肝细胞CD14的表达

S刘等。 感染免疫. 1998年11月.

摘要

研究旨在检测内毒素血症期间肝细胞CD14的表达。我们的结果表明，体内脂多糖（LPS）治疗导致大鼠肝细胞CD14 mRNA和蛋白水平显著上调。LPS治疗后1.5小时，mRNA显著增加；这些增加在3小时达到20倍的峰值，24小时恢复到基线水平。原位杂交将CD14 mRNA表达定位于体内外肝细胞。肝脏CD14蛋白水平在3 h时可检测到增加，12 h时达到峰值。LPS处理动物的肝细胞表达更多的细胞相关CD14蛋白，LPS处理大鼠的肝细胞在体外释放更多的可溶性CD14。内毒素血症期间肝细胞CD14表达的增加与血浆中CD14水平的增加平行。为了提供肝细胞CD14的分子鉴定，我们克隆了大鼠肝脏CD14 cDNA。最长的克隆由1591bp的插入片段组成，该插入片段包含1116bp的开放阅读框。推导的氨基酸序列长372个氨基酸，分别与小鼠和人类CD14的氨基酸序列同源81.8%和62.8%，与大鼠巨噬细胞CD14相同。从该克隆中表达的CD14蛋白具有功能性，如NF-kappaB对LPS和稳定转染大鼠CD14的CHO细胞中的异硫氰酸荧光素-LPS结合的反应激活所示。核连续试验表明，LPS处理的动物肝细胞中CD14转录率显著增加，表明LPS处理后大鼠肝细胞中观察到的CD14 mRNA水平上调在一定程度上取决于转录的增加。体外和体内实验表明，白细胞介素-1β和/或肿瘤坏死因子-α参与肝细胞CD14 mRNA水平的上调。我们的数据表明，在内毒素血症期间，肝细胞表达CD14，肝细胞CD14 mRNA和蛋白水平迅速增加。我们的观察也支持这样的观点，即可溶性CD14是一种急性期蛋白，肝细胞可能是可溶性CD14生成的来源。

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数字

图1
图1
内毒素血症期间肝细胞CD14 mRNA诱导的时间进程。向Sprague-Dawley大鼠注射LPS（10 mg/kg，i.p.）。分别在1.5、3、6、12和24小时从LPS治疗组或对照组大鼠中分离肝细胞。提取总RNA，并对CD14 mRNA进行Northern blot分析。用18S rRNA探针对膜进行再杂交。CD14 mRNA水平归一化为18S rRNA，并呈与对照组相比的倍数增加。每列代表每个时间点三份样品的平均值±SE（*，P（P）与对照组相比<0.05）。
图2
图2
LPS注射后肝组织中稳定状态的CD14 mRNA水平。向Sprague-Dawley大鼠注射LPS（10 mg/kg，i.p.）。LPS注射后1.5、3、6、12和24小时从肝脏中提取总RNA，并对CD14 mRNA进行Northern blot分析。用18S rRNA探针对膜进行再杂交。条形图显示CD14 mRNA水平归一化为18S rRNA，并显示为对照组的倍数增加。Northern印迹来自一个有代表性的实验。每列代表三个独立实验的平均值±SE（*，P（P）与对照组相比<0.05）。
图3
图3
CD14 mRNA在大鼠原代肝细胞和肝切片中的定位。将在盖玻片或肝组织切片上生长的肝细胞与CD14的反义和正义核糖探针进行原位杂交。（A） 单个大鼠原代肝细胞的差异干涉对比图像（尺寸栏显示20μm）。（B） 原位信号的暗场视图(35S） ●●●●。从LPS治疗的大鼠（10 mg/kg，静脉注射，24小时治疗）分离出的原代肝细胞显示出强烈的细胞质标记。在下面的面板中，显示了在LPS治疗（C）和正常（D）大鼠的切片肝脏上进行的原位杂交。地高辛标记的核糖探针和比色技术检测到的信号显示血管周围单个肝细胞中有标记，在本例中为门静脉三联体。（原始载玻片上的阳性细胞为蓝色，如图所示为黑色。）阳性细胞的数量随着与血管系统的距离而减少。在对照肝脏（D组）中，很少或没有阳性标记的细胞。感应探针显示很少或没有标记（数据未显示）。
图4
图4
内毒素血症期间全肝提取物（A）和血浆（B）中CD14蛋白水平的Western blot分析。制备LPS治疗大鼠1.5、3、6、12和24 h（10 mg/kg，i.p.）或对照大鼠的全肝和血浆样品。亲代CHO细胞和新转染CHO细胞的全细胞提取物作为阴性对照，大鼠CD14-转染的CHO细胞作为阳性对照。蛋白质（50μg全肝匀浆或血浆，每道1μg重组蛋白）在SDS–10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝化纤维素膜上。为了检测CD14蛋白，将仓鼠抗小鼠CD14单克隆抗体（G5A10）与膜以5μg/ml孵育1小时。如制造商所述，通过增强型鲁米诺试剂（杜邦，NEN）检测免疫复合物。这些斑点是至少三个独立实验的代表。缩写：CHO/rCD14，稳定转染大鼠CD14 CHO细胞；CHO/neo，稳定的新转染CHO细胞。
图5
图5
（A） 新鲜分离和培养肝细胞中CD14蛋白水平。Western blot程序和缩写如图4所示。每组包含来自单个动物的重复样本。通道1和通道2，新鲜分离的对照肝细胞；泳道3和4，来自LPS处理的大鼠的新鲜分离的肝细胞（10 mg/kg，腹腔注射，12小时处理）；第5、6道，对照组肝细胞放置24h；通道7和8，LPS处理大鼠培养肝细胞（10 mg/kg，腹腔注射，12 h处理），24 h后进行电镀。（B）肝细胞培养上清液中的CD14蛋白水平。每组包含来自单个动物的重复样本。通道1和通道2，对照肝细胞电镀24小时；第3道和第4道，LPS治疗大鼠培养肝细胞（10 mg/kg，腹腔注射，12 h治疗）放置24 h。这些数据是三个独立实验的代表。
图6
图6
FITC-LPS与CHO/rCD14细胞的血清依赖性结合。按照材料和方法中的描述对细胞进行染色，并进行流式细胞术分析。显示了结合缓冲液中的血清浓度和FITC-阳性细胞的百分比。开放直方图表示FITC-LPS染色。x个轴，对数荧光强度；年轴，单元格编号。在CHO-K1和CHO/neo细胞中未发现FITC-LPS染色（数据未显示）。这些数据代表了至少三个独立实验。
图7
图7
过量天然形态LPS与CHO/rCD14细胞结合的FITC-LPS竞争。结合缓冲液是含有10%CS和0.1%叠氮化钠的PBS。显示了在结合缓冲液中添加的天然形态LPS的折叠过剩和FITC-阳性细胞的各自百分比。开放直方图表示FITC-LPS染色。x个轴，对数荧光强度；年轴，单元格编号。这些数据代表了三个独立的实验。
图8
图8
在血清和无血清条件下，LPS在CHO/rCD14细胞中激活NF-κB。实验按照材料和方法中的描述进行。在提取核蛋白之前，用不同剂量的LPS处理细胞。除CHO/neo细胞（0.1μg/ml）外，显示了治疗用LPS的剂量。缩写：CHO/neo，稳定新转染的CHO细胞；p65抗体，抗NF-κB p65亚单位抗体；p50抗体，抗NF-κB p65亚单位抗体。这些数据代表了两个独立的实验。
图9
图9
LPS处理大鼠肝细胞核的核连接性分析。对照组或注射LPS的大鼠的细胞核与[α-32P] UTP延长新生RNA。将延长的新生RNA与含有固定在GeneScreen plus膜（Dupont，NEN）上的CD14 cDNA的质粒通过插槽印迹仪（5μg/每个插槽）杂交。每分钟的等效计数32将每毫升P标记的核RNA探针添加到每个膜中。包含β-肌动蛋白cDNA的质粒和空载体pBluescript作为内部对照。CD14转录率用荧光成像仪定量，并归一化为β-肌动蛋白的转录率。每列代表重复样品的平均值±SE（*，P（P）与对照组相比<0.05）。
图10
图10
细胞因子对培养大鼠肝细胞稳态CD14 mRNA水平的影响。按照材料和方法进行肝细胞分离和Northern印迹分析。将大鼠原代肝细胞与单个或联合细胞因子（500 U/ml）孵育12 h。CD14 mRNA水平归一化为18S rRNA，并表示为对照组的倍数增加。每列代表三个独立实验的平均值±SE（*，P（P）与对照组相比<0.05）。
图11
图11
IL-1β和TNF-α拮抗剂的体内实验。给大鼠注射生理盐水（溶媒）、LPS（10 mg/kg，静脉注射）、LPS+IL-1ra（IL-1ra 100 mg/kg，皮下注射，0时，然后每隔6小时注射一次）、LPS-+rsTNF-RI（rsTNF-RI，1.5 mg/kg，i.v.，0时）或LPS+IL 1ra+sTNF-RI.6小时后从肝脏提取总RNA，并对CD14 mRNA进行Northern blot分析。CD14 mRNA水平归一化为18S rRNA，并呈现为对照组的倍数增加。每列代表每组四只动物的平均值±SE（*，P（P）与对照组相比<0.05；#，P（P）与LPS组相比<0.05）。
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