The Epstein-Barr virus (EBV) SM protein enhances pre-mRNA processing of the EBV DNA polymerase transcript

doi:10.1128/JVI.72.11.8485-8492.1998

.1998年11月；72(11):8485-92.

doi:10.1128/JVI.72.11.8485-8492.1998。

EB病毒SM蛋白增强EB病毒DNA聚合酶转录物的前mRNA处理

S C键¹, T吉崎, J S帕加诺

附属公司

PMID： 9765385
预防性维修识别码：项目经理110257
内政部： 10.1128/JVI.72.11.8485-8492.1998

EB病毒SM蛋白增强EB病毒DNA聚合酶转录物的前mRNA处理

S C键等。 J维罗尔. 1998年11月.

.1998年11月；72（11）：8485-92。

doi:10.1128/JVI.72.11.8485-8492.1998。

作者

S C键¹, T吉崎, J S帕加诺

附属

¹美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学微生物与免疫学系，邮编：27599。

PMID： 9765385
预防性维修识别码：项目经理110257
内政部： 10.1128/JVI.72.11.8485-8492.1998

摘要

含有非经典多聚腺苷酸化信号UAUAAA的EB病毒DNA聚合酶（pol）mRNA被裂解，多聚腺苷酸化效率低下（S.C.S.Key和J.S.Pagano，病毒学234:147-1591997）。我们假设EBV早期蛋白SM和M可能会补偿pol-pre-mRNA处理效率低下的问题，它们似乎在转录后起作用，是单纯疱疹病毒（HSV）ICP27的同源物。这里我们表明SM和M蛋白在体外相互作用。此外，谷胱甘肽S-转移酶-SM/M融合蛋白沉淀异质核糖核蛋白C1剪接蛋白。此外，SM蛋白与hnRNP A1/A2蛋白（剪接蛋白和核穿梭蛋白）抗体共同从SM表达细胞提取物中免疫沉淀。最后，在表达SM的HeLa细胞系中，EBV DNA聚合酶mRNA的处理量增加了三到四倍；这种增加不是由于转录增强。因此，通过细胞裂解和多聚腺苷化因子对EBV pol RNA的低效处理似乎得到了补偿，并可能受到早期EBV蛋白SM的调节，可能通过RNA 3'末端形成。

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图1
EBV BSLF2/BMLF1（SM/M）基因、转录物和蛋白产物。B95-8基因组中编码BSLF2/BMLF1蛋白质的部分显示在尺寸范围以下。转录发生在左侧，生成两个长度分别为1.8（SM）和1.7（M）kb的转录物。磷酸蛋白在SDS-PAGE中以大约50和60 kDa的速度迁移。SM和M的阴影部分相同；SM的阴影区域代表BSLF2编码的额外N末端41氨基酸。

图2
体外翻译蛋白中SM和M的GST-SM和GST-M沉淀。GST蛋白与5μl的体外翻译蛋白孵育。沉淀蛋白通过SDS-PAGE（10%凝胶）分离并暴露于X射线胶片。（A） pBS-M和pBS-SM构造用线性化*Hin公司*dIII，然后在[³⁵S] 蛋氨酸。通道1至3是玻璃体内M蛋白的沉淀；通道4至6是由SM-程序化裂解产物形成的沉淀。（B）由pcSM缺失引起的体外翻译蛋白质的图示*Esp公司*我，囊II、以及*Xho公司*I限制站点。在每次截短的末尾显示紧邻卵裂位点之前的氨基酸（a.a.）残基。阴影框对应于BSLF2编码的区域；实心框表示精氨酸/脯氨酸富集区，阴影框表示ICP27同源区。残留物185至192代表潜在的核出口信号，而残留物260至274则表示富含亮氨酸的区域。（C）泳道6至9，体外翻译的SM和截短的SM蛋白的GST-SM沉淀；第5车道，仅GST；通道1至4，直接装载的5μl程序化裂解物暴露较轻。

图3
GST-SM/M融合蛋白沉淀细胞蛋白，包括来自Akata细胞裂解物的hnRNP C1。（A） Akata细胞在[³⁵S] 蛋氨酸-半胱氨酸（Tran³⁵S标签；ICN）24小时，收获并溶解。用GST-SM或GST-M融合蛋白（通道4和5）或对照（通道1至3）沉淀来自裂解产物的蛋白质。蛋白质通过SDS-PAGE（10%凝胶）分离并通过放射自显影术显示。（B） 41和43 kDa hnRNP C1/C2蛋白的西方分析。用GST和GST融合蛋白从Akata裂解产物中沉淀出未标记的蛋白质。对样品进行电泳，转移到Immobilon，并用4F4单克隆抗体（G.Dreyfuss赠送）分析hnRNP C1/C2蛋白。通道6显示4F4抗体对hnRNP C1/C2的免疫沉淀。

图4
hnRNP A1/A2抗体协同免疫沉淀SM蛋白。用10 mM CdCl诱导SM表达₂用1A1单克隆抗体（通道6）或针对hnRNP C1/C2蛋白的抗体1B12（通道4）从诱导的SM-Akata核提取物中沉淀蛋白质。沉淀物通过SDS–10%聚丙烯酰胺凝胶分离，然后转移到Immobilon。用αSM53多克隆抗体检测SM蛋白。1号车道，采用vitro-translated SM；通道2，直接装载30μg用于免疫沉淀的SM-Akata核提取物。（下图）用4E4单克隆抗体对同一凝胶进行西方分析，该抗体识别所有hnRNP A和C蛋白。IgG，免疫球蛋白G。

图5
通过核糖核酸酶保护试验比较SM-HeLa细胞系和pcDNA3-He La细胞株中检测到的处理EBV DNA聚合酶转录物的数量。使用脂质体转染pCMV-W91或pBS瞬时转染SM-HeLa和pcDNA3-HeLa-细胞系⁺矢量。（A）图示pBS-313wtRPA产生的313-nt核糖探针与W91 mRNA的杂交。当RNA-RNA杂交物用RNases T和A处理时₁，得到201nt保护的片段。（B）对转染载体（V）或pCMV-W91（pol）的pcDNA3-HeLa（第2和第3道）或SM-HeLa（第4和第5道）细胞的1μg mRNA进行核糖核酸酶保护试验。GAPDH（Amersham）保护带显示在底部。这个实验重复了四次。（C）平均倍数增加，根据四个实验计算，作为每分钟受保护mRNA产物的计数比率波尔以与pcDNA3-HeLa细胞mRNA检测到的比例相同的比例从SM HeLa细胞中分离到GAPDH。插图是pcDNA HeLa和SM HeLa细胞提取物的αSM53蛋白质印迹。

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