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.1998年10月1日；12(19):2997-3007.
doi:10.1101/gad.12.19.2997。

致癌Raf诱导人成纤维细胞衰老

朱军（J Zhu） 1, D伍兹, M麦克马洪, J M主教
附属公司

致癌Raf诱导人成纤维细胞衰老

朱军（J Zhu）等。 基因开发. .

摘要

癌基因RAS和RAF被视为肿瘤转化的因子。然而，在正常细胞中，这些基因可能具有与致癌转化相反的作用，例如阻止细胞分裂周期、诱导细胞分化和凋亡。最近的研究表明，RAS可诱导正常小鼠和人成纤维细胞的增殖停滞和衰老。由于Raf/MEK/MAP激酶信号级联是Ras蛋白信号传导的关键效应器，我们检测了条件活性形式的Raf-1在人类细胞中引发细胞周期停滞和衰老的能力。非永生化人肺成纤维细胞（IMR-90）中Raf-1的激活导致细胞增殖迅速且不可逆地停止，过早衰老。在细胞周期阻滞开始的同时，我们观察到细胞周期依赖性激酶（CDK）抑制剂p21（Cip1）和p16（Ink4a）的诱导。使用HPV16的E6癌蛋白消融p53和p21（Cip1）表达表明，Raf诱导的细胞周期阻滞或衰老不需要这些蛋白的表达。此外，仅通过p16（Ink4a）的异位表达在IMR-90细胞中诱导细胞周期阻滞和衰老。Raf/MEK/MAP激酶级联的药理抑制阻止了Raf诱导p16（Ink4a），也防止了Raf诱发的衰老。我们得出的结论是，Raf启动的激酶级联反应可以调节p16（Ink4a）的表达以及随后的增殖停滞和衰老。当MAP激酶信号级联异常活跃时，衰老的诱导可能提供了对抗肿瘤转化的防御。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
Raf激酶的激活诱导IMR-90细胞的形态改变并阻止其增殖。(A类)Raf的可诱导和标记版本。将所示结构插入材料和方法中描述的复制缺陷型逆转录病毒。（EGFP）增强型绿色荧光蛋白；人类雌激素受体的激素结合域。Raf-1激酶结构域内的双垂直线和下面的YY/DD表示酪氨酸残基的位置，这些残基突变为天冬氨酸以产生更活跃的GFPΔRaf-1【日期】：ER，如《材料与方法》和之前所述（Woods等人，1997）。(B)Raf的形态效应。IMR-90细胞表达[YY](a–c)或【DD】(d–e日)用乙醇作为溶剂控制（ETOH）或不同浓度的4-HT处理GFPΔRaf-1:ER形态4天，然后用相控显微镜拍照。(C)IMR-90细胞增殖。对照组（Babe）或GFPΔRaf-1：ER表达的IMR-90细胞（[YY]或[DD]）在含有15%体积/体积FCS的DMEM中培养，不存在或存在100 n米4-HT，如图所示。每隔一天采集一次细胞，并用血细胞仪进行计数。每个数据点代表四个独立测量值的平均值。给出了一个代表多个实验的图形。（□）宝贝；（）Babe+4-HT；（小写）【年】；（▴）[年]+4-HT；（○）【尽职调查】；（•）【DD】+4-HT。
图2
图2
IMR-90细胞中衰老相关酸性β-半乳糖苷酶的活性。积极增殖表达GFPΔRaf-1的IMR-90细胞[年]：用乙醇（ETOH）或1-100 n的4-HT浓度范围处理ER米按指示持续6天，然后染色检测衰老相关酸性β-半乳糖苷酶的活性。
图3
图3
Raf对细胞周期调节器的影响。将表达对照（Babe）和GFPΔRaf-1:ER（[YY]-和[DD]）的IMR-90细胞静止24小时，此时将4-HT添加到最终浓度为1μ米在添加4-HT后的不同时间（2–48小时）制备细胞提取物，GFPΔRaf-1:ER的表达(A类)，第16页墨水4a(B)，第21页Cip1号机组(C)，细胞周期蛋白D1(D类)，第27页基普1(E类)和p42 MAP激酶(F类)用材料和方法中描述的适当抗血清进行Western blotting评估。作为对照，向细胞中添加等量的乙醇48小时（48负极).
图3
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Raf对细胞周期调节器的影响。将表达对照（Babe）和GFPΔRaf-1:ER（[YY]-和[DD]）的IMR-90细胞静止24小时，此时将4-HT添加到最终浓度为1μ米在添加4-HT后的不同时间（2–48小时）制备细胞提取物，GFPΔRaf-1:ER的表达(A类)，第16页墨水4a(B)，第21页Cip1号机组(C)，细胞周期蛋白D1(D类)，第27页基普1(E类)和p42 MAP激酶(F类)用材料和方法中描述的适当抗血清进行Western blotting评估。作为对照，向细胞中添加等量的乙醇48小时（48负极).
图3
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Raf对细胞周期调节器的影响。将表达对照（Babe）和GFPΔRaf-1:ER（[YY]-和[DD]）的IMR-90细胞静止24小时，此时将4-HT添加到最终浓度为1μ米在添加4-HT后的不同时间（2–48小时）制备细胞提取物，GFPΔRaf-1:ER的表达(A类)，第16页墨水4a(B)，第21页Cip1号机组(C)，细胞周期蛋白D1(D类)，第27页基普1(E类)和p42 MAP激酶(F类)用材料和方法中描述的适当抗血清进行Western blotting评估。作为对照，向细胞中添加等量的乙醇48小时（48负极).
图3
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Raf对细胞周期调节器的影响。将表达对照（Babe）和GFPΔRaf-1:ER（[YY]-和[DD]）的IMR-90细胞静止24小时，此时将4-HT添加到最终浓度为1μ米在添加4-HT后的不同时间（2–48小时）制备细胞提取物，GFPΔRaf-1:ER的表达(A类)，第16页墨水4a(B)，第21页Cip1号机组(C)，细胞周期蛋白D1(D类)，第27页基普1(E类)和p42 MAP激酶(F类)用材料和方法中描述的适当抗血清进行Western blotting评估。作为对照，向细胞中添加等量的乙醇48小时（48负极).
图3
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Raf对细胞周期调节器的影响。将表达对照（Babe）和GFPΔRaf-1:ER（[YY]-和[DD]）的IMR-90细胞静止24小时，此时将4-HT添加到最终浓度为1μ米在添加4-HT后的不同时间（2–48小时）制备细胞提取物，GFPΔRaf-1:ER的表达(A类)，第16页墨水4a(B)，第21页Cip1号机组(C)，细胞周期蛋白D1(D类)，第27页基普1(E类)和p42 MAP激酶(F类)用材料和方法中描述的适当抗血清进行Western blotting评估。作为对照，向细胞中添加等量的乙醇48小时（48负极).
图3
图3
Raf对细胞周期调节器的影响。将表达对照（Babe）和GFPΔRaf-1:ER（[YY]-和[DD]）的IMR-90细胞静止24小时，此时将4-HT添加到最终浓度为1μ米在添加4-HT后的不同时间（2–48小时）制备细胞提取物，GFPΔRaf-1:ER的表达(A类)，第16页墨水4a(B)，第21页Cip1号机组(C)，细胞周期蛋白D1(D类)，第27页基普1(E类)和p42 MAP激酶(F类)用材料和方法中描述的适当抗血清进行Western blotting评估。作为对照，向细胞中添加等量的乙醇48小时（48负极).
图4
图4
Raf诱导的细胞周期阻滞是不可逆的。(A类)GFPΔRaf-1[年]：ER-和(B)GFPΔRaf-1【日期】：ER-表达IMR-90细胞和(C)在无血清培养基中，在没有或存在1μ米4-HT持续24小时。在没有4-HT的情况下，用含有10%vol/vol FCS的培养基刺激细胞。存在4-HT的细胞要么保持在4-HT持续存在的状态（4-HT连续存在），要么在用含有10%vol/vol FCS的培养基刺激之前进行广泛清洗以去除4-HT（4-HT-清洗）。然后在接下来的6天内通过甲基的掺入来测量细胞增殖-[14C] 胸腺嘧啶核苷转化为DNA。（□）10%未来作战系统；（▵）4-HT连续；（○）4-HT清洗。
图5
图5
p16的持续表达墨水4aGFPΔRaf-1失活后：ER.IMR-90细胞表达GFP△Raf-1【日期】：ER未经治疗（0）或用1μ米4-HT 24小时（所有其他样品）。在4-HT中培养24小时后，（+24）细胞被广泛清洗，然后在没有4-HT的情况下培养24小时（-24）或48小时（-48）。制备细胞提取物，并表达p16墨水4a(A类)，第21页Cip1号机组(B)，细胞周期蛋白D1(C)和p42 MAP激酶(D类)和p42/p44 MAP激酶的活性(E类)用材料和方法中描述的适当抗血清进行Western blotting评估。
图6
图6
在缺乏可检测的p53和p21的情况下，Raf诱导的IMR-90细胞的细胞周期阻滞和衰老Cip1号机组. (A类)E6癌蛋白对p53和p21的影响Cip1号机组表达式。表达GFPΔRaf-1的IMR-90细胞[年]：ER细胞被编码对新霉素单独耐药（LXSN）或表达HPV16的E6蛋白和对新霉素耐药（E6）的逆转录病毒感染，并建立耐药克隆的混合群体。然后用乙醇（lanes）处理细胞24小时1,三)或1μ米4-HT（车道2,4). 制备细胞裂解物，并表达p53、p21Cip1号机组用合适的抗血清进行Western blotting检测p42 MAP激酶。(B)Raf诱导的细胞周期阻滞不受HPV-16 E6蛋白表达的影响。上述表达GFPΔRaf-1的IMR-90细胞群[年]：ER在不存在（LXSN）或存在HPV16 E6癌蛋白（E6）的情况下用乙醇或4-HT处理4天。细胞在收获前用BrdU标记3小时，固定，并用FITC-结合的抗BrdU抗体和碘化丙啶染色以检测S期细胞。使用Becton-Dickinson FACscan对细胞进行分析，以确定G细胞中的细胞百分比1、S和G2/细胞周期的M个阶段。(C)Raf诱导的SA–β-半乳糖苷酶活性。上述表达GFPΔRaf-1的IMR-90细胞群[年]：在无（LXSN）或有HPV16 E6癌蛋白（E6）细胞的情况下，用乙醇或4-HT处理ER 6天，然后按照材料和方法中的描述评估SA–β-半乳糖苷酶的活性。
图6
图6
在缺乏可检测的p53和p21的情况下，Raf诱导的IMR-90细胞的细胞周期阻滞和衰老Cip1号机组. (A类)E6癌蛋白对p53和p21的影响Cip1号机组表达式。表达GFPΔRaf-1的IMR-90细胞[年]：ER细胞被编码对新霉素单独耐药（LXSN）或表达HPV16的E6蛋白和对新霉素耐药（E6）的逆转录病毒感染，并建立耐药克隆的混合群体。然后用乙醇（lanes）处理细胞24小时1,三)或1μ米4-HT（车道2,4). 制备细胞裂解物，并表达p53、p21Cip1号机组用合适的抗血清进行Western blotting检测p42 MAP激酶。(B)Raf诱导的细胞周期阻滞不受HPV-16 E6蛋白表达的影响。上述表达GFPΔRaf-1的IMR-90细胞群[年]：ER在不存在（LXSN）或存在HPV16 E6癌蛋白（E6）的情况下用乙醇或4-HT处理4天。细胞在收获前用BrdU标记3小时，固定，并用FITC-结合的抗BrdU抗体和碘化丙啶染色以检测S期细胞。使用Becton-Dickinson FACscan对细胞进行分析，以确定G细胞中的细胞百分比1、S和G2/细胞周期的M个阶段。(C)Raf诱导的SA–β-半乳糖苷酶活性。上述表达GFPΔRaf-1的IMR-90细胞群[年]：在无（LXSN）或有HPV16 E6癌蛋白（E6）细胞的情况下，用乙醇或4-HT处理ER 6天，然后按照材料和方法中的描述评估SA–β-半乳糖苷酶的活性。
图6
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在缺乏可检测的p53和p21的情况下，Raf诱导的IMR-90细胞的细胞周期阻滞和衰老Cip1号机组. (A类)E6癌蛋白对p53和p21的影响Cip1号机组表达式。表达GFPΔRaf-1的IMR-90细胞[年]：ER细胞被编码对新霉素单独耐药（LXSN）或表达HPV16的E6蛋白和对新霉素耐药（E6）的逆转录病毒感染，并建立耐药克隆的混合群体。然后用乙醇（lanes）处理细胞24小时1,三)或1μ米4-HT（车道2,4). 制备细胞裂解物，并表达p53、p21Cip1号机组用合适的抗血清进行Western blotting检测p42 MAP激酶。(B)Raf诱导的细胞周期阻滞不受HPV-16 E6蛋白表达的影响。上述表达GFPΔRaf-1的IMR-90细胞群[年]：ER在不存在（LXSN）或存在HPV16 E6癌蛋白（E6）的情况下用乙醇或4-HT处理4天。细胞在收获前用BrdU标记3小时，固定，并用FITC-结合的抗BrdU抗体和碘化丙啶染色以检测S期细胞。使用Becton-Dickinson FACscan对细胞进行分析，以确定G细胞中的细胞百分比1、S和G2/细胞周期的M个阶段。(C)Raf诱导的SA–β-半乳糖苷酶活性。上述表达GFPΔRaf-1的IMR-90细胞群[年]：在无（LXSN）或有HPV16 E6癌蛋白（E6）细胞的情况下，用乙醇或4-HT处理ER 6天，然后按照材料和方法中的描述评估SA–β-半乳糖苷酶的活性。
图7
图7
p16抑制细胞周期和诱导衰老墨水4a用逆转录病毒载体感染IMR-90细胞，逆转录病毒表达可选择的单纯嘌呤霉素耐药标记（Babe）或标记加人类p16墨水4a如图所示。然后对感染细胞进行6天的筛选。对存活细胞进行SA–β-半乳糖苷酶活性分析(A类)或用BrdU标记，通过FACscan分析DNA的相对含量(B). (B)上框表示S期细胞；下框用G表示单元格0/G公司1(左边)或G2/M（M）(正确的). 上框中的数字表示S期细胞的百分比。
图8
图8
诱导p16需要MEK活性墨水4aRaf对IMR-90细胞的衰老作用。(A类)抑制MAP激酶激活和p16墨水4a通过PD098059表达。表达GFPΔRaf-1的异步生长IMR-90细胞[年]：ER接受10 n米在没有（DMSO）或存在MEK抑制剂PD098059（PD，25μ米)如图所示。p42/p44 MAP激酶活性及p42 MAP激酶和p16的表达墨水4a用合适的抗血清进行Western blotting检测。(B)MEK活性是Raf诱导IMR-90细胞衰老所必需的。对照（Babe）和GFPΔRaf-1:ER（[YY]-和[DD]）表达的IMR-90细胞用4-HT（10n米对于[DD]和3n米[YY]），PD（25μ米)或等量的乙醇或二甲基亚砜6天，并染色以检测SA–β-半乳糖苷酶活性。
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