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.1998年10月5日；143(1):49-63.
doi:10.1083/jcb.143.1.49。

CENP-E动粒结合域的表征揭示了与动粒蛋白CENP-F和hBUBR1的相互作用

G K Chan公司 1, B T沙尔, T J Yen先生
附属机构

CENP-E动粒结合域的表征揭示了与动粒蛋白CENP-F和hBUBR1的相互作用

G K Chan公司等。 J细胞生物学. .

摘要

我们已经在动粒马达CENP-E中鉴定出一个350-氨基酸结构域，该结构域在有丝分裂中指定动粒结合，但在间期不指定。在酵母双杂交筛选中使用动粒结合域分离相互作用蛋白，包括动粒蛋白CENP-E、CENP-F和hBUBR1，后者是一种BUB1相关激酶，在一些结直肠癌（Cahill，D.P.、C.Lengauer、J.Yu、G.J.Riggins、J.K.Wilson、S.D.Markowitz、K.W.Kinzler和B。沃格尔斯坦。1998.自然。392:300-303). 在细胞周期的后期，CENP-F、hBUBR1和CENP-E按顺序组装到动粒上。因此，这些蛋白质定义了沿着动粒组装路径的离散步骤。未对齐染色体的动粒显示出比对齐染色体更强的hBUBR1和CENP-E染色。CENP-E和hBUBR1在动粒中保持共定位，直到中期后期，当hBUBRl定位于纺锤体中区的部分区域，而这些区域与CENP-E.没有重叠时。由于CENP-E-和hBUBRE1可以从HeLa细胞中相互免疫沉淀，它们可能在动粒起到马达激酶复合物的作用。然而，hBUBR1的复杂分布模式表明，它可能调节包括动粒和纺锤体中区在内的多种功能。

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数字

图1
图1
proA和gfp:CENP-E融合蛋白在HeLa细胞中的表达。(A类)示意图描述了重叠的CENP-E cDNA片段集，测试了它们结合动粒（+）或不结合（−）的能力。带阴影的盒子，动粒结合结构域。(B类)用碱性磷酸酶结合人IgG检测转染细胞裂解物表达各种proA:CENP-E融合蛋白的免疫印迹。用大鼠抗Gfp抗体检测CENP-E融合蛋白。
图1
图1
proA和gfp:CENP-E融合蛋白在HeLa细胞中的表达。(A类)示意图描述了重叠的CENP-E cDNA片段集，测试了它们结合动粒（+）或不结合（−）的能力。带阴影的盒子动粒结合域。(B类)使用碱性磷酸酶-缀合的人IgG检测表达各种proA:CENP-E融合蛋白的转染细胞裂解物的免疫印迹。用大鼠抗Gfp抗体检测CENP-E融合蛋白。
图2
图2
CENP-E动粒结合域的定位。(一)Gfp:CENP-E1558–2662（F） 结合动粒并与ACA共定位，但不与微管共定位。(b条)Gfp:CENP-E1958–2662（J） 与ACA共定位，但不与微管共定位。(c（c）)Gfp:CENP-E803–2123（E） 表达但不局限于动粒。用Cy-5抗人次级抗体进行ACA染色，用生物素化抗小鼠次级抗体和与链霉亲和素结合的德克萨斯红检测抗微管蛋白抗体。在FITC通道中观察到Gfp融合。(d日)含有gfp:CENP-E的Kinetochores1958–2662（J） 使用兔抗CENP-E“颈部”抗体（Schaar等人，1997年）检测内源性CENP_E，并与用相同抗体染色的相邻未转染中期进行比较。(e（电子）)含有gfp:CENP-E的Kinetochores1958–2662（J） 用CENP-F进行检测，并与未转染的中期细胞进行比较。用德克萨斯红偶联抗兔二级抗体检测兔抗-CENP-E和抗-CENP-F抗体。染色体用DAPI染色。所有样品首先固定，然后渗透。棒材，10μm。
图3
图3
最小动粒结合域的定位。项目：CENP-E2305–2662（N） 与一个细胞中的所有动粒结合(b条)但另一个只有几个(d日). (（f）)最小动粒结合域位于proA:CENP-E内2126–2476年（P） ●●●●。ProA:CENP-E融合用德克萨斯红结合人IgG进行可视化(b条,d日、和（f）). 染色体用DAPI染色(一,c（c）、和e（电子）).箭头双点动粒染色。所有样品首先固定，然后渗透。棒材，10μm。
图4
图4
CENP-E在间期细胞核中的异位表达。(一)HeLa裂解物表达探针：CENP-E2126–2565：NLS（O）。用碱性磷酸酶结合人IgG进行免疫印迹。(b–d段)HeLa细胞与(c（c）)项目：CENP-E2126–2565：NLS（O）和(d日)CENP-B:gfp。(e（电子）和（f）)项目：CENP-E2126–2565：NLS（O）在有丝分裂期间定位于动粒。(c（c）和（f）)项目：CENP-E2126–2565：NLS（O）用德克萨斯红结合人IgG可视化。(b条和e（电子）)用DAPI观察染色体和细胞核。箭头双点动粒染色。所有样品首先固定，然后渗透。棒材，10μm。
图5
图5
人hBUBR1激酶的鉴定。(一)用GCG PILEUP程序生成描述酵母、小鼠、大鼠（部分克隆）和人类BUB1激酶相关性的树状图。(b条)NH校准2-mBUB1、hBUBR1、酵母BUB1和酵母MAD3的末端部分。装箱区域中相同和保守的残基分别用粗体和阴影表示。在MacVector 6.0.1中使用ClustalW进行校准。(c（c）)用亲和纯化的hBUBR1抗体（lanes）探测50μg HeLa裂解物2和4)和亲和纯化的hBUB1抗体（泳道1和三). 用hBUB1抗体探测的过滤器（lane三)用hBUBR1抗体（lane4)，以表明hBUB1和hBUBR1可以相互解析。条形图显示了两条带状if车道的分隔三和4被叠加。
图5
图5
人hBUBR1激酶的鉴定。(一)用GCG PILEUP程序生成描述酵母、小鼠、大鼠（部分克隆）和人类BUB1激酶相关性的树状图。(b条)NH校准2-mBUB1、hBUBR1、酵母BUB1和酵母MAD3的末端部分。装箱区域中相同和保守的残基分别用粗体和阴影表示。在MacVector 6.0.1中使用ClustalW进行校准。(c（c）)用亲和纯化的hBUBR1抗体（lanes）探测50μg HeLa裂解物2和4)和亲和纯化的hBUB1抗体（lane1和三). 用hBUB1抗体探测的过滤器（lane三)用hBUBR1抗体（lane4)，以表明hBUB1和hBUBR1可以相互解析。条形图显示了两条带状if车道的分隔三和4被叠加。
图5
图5
人hBUBR1激酶的鉴定。(一)用GCG PILEUP程序生成描述酵母、小鼠、大鼠（部分克隆）和人类BUB1激酶相关性的树状图。(b条)NH校准2-mBUB1、hBUBR1、酵母BUB1和酵母MAD3的末端部分。方框区域中的相同残基和保守残基分别用粗体和阴影表示。在MacVector 6.0.1中使用ClustalW进行校准。(c（c）)用亲和纯化的hBUBR1抗体（lanes）探测50μg HeLa裂解物2和4)和亲和纯化的hBUB1抗体（lane1和三). 用hBUB1抗体探测的过滤器（lane三)用hBUBR1抗体（lane4)，以表明hBUB1和hBUBR1可以相互解析。条形图显示了两条带状if车道的分隔三和4被叠加。
图6
图6
hBUBR1在CENP-F之后但CENP-E之前在动粒上组装(b条)hBUBR1在间期HeLa细胞中的分布。(c–h)用hBUBR1和CENP-E对前期和早期前中期细胞进行双重染色。箭头指向含有hBUBRl的动粒(克)但不是CENP-E(小时). (i–k)用hBUBR1和CENP-F.In对前期细胞进行双重染色c–e类和i–k，细胞在固定前被提取，以减少可溶性蛋白池，这将模糊动粒染色的检测。hBUBR1型(b条,d日,克、和j个)用大鼠抗hBUBR1抗体和Cy2-抗鼠IgG染色。欧洲标准化委员会(e（电子）,小时)和CENP-F(k个)分别用兔抗CENP-E和CENP-F抗体染色，并用德克萨斯红抗兔IgG进行复染。染色体和细胞核用DAPI染色(一,c（c）,（f）、和我).一和b条用40倍物镜拍照，而其他面板用100倍物镜拍摄。棒材，10μm。
图7
图7
hBUBR1和CENP-E在有丝分裂期间表现出复杂的定位模式。hBUBR1的双重免疫荧光染色(b条,e（电子）,小时,k个,n个)和CENP-E(c（c）,（f）,我,我,o个)从前期到末期的细胞。这个插入在里面d日，表示单个未对齐的染色体。左箭头和右箭头分别指向尾随和前导动粒。尾部动粒表现出更强的hBUBR1(e（电子）)和CENP-E(（f）)染色比其主要的动粒。提取所有样品，然后固定，以减少hBUBR1和CENP-E的可溶性池造成的染色。如图6所示，使用相同的抗体。棒材，10μm。
图8
图8
hBUBR1在HeLa细胞中与CENP-E形成复合物。(一)用亲和纯化的大鼠抗hBUBR1 IgG免疫沉淀hBUBRl，然后用兔抗hBUBRE1探针进行检测(底部面板，车道1)和兔抗CENP-E抗体(顶部面板，车道1). 用CENP-E抗体获得的免疫沉淀物（lane2)和非免疫抗体（lane三)使用CENP-E进行探测(顶部面板)和hBUBR1(底部面板). 切割过滤器，用hBUBR1和CENP-E抗体探测适当的切片。(b条)ProA:hBUBR1409–1051（车道1)，proA:hBUBR11–467（车道2)，gfp:hBUBR1（车道三)和gfp（车道4)分别从转染人IgG Sepharose和抗gfp抗体的裂解物中进行免疫沉淀，并检测共沉淀CENP-E（通道1–4,顶部面板). 用gfp:CENP-E共转染细胞制备的裂解液1958– 2662和proA:hBUBR1409–1051（车道5)或proA:hBUBR11–429（车道6)与人IgG Sepharose孵育以免疫沉淀proA:CENP-E融合蛋白（车道5和6,底部面板)，然后探索共沉淀gfp:CENP-E1958– 2662(顶部面板). gfp:CENP-E的表达1958–2662与任一proA:hBUBR1共同转染的细胞内409–1051（参见车道7)或proA:hBUBR11–467（参见车道8)经Western blot证实。ProA:CENP-E和gfp:CENP/E融合分别用碱性磷酸酶结合的人IgG和大鼠抗gfp抗体检测。分子量标准显示在每个面板的左侧。
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