Endogenous calcium buffering in motoneurones of the nucleus hypoglossus from mouse

doi:10.1111/j.1469-7793.1998.105bi.x

.1998年8月15日；511（第1部分）（第一部分）：105-17。

doi:10.1111/j.1469-7793.1998.105bi.x。

小鼠舌下核运动神经元内源性钙缓冲

M B嘴唇¹, B U Keller公司

附属公司

PMID： 9679167
预防性维修识别码： PMC2231095型
内政部： 10.1111/j.1469--7793.1998.105双x

小鼠舌下核运动神经元内源性钙缓冲

M B嘴唇等。生理学杂志. 1998.

.1998年8月15日；511（第1部分）（第一部分）：105-17。

doi:10.1111/j.1469-7793.1998.105bi.x。

作者

M B嘴唇¹, B U Keller公司

附属

¹德国哥廷根洪堡塔利大学Zentrum Physiosie und Pathologysicologie，Universitat Gottingen，Humboldtalee 23，37073。

PMID： 9679167
预防性维修识别码： PMC2231095型
内政部： 10.1111/j.1469-7793.1998.105比克斯

摘要

1.对2-6日龄小鼠脑干舌下核切片中的65个运动神经元同时进行膜片钳和快速微量荧光钙测量。2.在体外切片制备的分离过程中，舌下运动神经元特别容易受到机械或代谢应激的影响。因此，根据舌下神经的自发节律活动（XII）判断，对实验条件进行了优化，以实现功能完整性。3.在去极化电压阶跃期间，以毫秒时域的时间分辨率监测细胞体中的钙浓度。使用快速单色仪（切换τ<10 ms）、光电倍增管和钙敏感染料fura-2和mag-fura-5进行比率荧光测量。4.研究了作为细胞内钙指示染料浓度函数的体细胞钙瞬变动力学。钙瞬变的衰减近似于单个指数分量，衰减时间常数与染料浓度呈线性关系。在没有指示染料的情况下，推断的衰变时间为0.7+/-0.2秒，这表明生理条件下的体钙动力学很快。5.通过反向提取，“添加缓冲液”方法，获得了41+/-12（9个细胞）的钙结合率，表明98%进入舌下运动神经元的钙离子被内源性缓冲液结合。6.舌下运动神经元的内源性钙结合比率与其他大小或几何形状相当的神经元相比较小。因此，我们的测量结果表明，舌下运动神经元对钙相关兴奋毒性的选择性脆弱性可能部分归因于这些细胞中的低浓度钙缓冲液。

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数字

**图4。去极化脉冲诱导体细胞钙异质性²⁺脑干神经元的信号**
一个、去极化脉冲作用于舌下核运动神经元，导致体细胞钙依赖性和非依赖性荧光的变化*在体外*切片准备。持续1s的去极化脉冲到-60到+50 mV之间的电压会导致显著的Ca²⁺体细胞内的积累（保持电位，-70 mV；步长，+10 mV，脉冲频率，0.5 Hz）。荧光痕迹显示信号F类_360390个如顶部记录道所示，在360（25 ms）和390 nm下记录。荧光信号以珠单元（BU）给出，如前所述（Neher，1995）。钙依赖性荧光减弱F类₃₉₀可以清楚地检测到正至-60 mV的去极化。注意连续去极化时360 nm处的荧光恒定值，表示感兴趣的时间间隔内染料浓度恒定。B类，NTS中间神经元的相应记录。C类，相当于迷走神经背侧运动神经元的记录。注意NTS和迷走神经神经元与舌下运动神经元在390 nm处钙依赖性荧光衰减的差异。

**图8。内源性钙²⁺舌下运动神经元的缓冲能力**
一个，500 ms去极化脉冲至+10 mV诱发的钙瞬变。体细胞钙的振幅和衰减时间常数τ²⁺按照方法一节中的描述，通过比率计算确定信号。B类，钙瞬变的衰减由一个指数近似，并与钙作对比²⁺结合能力，κ_B类'，fura-2或mag-fura-5。根据360和390 nm处钙依赖和独立荧光、钙静息水平和峰值水平估算指示染料的浓度和结合能力，并记录每个去极化脉冲。τ的线性回归与κ_B类'根据最小二乘法（Pearson’s第页= 0.95). 回归线的负截距得出舌下运动神经元的钙结合率为41±12（9个细胞）。κ处的钙衰变时间常数_B类′=0外推为0.7±0.2（9个细胞）。开圆表示用mag-fura-5（500μm）在移液管溶液中进行的7次实验的平均值（平均值±s.e.m.公司。钙瞬态衰减时间常数，1.38±0.13 s）。

**图1。小鼠脑干舌下核**
一个，横截面示意图，显示所调查的舌下区域和重要的定向特征。舌下神经末梢（XII）出现在延髓腹侧。B类对于整个脑干的记录，脊髓准备（从第8脊神经到脑桥延髓交界处）的组织被固定在腹侧向上的丙烯酸玻璃室中，并在28°C下与人工脑脊液混合（参考文献见方法）。融合率≈8 ml min⁻¹用应用于近端神经末梢的传统玻璃抽吸电极在细胞外记录电活动。上面的痕迹显示舌下神经（XII）根的节律性呼吸放电。在电子带通滤波后对复合电位进行积分（较低的迹线，1-2kHz；Int.（XII））。

**图2。舌下神经根（XII）和颈脊神经根（C1）自发节律放电的比较**
脑干-脊髓准备中节律活动的细胞外记录。从舌下神经记录呼吸节律复合动作电位(一个和颈神经根(B类，C1），如图1所示B类颈根的节律性放电在数小时内保持不变，而舌下神经的活动在30-60分钟后逐渐减弱一个和B类显示低和高轨迹显示神经活动综合信号的高时间分辨率。

**图3。充满神经生物素和荧光指示剂的舌下运动神经元**
一个，一种细胞内标记的舌下运动神经元，充满神经生物素（4.5 mg ml⁻¹)在膜片钳实验中。B类下部的显微照片显示，在紫外光下可见一种不同的运动神经元，其中充满200μM呋喃-2。体细胞内的方框显示了体钙测量所选的区域。

**图5。去极化诱导钙的异质性²⁺不同脑干神经元类型胞体的升高**
一个，迷走神经、NTS和舌下神经去极化诱导钙升高的例子。从-70 mV的保持电位开始，对-60和+40 mV之间的电压施加持续1s的阶跃去极化（阶跃大小，+10 mV；频率，0.5 Hz；另见图4）。钙²⁺在每次脉冲结束时测量浓度，并绘制相应的去极化膜电位图。最大钙升高[Ca]_最大值通过拟合函数[Ca]确定_我=[钙]_最大值/（1+e^{-K（K）(V（V）-V（V）}^_½⁾)每个神经元类型的数据点（连续线；*V（V）*_½表示半最大响应时的膜去极化）。钙升高的相对幅度（百分比）如图5所示一个因此，测定了膜电位的半最大钙升高*V（V）*_½迷走神经、NTS和舌下神经分别为-32、-25和-15 mV。B类，的平均值*V（V）*_½为-29.4±6.4毫伏(n个=6）对于迷走神经，-24.7±8.6 mV(n个=12）对于NTS和-18.9±12 mV(n个=9）舌下神经。

**图6。钙²⁺瞬态按单个指数分量衰减**
一个，加利福尼亚州²⁺迷走神经、NTS和舌下神经去极化脉冲持续1s至0 mV之前、期间和之后的浓度。钙瞬变的衰减可以用单一指数成分（暗线）很好地描述，但时间常数在不同的神经元类型中是不均匀的。上部记录道表示比率测定的Ca²⁺200μM fura-2和更低痕量中的浓度对应于平行电流测量。B类，不同神经元类型的平均衰减时间常数。柱状图显示钙的静息水平下降速度快了近2倍²⁺舌下运动神经元的浓度(n个=14，4.3±0.9 s），与迷走神经相比(n个=7，8.4±1.4 s）或NTS神经元(n个=12，8.0±0.7秒）。

**图7。钙指示染料胞液浓度逐渐增加期间的钙瞬变**
一个，钙非依赖荧光F类₃₆₀在建立全细胞膜片钳结构后的不同时间内，在微珠单位（BU）中。连续线表示具有单个指数函数的最小二乘拟合（时间常数，8分钟）。请注意，在建立全细胞记录配置后的最早时期，与单个指数的偏差。B类，钙依赖荧光F类₃₉₀在500ms去极化脉冲期间，建立全细胞记录配置后的不同时间间隔。注意延长的衰减时间F类₃₉₀40s、2min、4min和9min后发出信号，反映Ca的衰减时间延长²⁺随着呋喃-2浓度的增加（实验结束时为200μM）。

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[1] Alexianu ME、Ho BK、Mohamed AH、La BV、Smith RG、Appel SH。钙结合蛋白在肌萎缩侧索硬化选择性运动神经元易损性中的作用。神经病学年鉴。1994;36:846–858.-公共医学

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