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.1998年6月15日；12(12):1812-24.
doi:10.1101/gad.12.12.1812。

从内质网到细胞核的应激反应途径需要哺乳动物细胞中一种新的双功能蛋白激酶/内核糖核酸酶（Ire1p）

W蒂拉松龙 1, A韦利欣达, R J考夫曼
附属公司

从内质网到细胞核的应激反应途径需要哺乳动物细胞中一种新的双功能蛋白激酶/内核糖核酸酶（Ire1p）

W蒂拉松龙等。 基因开发. .

摘要

真核生物通过上调内质网蛋白伴侣基因（如BiP）的转录，对内质网（ER）中存在的未折叠蛋白作出反应。我们分离出一个新的人类cDNA，编码酿酒酵母Ire1p的同源物，这是酵母中这种信号转导途径的近端传感器。基因产物hIre1p是一种1型跨膜蛋白，含有一个细胞质结构域，该结构域与具有Ser/Thr蛋白激酶结构域和RNase L同源结构域的酵母对应物高度保守。然而，腔结构域与酵母基因产物有着广泛的差异。在哺乳动物细胞中表达的hIre1p显示出内在的自磷酸化活性和内核糖核酸酶活性，该活性可切割酵母HAC1 mRNA的5'剪接位点，而酵母HAC1是Ire1p内核糖酶活性的底物。过度表达的hIre1p定位于内质网，在核膜周围具有特定浓度，并与核孔复合体有部分共定位。Ire1p mRNA的表达通过一个需要功能性hIre1p激酶活性的过程进行自动调节。最后，野生型hIre1p的过表达在大鼠BiP启动子的转录控制下组成性地激活了报告基因，而催化活性不活跃的hIre1p的表达以反主导负的方式阻止BiP启动子的转录激活，以响应由N-连接糖基化抑制诱导的内质网应激。这些结果表明，hIre1p是哺乳动物细胞中未折叠蛋白反应途径的重要近端传感器。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
hIre1p的结构和氨基酸序列分析。(A类)编码人类Ire1p的重叠互补DNA的对齐和限制图。RH3是用于筛选人胎肝cDNA文库以获得cDNA克隆3-1-1、3-1.2、8-1、9-1、13-1和17-1的主要探针。F14是从人肝癌细胞HepG2分离的RNA中扩增出的5′RACE–PCR产物。开条表示hIre1p的预测ORF编码。(B类)hIre1p的域组织。（实心框）电位信号序列；(公式图像)潜在N-连接糖基化位点；（TM）一个假定的跨膜区；（Linker）与已知蛋白质没有同源性的区域；Ser/Tr蛋白激酶（S/T激酶）催化结构域；（RNase L）与2-5寡核苷酸依赖性RNase具有高度同源性的结构域。对应域的标识百分比酿酒酵母和秀丽线虫显示。(C类)（H.s.）人类Ire1p的氨基酸序列比对，（s.c.）酿酒酵母Ire1p和（C.e.）其推测同源蛋白来自C.秀丽。（打开盒子）相同的顺序；（阴影框）保守残留物；（破折号）残留物之间的间隙，以获得最大匹配。数字是最后一个氨基酸的位置。（▿）潜在信号肽裂解位点；（•）蛋白激酶结构域中的不变残基；（*）激酶亚结构域II中的不变Lys599残基。还鉴定了连接子区域中的富谷氨酰胺簇（I）和富丝氨酸簇（II）。
图1
图1
hIre1p的结构和氨基酸序列分析。(A类)编码人类Ire1p的重叠互补DNA的对齐和限制图。RH3是用于筛选人胎肝cDNA文库以获得cDNA克隆3-1-1、3-1.2、8-1、9-1、13-1和17-1的主要探针。F14是从人肝癌细胞HepG2分离的RNA中扩增出的5′RACE–PCR产物。开条表示hIre1p的预测ORF编码。(B类)hIre1p的域组织。（实心盒）电位信号序列；(公式图像)潜在N-连接糖基化位点；（TM）假定的跨膜区；（Linker）与已知蛋白质没有同源性的区域；Ser/Tr蛋白激酶（S/T激酶）催化结构域；（RNase L）与2-5寡核苷酸依赖性RNase具有高度同源性的结构域。对应域的标识百分比酿酒酵母和秀丽线虫显示。(C类)（H.s.）人类Ire1p的氨基酸序列比对，（s.c.）酿酒酵母Ire1p和（C.e.）其推测同源蛋白来自秀丽隐杆线虫。（打开盒子）相同的顺序；（阴影框）保守残基；（破折号）残留物之间的间隙，以获得最大匹配。数字是最后一个氨基酸的位置。（▿）潜在信号肽裂解位点；（•）蛋白激酶结构域中的不变残基；（*）激酶亚结构域II中的不变Lys599残基。还鉴定了连接子区域中的富谷氨酰胺簇（I）和富丝氨酸簇（II）。
图1
图1
hIre1p的结构和氨基酸序列分析。(A类)编码人类Ire1p的重叠互补DNA的对齐和限制图。RH3是用于筛选人胎肝cDNA文库以获得cDNA克隆3-1-1、3-1.2、8-1、9-1、13-1和17-1的主要探针。F14是从人肝癌细胞HepG2分离的RNA中扩增出的5′RACE–PCR产物。开条表示hIre1p的预测ORF编码。(B类)hIre1p的域组织。（实心盒）电位信号序列；(公式图像)潜在N-连接糖基化位点；（TM）假定的跨膜区；（Linker）与已知蛋白质没有同源性的区域；Ser/Tr蛋白激酶（S/T激酶）催化结构域；（RNase L）与2-5寡核苷酸依赖性RNase具有高度同源性的结构域。对应域的标识百分比酿酒酵母和秀丽线虫显示。(C类)（H.s.）人Ire1p的氨基酸序列比对，（s.c.）酿酒酵母Ire1p和（C.e.）其推测同源蛋白来自C.秀丽。（打开盒子）相同的顺序；（阴影框）保守残留物；（破折号）残留物之间的间隙，以获得最大匹配。数字是最后一个氨基酸的位置。（▿）潜在信号肽裂解位点；（•）蛋白激酶结构域中的不变残基；（*）激酶亚结构域II中的不变Lys599残基。还鉴定了连接子区域中的富谷氨酰胺簇（I）和富丝氨酸簇（II）。
图2
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hIRE1型在人体组织中广泛表达。poly（A）的Northern印迹分析+通过与32对应于hIRE1型管腔域hIRE1型细胞质结构域或人类β-肌动蛋白cDNA。Ire1放射自显影的曝光时间是β-actin的24倍。
图3
图3
瞬时转染COS-1猴细胞中hIre1p的过度表达。(A类)转染COS-1细胞中hIre1p的表达。用编码野生型hIre1p（pED–hIRE1型)或其激酶缺陷突变体（pED–hIRE1型K599A）。将转染细胞脉冲标记为[35S] -蛋氨酸和半胱氨酸15分钟。制备细胞提取物，用α-hIre1p抗体免疫沉淀等量，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。(B类)eIF-2α在共转染细胞中的表达。模拟转染COS-1细胞（lane1)或在pED存在的情况下与pED–eIF-2α共转染（车道2)，pED–hIRE1型（车道三)或pED–hIRE1型K599A（车道4). 细胞被脉冲标记为[35S] 蛋氨酸和半胱氨酸处理15分钟。制备细胞提取物，并通过SDS-PAGE和放射自显影术直接分析放射性标记蛋白的等量cpm。(C类)功能性hIre1p限制hIRE1型mRNA。从转染pED、pED-的COS-1细胞中分离出总RNAhIRE1，或pED–hIRE1型K599A质粒，在存在（+）或不存在（−）环己酰亚胺的情况下处理。RNA样品（10μg）在甲醛-琼脂糖凝胶中溶解，印在尼龙膜上，并与32P标记hIRE1型cDNA探针。（箭头）hIRE1转录本。(D类)hIre1p具有内在激酶活性。从瞬时转染的COS-1细胞中免疫沉淀野生型或K599A突变体hIre1p。（模拟）未接收质粒DNA的细胞。蛋白质在[γ]存在下在激酶缓冲液中培养-32P] ATP在30°C下放置40分钟。通过SDS-PAGE将蛋白质分解并转移到硝化纤维素膜上。（顶部）合并[32P] 放射自显影法测定磷酸化为hIre1p；(底板)通过使用α-hIre1p抗体和碱性磷酸酶染色的酯酶印迹分析测定Ire1p蛋白水平。凝胶上装载的K599A突变hIre1p的数量是车道上装载的免疫沉淀蛋白数量的三分之一1和2因此，稳态K599A突变体hIre1p的量比野生型hIre1 p大约10倍。
图3
图3
瞬时转染COS-1猴细胞中hIre1p的过度表达。(A类)转染COS-1细胞中hIre1p的表达。用或不用编码野生型hIre1p的表达质粒瞬时转染COS-1细胞（pED–hIRE1型)或其激酶缺陷突变体（pED–hIRE1型K599A）。将转染细胞脉冲标记为[35S] -蛋氨酸和半胱氨酸15分钟。制备细胞提取物，用α-hIre1p抗体免疫沉淀等量，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。(B类)共转染细胞中eIF-2α的表达。模拟转染COS-1细胞（lane1)或在pED存在的情况下与pED–eIF-2α共转染（车道2)，pED–hIRE1型（车道三)或pED–hIRE1型K599A（车道4). 细胞被脉冲标记为[35S] 蛋氨酸和半胱氨酸处理15分钟。制备细胞提取物，并通过SDS-PAGE和放射自显影术直接分析放射性标记蛋白的等量cpm。(C类)功能性hIre1p限制hIRE1型mRNA。从转染pED、pED-的COS-1细胞中分离出总RNAhIRE1，或pED–hIRE1型K599A质粒，在存在（+）或不存在（−）环己酰亚胺的情况下处理。RNA样品（10μg）在甲醛-琼脂糖凝胶中溶解，印在尼龙膜上，并与32P标记hIRE1型cDNA探针。（箭头）hIRE1转录本。(D类)hIre1p具有内在激酶活性。从瞬时转染的COS-1细胞中免疫沉淀野生型或K599A突变体hIre1p。（模拟）未接收质粒DNA的细胞。蛋白质在[γ]存在下在激酶缓冲液中培养-32P] ATP在30°C下放置40分钟。通过SDS-PAGE将蛋白质分解并转移到硝化纤维素膜上。（顶部）合并[32P] 放射自显影法测定磷酸化为hIre1p；(底板)通过使用α-hIre1p抗体和碱性磷酸酶染色的酯酶印迹分析测定Ire1p蛋白水平。装载到凝胶上的K599A突变体hIre1p的量是装载泳道的免疫沉淀蛋白量的三分之一1和2因此，稳态K599A突变体hIre1p的量比野生型hIre1 p大约10倍。
图3
图3
瞬时转染COS-1猴细胞中hIre1p的过度表达。(A类)转染COS-1细胞中hIre1p的表达。用编码野生型hIre1p（pED–hIRE1型)或其激酶缺陷突变体（pED–hIRE1型K599A）。用脉冲标记转染的细胞[35S] -蛋氨酸和半胱氨酸15分钟。制备细胞提取物，用α-hIre1p抗体免疫沉淀等量，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。(B类)eIF-2α在共转染细胞中的表达。模拟转染COS-1细胞（lane1)或在pED存在的情况下与pED–eIF-2α共转染（车道2)，pED–hIRE1型（车道三)或pED–hIRE1型K599A（车道4). 细胞被脉冲标记为[35S] 蛋氨酸和半胱氨酸处理15分钟。制备细胞提取物，并通过SDS-PAGE和放射自显影术直接分析放射性标记蛋白的等量cpm。(C类)功能性hIre1p限制hIRE1型mRNA。从转染pED、pED-的COS-1细胞中分离出总RNAhIRE1，或pED–hIRE1型K599A质粒，在存在（+）或不存在（−）环己酰亚胺的情况下处理。RNA样品（10μg）在甲醛-琼脂糖凝胶中溶解，印在尼龙膜上，并与32P标记hIRE1型cDNA探针。（箭头）hIRE1转录本。(D类)hIre1p具有内在激酶活性。从瞬时转染的COS-1细胞中免疫沉淀野生型或K599A突变体hIre1p。（模拟）未接收质粒DNA的细胞。蛋白质在[γ]存在下在激酶缓冲液中培养-32P] ATP在30°C下放置40分钟。通过SDS-PAGE将蛋白质分解并转移到硝化纤维素膜上。（顶部）合并[32P] 放射自显影法测定磷酸化为hIre1p；(底板)通过使用α-hIre1p抗体和碱性磷酸酶染色的酯酶印迹分析测定Ire1p蛋白水平。凝胶上装载的K599A突变hIre1p的数量是车道上装载的免疫沉淀蛋白数量的三分之一1和2因此，稳态K599A突变体hIre1p的量比野生型hIre1 p大约10倍。
图3
图3
hIre1p在瞬时转染的COS-1猴细胞中的过表达。(A类)转染COS-1细胞中hIre1p的表达。用或不用编码野生型hIre1p的表达质粒瞬时转染COS-1细胞（pED–hIRE1型)或其激酶缺陷突变体（pED–hIRE1型K599A）。将转染细胞脉冲标记为[35S] -蛋氨酸和半胱氨酸15分钟。制备细胞提取物，用α-hIre1p抗体免疫沉淀等量，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。(B类)共转染细胞中eIF-2α的表达。模拟转染COS-1细胞（lane1)或在pED存在的情况下与pED–eIF-2α共转染（车道2)，pED–hIRE1型（车道三)或pED–hIRE1型K599A（车道4). 细胞被脉冲标记为[35S] 蛋氨酸和半胱氨酸处理15分钟。制备细胞提取物，并通过SDS-PAGE和放射自显影术直接分析放射性标记蛋白的等量cpm。(C类)功能性hIre1p限制hIRE1型mRNA。从转染pED、pED-的COS-1细胞中分离出总RNAhIRE1，或pED–hIRE1型K599A质粒，并在环己酰亚胺存在（+）或不存在（−）的情况下处理。RNA样品（10μg）在甲醛-琼脂糖凝胶中溶解，印在尼龙膜上，并与32P标记hIRE1型cDNA探针。（箭头）hIRE1转录本。(D类)hIre1p具有内在激酶活性。从瞬时转染的COS-1细胞中免疫沉淀野生型或K599A突变体hIre1p。（模拟）未接收质粒DNA的细胞。蛋白质在[γ]存在下在激酶缓冲液中培养-32P] ATP在30°C下放置40分钟。通过SDS-PAGE将蛋白质分解并转移到硝化纤维素膜上。（顶部）合并[32P] 放射自显影法测定磷酸化为hIre1p；(底板)通过使用α-hIre1p抗体和碱性磷酸酶染色的酯酶印迹分析测定Ire1p蛋白水平。装载到凝胶上的K599A突变体hIre1p的量是装载泳道的免疫沉淀蛋白量的三分之一1和2因此，稳态K599A突变体hIre1p的量比野生型hIre1 p大约10倍。
图4
图4
hIre1p是一种位点特异性内核糖核酸酶。(A类)酵母的体外裂解HAC1类mRNA通过hIre1p。玻璃体内转录的32P标记HAC1类mRNA与大肠杆菌-表达的GST或GST–Ire1p吸附到谷胱甘肽珠上，或COS-1细胞表达的hIre1p或hIre1 p K599A蛋白吸附到蛋白A–Sepharose珠上。在指定的时间段后，通过5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析裂解产物。关于左边描述预测的解理产物。数字位于正确的指出基于酵母的RNA产物的预测碱基对大小HAC1类酵母Ire1p对mRNA的切割（Sidrauski和Walter，1997年）。(B类)hIre1p裂解酵母HAC1类残基G661处的mRNA。这个HAC1型RNA切割位点是通过在体外转录的HAC1类与GST、GST–Ire1p、hIre1p或hIre1 p K599A孵育后的mRNA答：。通过使用补充基因内含子的寡核苷酸引物，利用上标II逆转录酶（Bethesda研究实验室）对产物进行逆转录HAC1类RNA。排序上的梯子左边代表HAC1类用同一引物测定DNA序列。（箭头）底漆延伸产品的位置。
图4
图4
hIre1p是一种位点特异性内核糖核酸酶。(A类)酵母的体外裂解HAC1类mRNA通过hIre1p。玻璃体内转录的32P标记HAC1类mRNA与大肠杆菌-表达的GST或GST–Ire1p吸附到谷胱甘肽珠上，或COS-1细胞表达的hIre1p或hIre1 p K599A蛋白吸附到蛋白A–Sepharose珠上。在指定的时间段后，通过5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析裂解产物。关于左边描述预测的解理产物。数字位于正确的指出基于酵母的RNA产物的预测碱基对大小HAC1类酵母Ire1p对mRNA的切割（Sidrauski和Walter，1997年）。(B类)hIre1p裂解酵母HAC1类残基G661处的mRNA。这个HAC1类RNA切割位点是通过在体外转录的HAC1类与GST、GST–Ire1p、hIre1p或hIre1 p K599A孵育后的mRNA答：。通过使用补充基因内含子的寡核苷酸引物，利用上标II逆转录酶（Bethesda研究实验室）对产物进行逆转录HAC1类RNA。对上的阶梯进行排序左边代表HAC1类用同一引物测定DNA序列。（箭头）底漆延伸产品的位置。
图5
图5
hIre1p含有高甘露糖核心低聚糖。将过度表达hIre1p的转染COS-1细胞脉冲标记为[35S] 蛋氨酸和半胱氨酸存在15分钟（lane2)或不在（车道1)制备了衣霉素和细胞提取物。同时，在收获细胞提取物之前，将在不存在膜霉素的情况下脉冲标记15分钟的细胞在含有过量未标记甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中孵育3小时。这个35从细胞提取物中免疫沉淀标记的hIre1p，并通过SDS-PAGE进行分析。在SDS-PAGE之前，免疫沉淀的样品在不存在的情况下孵育（泳道1–3)或存在（车道4)内切糖苷酶H。
图6
图6
COS-1细胞表达hIre1p的共焦激光扫描荧光显微镜。用小鼠α-hIre1p免疫荧光法测定转染COS-1细胞中hIre1p的亚细胞定位。(A类)野生型转染COS-1细胞，或(B类)K599A突变体爱尔兰共和国1表达质粒用小鼠α-hIre1p和兔α-GRP94双重标记。(C类)野生型转染COS-1细胞爱尔兰共和国1表达质粒用小鼠α-hIre1p和豚鼠α-RanGAP1双重标记。使用的二级抗体是罗丹明结合的山羊α-兔子或罗丹明与山羊α-豚鼠（红色），同时存在荧光素结合山羊α-小鼠（绿色）。合并图像时，共定位显示为黄色。用生物共振共焦荧光显微镜观察细胞并进行数字拍照。棒材，25μm。
图6
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COS-1细胞表达hIre1p的共焦激光扫描荧光显微镜。用小鼠α-hIre1p免疫荧光法测定转染COS-1细胞中hIre1p的亚细胞定位。(A类)野生型转染COS-1细胞，或(B类)K599A突变体爱尔兰共和国1表达质粒用小鼠α-hIre1p和兔α-GRP94双重标记。(C类)野生型转染COS-1细胞爱尔兰共和国1表达质粒用小鼠α-hIre1p和豚鼠α-RanGAP1双重标记。使用的二级抗体是罗丹明结合的山羊α-兔子或罗丹明与山羊α-豚鼠（红色），同时存在荧光素结合山羊α-小鼠（绿色）。合并图像时，共定位显示为黄色。用生物共振共焦荧光显微镜观察细胞并进行数字拍照。棒材，25μm。
图6
图6
COS-1细胞表达hIre1p的共焦激光扫描荧光显微镜。用小鼠α-hIre1p通过免疫荧光测定hIre1p在转染的COS-1细胞中的亚细胞定位。(A类)野生型转染COS-1细胞，或(B类)K599A突变体爱尔兰共和国1表达质粒用小鼠α-hIre1p和兔α-GRP94双重标记。(C类)野生型转染COS-1细胞爱尔兰共和国1表达质粒用小鼠α-hIre1p和豚鼠α-RanGAP1双重标记。使用的二级抗体是罗丹明结合的山羊α-兔子或罗丹明与山羊α-豚鼠（红色），同时存在荧光素结合山羊α-小鼠（绿色）。合并图像时，共定位显示为黄色。用Bio-Rad共焦荧光显微镜观察细胞并进行数字拍照。棒材，25μm。
图7
图7
哺乳动物细胞中hIre1p依赖性UPR诱导。在大鼠BiP启动子、RSV–β-gal和pED–hIRE1型或pED–hIRE1型K599A质粒DNA。转染后60小时，用10μg/ml衣霉素处理细胞6小时。荧光素酶活性由三次独立转染实验测定，并归一化为β-半乳糖苷酶活性以校正转染效率。
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