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.1998年7月；72(7):5707-16.
doi:10.128/JVI.72.7.5707-5716.1998。

帮助依赖性感染颗粒形成和传代所需的呼吸道合胞病毒蛋白的鉴定

M N Teng先生 1, P L柯林斯
附属公司

帮助依赖性感染颗粒形成和传代所需的呼吸道合胞病毒蛋白的鉴定

M N Teng先生等。 J维罗尔. 1998年7月.

摘要

我们开发了一个系统，通过用cDNA编码的成分重建这些事件来识别人类呼吸道合胞病毒（RSV）包装和传代所需的病毒蛋白。编码单个RSV蛋白的质粒，每个都在T7启动子的控制下，与含有小基因组的质粒以各种组合共同转染到感染了表达T7 RNA聚合酶的痘苗病毒重组体的细胞中。将这些细胞的上清液传到新鲜细胞上，然后用RSV进行重叠感染。通过微基因组携带的报告基因的表达检测RSV特异性包装和传代的功能重建。正如预期的那样，四种核衣壳蛋白N、P、L和M2-1未能直接包装和传递小基因组。通过进一步添加表达三种膜相关蛋白（M、G和F）的质粒实现传代；第四个包膜相关蛋白SH的加入并没有改变传代效率。由于省略G，传代减少了10到20倍，而由于省略M或F，传代被取消。非结构NS1或NS2蛋白的共表达对包装和传代几乎没有影响，除了在最初的转染中通过间接影响RNA合成。M2-1转录延伸因子不需要用于产生通畅颗粒。然而，在转染过程中添加越来越多的M2-1介导了一种剂量依赖性的传代抑制，这种抑制通过共同表达假定的负调控因子M2-2而缓解。L质粒的缺失使传代次数减少了10到20倍，很可能是由于封装的小基因组用于包装的可用性降低。然而，传代的剩余水平表明，颗粒的产生和传代既不需要L蛋白，也不需要RSV特异性RNA的合成过程。在转染过程中省略N或P，使传代无效。因此，包装和传递小基因组的RSV蛋白最低要求是N、P、M和F，尽管添加L和G可以大大提高效率。

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数字

图1
图1
重组质粒编码的小基因组RNA和蛋白质的包装和传代。编码RSV蛋白和微基因组类似物（如图所示）的质粒，均在T7启动子的控制下，被共同转染到HEp-2细胞中，这些细胞同时感染表达T7 RNA聚合酶（MVA-T7）的痘苗病毒（MOI，～3）。小基因组类似物包含一个报告基因（编码荧光素酶[C2L]或GFP[C41-GFP]），其表达受RSV转录信号控制。在转染后72小时，收集培养上清液（sup）并将其传代到新鲜细胞上，这些细胞随后感染RSV（MOI，～3）。通过荧光素酶分析或荧光显微镜（分别在传代后24小时或48小时）评估小基因组的传代和表达。
图2
图2
荧光素酶活性检测小基因组的传递。如图1所示，用编码N、P、M2-1和L蛋白的质粒、小基因组（C2L）和编码所示额外结构蛋白的质粒（0.1μg/孔）转染HEp-2细胞。对传代细胞提取物进行荧光素酶分析。条形代表2个实验的平均值，并归一化为仅转染了微基因组和N、P、M2-1和L蛋白的样本的传递。
图3
图3
转染中F、M和G质粒滴定对传代效率的影响。如图2所示，用N、P、M2-1、L和C2L质粒转染HEp-2细胞。（a） 转染上清液传代后荧光素酶活性，在恒定数量的F质粒存在下，M质粒数量增加。（b） 在保持M和F恒定的同时增加G质粒的效果。（c和d）不断增加的F质粒与恒定量的M（c）或M和G（d）共同转染。条形图表示两个样品的平均值，在每组中标准化为每孔转染含有0.1μg M和F质粒的样品的传代（条形图3、7和15）或每孔含有0.1μgM和g质粒的样品（条形图19）。注意带G（b和d）或不带G（a和c）的样品的刻度差异。面板a至c来自单个实验；面板d显示了独立实验的结果。
图4
图4
通过荧光显微镜检测表达GFP的小基因组的传代。HEp-2细胞转染如图2所示，但C41-GFP作为小基因组。N、 在转染过程中，P、M2-1和L质粒单独（顶部面板）或与F、M和G质粒（中间面板）或F、M、G和SH质粒（底部面板）共同表达。在转染后3天（左侧面板）或传代后2天（右侧面板）拍摄显微照片（放大倍数×34）。中间和左下角显示的是F和G共表达导致的合胞体。
图5
图5
M2-1对通道的影响。用N、P、L、F、M、G和小基因组C2L质粒以及M2-1（a和b）或M2（1+2）（c和d）质粒转染HEp-2细胞。如图2所示，测量转染后72 h（a和c）或传代后24 h（b和d）的荧光素酶活性。条形图表示两个样本的平均值，在每组中标准化为不含额外M2质粒的转染所得样本（条形图3）。
图6
图6
M2-2对通道的影响。如图所示，在没有（a和b）或存在（c和d）M2-1质粒（200 ng/well）的情况下，用N、P、L、F、M、G和小基因组C2L质粒以及增加数量的M2-2质粒转染HEp-2细胞。如图2所示，测量转染后72 h（a和c）或传代后24 h（b和d）的荧光素酶活性。条形图表示两个样品的平均值，标准化为不含M2-2质粒的转染样品（条形图2和11）。由于M2-1的存在，c组的荧光素酶活性（以光单位测量）大约是a组的100倍；b组和d组的荧光素酶表达具有可比性。
图7
图7
M2-2的共表达克服了M2-1对传代的抑制。如图所示，用N、P、L、F、M、G和小基因组C2L质粒转染HEp-2细胞，并在额外的M2-2质粒（20 ng/well）存在下增加M2-1质粒的数量。如图2所示，测量转染后72小时（a）或传代后24小时（b）的萤光素酶活性。条形图表示两个样品的平均值，标准化为不含M2质粒的转染样品（条形图1）。
图8
图8
NS1和NS2对传代的影响。用N、P、M2-1、L、F、M、G和小基因组C2L质粒以及指定数量的NS1（bars 4至8）或NS2（bars 9至13）质粒转染HEp-2细胞。如图2所示，在转染（a）后72 h或传代（b）后24 h测量荧光素酶活性。条形图表示两个样本的平均值，标准化为不含NS1或NS2的转染对照（条形图3）。
图9
图9
L对通道的影响。如图2所述，用N、P、F、M、G和小基因组C2L质粒（条2至15）转染HEp-2细胞。2。将编码L（bar3）、NS1（bars 4至6）、NS2（bars 7至9）、M2-1（bars 10至12）或M2-2（bars 13至15）蛋白的质粒按指示量添加到转染混合物中。阴性对照缺乏G、F和M质粒（bar 1）。测定传代后24小时的荧光素酶活性。条形图表示两个样本的平均值，这两个样本归一化为不含额外质粒的转染上清液的通过（条形图2）。
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    1. Bukreyev A、Whitehead S S、Murphy B R、Collins P L。从中删除了整个SH基因的重组呼吸道合胞病毒在细胞培养中高效生长，并在小鼠呼吸道中表现出特定部位的衰减。《维罗尔杂志》。1997;71:8973–8982.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Collins P L、Hill M G、Cristina J、Grosfeld H。呼吸道合胞病毒（一种非片段化负链RNA病毒）的转录延伸因子。美国国家科学院院刊，1996年；93:81–85.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Collins P L，McIntosh K，Chanock R M.呼吸道合胞病毒。收录：Fields B N、Knipe D M、Howley P M、Chanock R M、Melnick J L、Monath T P、Roizman B、Straus S E编辑。菲尔德病毒学。第3版，第2卷。宾夕法尼亚州费城：Lippincott-Raven；1996年，第1313-1352页。
    1. Conzelmann K K，Schnell M.通过质粒编码蛋白拯救狂犬病病毒的合成基因组RNA类似物。《维罗尔杂志》。1994;68:713–719.-项目管理咨询公司-公共医学

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