跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.1998年6月1日；18(11):4271-84.
doi:10.1523/JNEUROSCI.18-11-04271.1998。

帕金森病大鼠纹状体内重组腺相关病毒介导人酪氨酸羟化酶和人GTP-环水解酶I基因转移的特征

R J曼德尔 1, K G伦达尔, S K斯普拉特, R O斯奈德, L K科恩, S E Leff公司
附属公司

帕金森病大鼠纹状体内重组腺相关病毒介导人酪氨酸羟化酶和人GTP-环水解酶I基因转移的特征

R J曼德尔等。 神经科学. .

摘要

为了通过基因置换在纹状体中实现局部、连续的左旋多巴递送，作为帕金森病基因治疗的模型，本研究使用了含有编码人类酪氨酸羟化酶（hTH）cDNA的高滴度纯化重组腺相关病毒（rAAV）或人类GTP-环水解酶I[GTPCHI，四氢生物蝶呤（BH4）合成的速率限制酶]或两者都感染6-OHDA失神经大鼠纹状体。rAAV转导3周后观察到纹状体TH和GTPCHI染色，组织几乎没有检测到扰动。纹状体内rAAV转导6个月后，出现TH染色，但与3周存活时间相比明显减少。在另一组动物中，rAAV转导后1年，纹状体TH染色得到证实。使用神经元标记NeuN进行的双重染色研究表明，表达hTH的rAAV转导细胞中90%以上是神经元。微透析实验表明，只有那些接受MD-TH和MD-GTPCHI载体混合物的病变动物在体内显示出BH4独立的L-DOPA产生（平均约4-7ng/ml）。仅接受hTH rAAV载体的大鼠仅在接受外源性BH4后产生可测量的L-DOPA（平均约1-4 ng/ml）。L-芳香氨基酸脱羧酶被阻断，但不是100 mM KCl诱导的去极化，L-DOPA溢出增强，非hTH组动物（GTPCHI和碱性磷酸酶）产生的L-DOPA最小。尽管在接受hTH和hGTPCHI rAAV混合载体的动物中观察到L-DOPA升高，但纹状体内注射载体3周后，无吗啡肽诱导的旋转行为没有减少。这些数据表明，纯化的rAAV是一种安全的非致病性病毒载体，可在神经元中调节纹状体hTH转基因的长期表达，并可用于成功地将左旋多巴传递到纹状体。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
rAAV感染3周后进行TH免疫细胞化学染色。低放大倍数A类和C类显示相对于整个纹状体大小的感染扩散。相对于右半球，左半球的TH染色明显，因为动物受到单侧6-OHDA损伤，以耗尽右半球的背景TH。B类和D类包含中存在的场的高倍放大A类和C类.放大面积B类和D类由箭头在里面A类和C类由于注射针在手术过程中拔出了3 mm，因此在所有示例中，转基因表达区域的背腹范围为3–4 mm。真实航向+划定感染区域的细胞的内侧-外侧范围约为0.7毫米，前后扩散1.2毫米。A类和B类和C类和D类包含感染后3周，分别用1μl rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–h TH和r AAV–MD–hGTPCHI 1:1混合物感染TH缺失半球后的新纹状体视图。在B类在该区域的下部存在少量含铁血黄素，表明注射的精确区域显示该区域的组织几乎没有破坏。尽管在这些动物中只注射了一半的rAAV–MD–hTH载体（0.5μl），但TH染色的强度仍与未稀释的载体注射相当(A类和B类)（另请参见图4）。比例尺：A、 C类，2毫米；B、 D类, 100 μ米.
图2。
图2。
注射3周后1μl PBS和rAAV–MD–hGTPCHI感染的纹状体TH免疫细胞化学染色(A–D)注射后3周对rAAV–hGTPCHI感染的纹状体进行GTPCH染色(E、 F类).A类图为一只动物的冠状脑切片的TH染色低倍视图，该动物在6-OHDA敏感纹状体中注射了1μl PBS。注射部位在背侧纹状体中清晰可见。B类显示PBS注射部位放大倍数较高，注射3周后仍含有残余含铁血黄素。C类包含3周前接受1μl rAAV–MD–hGTPCHI注射的动物纹状体的低倍TH染色。D类显示了同一区域的高倍放大。电子和F类显示组织学处理前3周接受rAAV–MD–hGTPCHI的动物的hGTPCH免疫细胞化学染色的低倍和高倍放大。GTPCHI抗体是针对人类蛋白而产生的，并且不会与完整半球中存在的大鼠GTPCHI发生交叉反应。图中显示的放大面积B、 D类、和F类由箭头在里面A类,C类、和电子.比例尺：A、 C、F，2毫米；B、 D、E, 100 μ米.
图3。
图3。
载体注射6个月后，rAAV感染纹状体的TH染色。图中所示的布局与图1相同，其中正确的面板上rAAV感染区域内的场放大倍数更高左边图中所示的组织学来自于在图1所示的相同手术中准备的动物。A类和C类包含单侧6-OHDA致敏大鼠在每只受损动物中注射1μl rAAV 6个月后冠状切片的低倍显微照片。低倍放大显示感染区域的范围。图中显示的放大区域B类和D类由箭头在里面A类和C类.A类和B类包含来自感染rAAV–MD–hTH的动物代表性样本的图片（对比图1，A类和B类).C类和D类包含接受rAAV–MD–hGTPCHI和rAAV-MD–h TH 1:1混合物的动物示例。比例尺：A、 C类，2毫米；B、 D类, 100 μ米.
图4。
图4。
纹状体TH+3周和6个月前感染rAAV–MD–hTH的动物的细胞计数。平均Abercrombie校正TH+用rAAV–MD–TH转导后3周处理的动物细胞计数（+SEM）表示为黑色条，rAAV转基因动物存活6个月的平均校正细胞数表示为露天酒吧. The星号表明TH数量显著减少+6个月时的细胞(第页= 0.05).
图5。
图5。
载体注射后1年，rAAV–MD–hTH感染纹状体的TH染色。此图的排列与图1和图3相同，其中正确的包含面板的rAAV感染区域内的场的更高放大倍数左边.放大面积B类由指示箭头在里面A类图中显示的组织学来自一组单独的部分6-OHDA致敏大鼠，这些大鼠在1年前接受了rAAV–MD–hTH。在这些动物中观察到的转基因表达水平无法与图1和图3中所示的水平直接比较，因为此处所示的动物没有接受相同的手术。比例尺：A类，2毫米；B类, 100 μ米.
图6。
图6。
rAAV介导的hTH表达的神经元特异性。A类包含从处理前3周接受rAAV–MD–hTH的动物身上采集的NeuN–TH双染色的两个相邻区域的蒙太奇。晕倒的人黄色的染色是ELF标记的神经元NeuN染色，颜色越深灰绿色染色(箭头)对应于TH+细胞。在这些字段中，所有TH+细胞用NeuN标记进行双重染色。B类显示了GFAP–TH双染色部分的两个相邻区域的蒙太奇的代表性部分。GFAP染色是黄色的纤维染色和TH染色细胞(箭头)颜色更深吗灰绿色.无TH+在这个例子中，细胞是双重染色的。
图7。
图7。
rAAV注射对脱吗啡诱导的旋转行为的影响。这些组沿着其接收到的rAAV构造的纵坐标进行识别。这个阴影条表示纹状体内载体注射（+SEM）前获得的数据，以及实心钢筋代表纹状体内载体感染3周后脱吗啡诱导的对侧旋转水平。注射rAAV前后两组间无显著差异（统计数据见结果）。每个小节代表12个观测值的平均值。
图8。
图8。
我-在存在或不存在外源性BH的情况下，rAAV注射3周后DOPA的产生和DOPAC水平4纹状体内微透析测定。图图例中显示了代表每个rAAV注射组的符号及其相应的“n”号A类和B类. The矩形在中的图形下A类和B类表示200μ的输液持续时间米伯克希尔哈撒韦4在探针中。A类表示平均值我-从每个rAAV组采集的15分钟微透析液中测量DOPA水平（+SEM）。数据表示为纳克/毫克，如横坐标所示（用于比较：1 ng/ml=5.1μ米). 这个封闭支架（]）后跟单个星号表明整个曲线与rAAV–MD–hAP和rAAV-MD–h GTPCHI这两个对照组显著不同。这个封闭支架（]）然后是双星号表明整个曲线与所有其他组显著不同。B类包含DA代谢物DOPAC（+SEM）的平均水平，从中报告的相同透析液样品中测量A类.双星号表明所有其他组的统计显著性，而单个星号表明与rAAV–MD–hAP和rAAV-MD–h GTPCHI这两个对照组之间存在显著差异。
图9。
图9。
我-在存在或不存在外源性BH的情况下，rAAV注射3周后DOPA的产生和DOPAC水平4纹状体内微透析测量：KCl输注对去极化的影响。代表每个rAAV注入组的符号及其相应的“n”编号如图图例所示A类和B类. The矩形在中的图形下A类和B类表示200μ的输液持续时间米伯克希尔哈撒韦4在探针中。这个箭头指示15分钟样品，其中100米米在两种透析液中均添加KClA类和B类。本实验使用与图8中所用动物相同的动物，并在实验后24小时进行。A类表示平均值我-从每个rAAV组取样的15分钟微透析液中测量的DOPA水平（+SEM）。添加BH之前4，只有接受1:1 rAAV–MD–hTH和rAAV–MD–hGTPCHI混合物三元体内注射的组显示出显著的我-多巴。然而，与图8所示的数据相反，接受纹状体内rAAV–MD–hTH的两只动物确实表现出持续低水平的我-BH之前的DOPA4输液（1-2纳克/毫升）。双星号表明所有其他组的统计显著性，而单个星号表明与rAAV–MD–hAP和rAAV-MD–h GTPCHI这两个对照组之间存在显著差异。
图10。
图10。
我-从rAAV感染纹状体的穿孔处测得的DOPA水平和免疫印迹显示抗TH免疫反应。顶部，我-DOPA水平。停止采样后，立即向透析实验中使用的动物（图9、10）注射NSD-1015（50 mg/kg，i.p.）。90分钟至2小时后，从取出微透析探针后留下的尿道区域取出纹状体穿孔。这个单个星号表示我-从rAAV–MD–hTH组的打孔测量DOPA水平(n个=6）显著高于rAAV–MD–hGTPCHI组的测量值(n个=4）或rAAV–MD–hAP组(n个= 7;F类(1,20)= 5.2;第页= 0.03). 这个双星号表示接受1:1 rAAV–MD–hTH和rAAV-MD–hGTPCHI混合物的组(n个=6）纹状体显著增高我-DOPA含量高于其他组(F类(1,20)= 20.3;第页< 0.001).底部，rAAV感染纹状体穿孔匀浆的免疫印迹显示抗TH免疫反应。车道1(标准)显示了来自未受损大鼠纹状体的0.1μg蛋白质与来自用逆转录病毒载体MFG–hTH2转导的1000只大鼠成纤维细胞的蛋白质混合（Leff等人，1998年）。内源性大鼠基因（rTH）和转导的人类cDNA（hTH）表达的蛋白质因在rTH中未发现的hTH2变异体中发现的四氨基酸插入而按大小区分。从感染AAV载体的受损纹状体的穿孔匀浆中提取的蛋白质（5μg）在车道上流动2通过7rTH的相对带强度显示6-OHDA损伤后残留的rTH。车道中存在相对丰富的hTH波段4–7，包括AAV–MD–hTH载体的感染。非特异性高分子量条带是由与二级抗体的交叉反应引起的，因为当不使用一级抗TH抗体时，这些条带也存在。分子量标记显示在正确的污点的侧面。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Abercrombie M.从切片机切片中估算核人口。Anat记录。1946;94:239–247.-公共医学
    1. Anastasiadis PZ、Kuhn DM、Levine RA。四氢生物蝶呤进入大鼠脑突触体、培养的PC12细胞和大鼠纹状体。《大脑研究》1994；665:77–84.-公共医学
    1. Asin KE、Bednarz L、Nikkel A、Perner R.使用选择性多巴胺受体激动剂和左旋多巴每天重复治疗后的旋转和纹状体c-fos表达。药理学实验学杂志。1995;273:1483–1490.-公共医学
    1. Barker R，Dunnett SB。纹状体的伊泊金酸损伤可减少6-羟多巴胺致敏大鼠药物诱导的旋转。实验脑研究1994；101:365–374.-公共医学
    1. Bencsics C、Wachtel SR、Milstien S、Hatakeyama K、Becker JB、Kang UJ。GTP环水解酶I和酪氨酸羟化酶的双重转导对于初级成纤维细胞自发合成l-DOPA是必要的。神经科学杂志。1996;16:4449–4456.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语