Occludin-deficient embryonic stem cells can differentiate into polarized epithelial cells bearing tight junctions

doi:10.1083/jcb.141.2.397

.1998年4月20日；141(2):397-408.

doi:10.1083/jcb.141.2.397。

封闭性缺陷的胚胎干细胞可以分化为具有紧密连接的极化上皮细胞

M赛图¹, K藤本, Y Doi公司, 伊藤, T藤本, M Furuse公司, H Takano公司, T野田佳彦, S筑田

附属公司

PMID： 9548718
预防性维修识别码：项目经理2148457
内政部： 10.1083/jcb.141.2.397

封闭性缺陷的胚胎干细胞可以分化为具有紧密连接的极化上皮细胞

M赛图等。 J细胞生物学. 1998.

.1998年4月20日；141(2):397-408.

doi:10.1083/jcb.141.2.397。

作者

M赛图¹, K藤本, Y Doi公司, 伊藤, T藤本, M Furuse公司, H Takano公司, T野田佳彦, S筑田

附属

¹京都大学医学院细胞生物学系，日本京都606，坂谷。

PMID： 9548718
预防性维修识别码：项目经理2148457
内政部： 10.1083/jcb.141.2.397

摘要

Occludin是唯一已知的紧密连接（TJs）的完整膜蛋白，目前被认为直接参与TJs的屏障和栅栏功能。闭塞素缺乏胚胎干细胞（ES）是通过靶向性破坏闭塞素基因的两个等位基因而产生的。当这些细胞进行悬浮培养时，它们聚集形成简单的囊性胚状体（EB），然后形成囊性胚状体，其时间过程与野生型ES细胞形成EB的时间过程相同。免疫荧光显微镜和超薄切片电子显微镜显示，极化上皮（内脏内胚层样）细胞不仅从野生型分化为EB，而且从occludin缺陷的ES细胞分化为EB。冷冻断裂分析表明野生型和闭塞型上皮细胞之间TJ链的数量或形态没有显著差异。此外，闭塞小带（ZO）-1，一种TJ相关的外周膜蛋白，在闭塞缺乏的上皮细胞中仍仅集中于TJ。与这些形态学观察结果一致的是，闭塞缺乏上皮细胞中的TJ是低分子示踪剂通过细胞旁途径扩散的主要屏障。这些发现表明，目前还存在未知的TJ整合膜蛋白，它可以形成链结构，招募ZO-1，并作为无闭塞素的屏障发挥作用。

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数字

图1
靶向灭活ES细胞中的闭塞素基因。(A类)野生型等位基因、靶向载体和闭塞素基因靶向等位基因的限制性图谱。第一个ATG密码子位于外显子2；外显子3编码NH₂-闭塞素分子的末端一半从第一跨膜结构域到第二细胞外环。外显子4编码第四跨膜结构域和COOH末端细胞质结构域的起始部分，表明存在一个或多个下游外显子。靶向载体包含SA IRES/LacZ/loxP/*前列腺素激酶*neo/loxP盒位于其中部，以删除目标等位基因中的外显子3。Southern印迹的5′、3′和neo探针的位置以条形表示。loxP序列侧翼*前列腺素激酶*neo用闭合三角形表示。*P、，*PstI；*X（X）*，XbaI；N个，NcoI；电子，EcoRV。(B类)闭塞素单敲除ES细胞系的产生。用3′探针对XbaI消化的闭塞素位点进行Southern blotting分析(三′探查)从野生型等位基因（克隆*464*)目标等位基因的4.6kb条带（克隆*380*). 用5′探针对PstI/EcoRV消化物进行Southern印迹，证实了载体的正确整合(5′探查). 15.5kb和5.4kb条带分别来自野生型和靶向等位基因。此外，通过与新探针杂交检查目标克隆的单一整合(*新探测器*). (C类)闭塞素双敲除ES细胞系的建立。两个独立的双淘汰克隆（克隆23和39)在存在升高浓度的G418的情况下从单敲除克隆380获得。双敲除细胞失去了正常的9.2-kb带，表明完全敲除。理论上，这些细胞中可能表达缺失的闭塞素COOH末端片段（由外显子4、5-编码），但这些片段（如果有）不被视为TJ链的结构或功能成分。

图2
胚体形成和闭塞素表达。(A类)ES细胞的外观(一和电子)，简单类胚体（EB）(b条和*（f）*)和囊性EB(*c（c）*,d日,克、和小时)纯合野生型(*a–d*)或目标(*e–h*)闭塞素基因。野生型和闭塞素双敲除ES细胞/EB之间不仅在形态上没有差异，而且在EB形成的时间过程中也没有差异。无论闭塞蛋白基因型如何，ES细胞都生长在形态未分化的饲养细胞上(一和电子). 简单(b条和*（f）*)和囊性EB(*c（c）*和克)分别在4天和10天悬浮培养中形成。简单EB以Reichert膜为特征(箭头)表明内脏最外层内皮样细胞层分化。囊性EB被内部分泌的液体完全扩张(*c（c）*和克)甲苯胺蓝染色的半薄切片图像也显示了这一点(d日和小时). (B类)RT-PCR检测闭塞素双敲除ES细胞/EB中闭塞素mRNA的丢失。野生型ES细胞中检测到微量的闭塞素mRNA(锿)随着ES细胞分化为简单EB，数量似乎增加(*SEB公司*)然后变成囊性EB(*行政首长协调会*). 相反，在闭塞素双敲除ES细胞（克隆23和39)简单和囊性EB。作为对照，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因在所有样本中均扩增。(C类)抗闭塞素pAb免疫印迹分析。与RT-PCR数据一致，在野生型EB发育过程中，闭塞素的蛋白表达水平升高，而在闭塞素双敲除ES细胞/EB中未检测到闭塞素表达。条形图：(一,b条,电子、和*（f）*)100微米；(*c（c）*和克)500微米；(d日和小时)200微米。

图3
野生型和闭塞素缺乏型单纯EB中闭塞素和ZO-1的免疫荧光共聚焦显微镜定位(*a–f*)/囊性EB(*g–l*). 用大鼠抗occludin mAb对EB的冷冻切片进行双重染色(一,d日,克、和j个)和小鼠抗ZO-1单克隆抗体(b条,电子,小时、和k个). 在这两种野生型简单(*a–c*)和囊性(*g–i类*)EBs、clodin在最外层细胞中特异性表达，并可能与ZO-1在结合区精确共定位。相比之下，单纯闭塞不足(*d–f日*)和囊性(*j–l*)EB、闭塞素从最外层细胞层消失(d日和j个)闭塞素表达的缺失似乎不会影响ZO-1的分布(电子和k个). 棒材，10μm。

图6
ZO-1在闭塞缺陷上皮细胞中的亚细胞分布。(A类)免疫荧光共聚焦显微镜。野生型冷冻切片(*a–f*)和闭塞不足(*g–i类*)用大鼠抗闭塞素单克隆抗体混合物对囊性EB进行双重标记(一)和小鼠抗ZO-1单克隆抗体(b条)或大鼠抗E-钙粘蛋白单克隆抗体的混合物(d日和克)和小鼠抗ZO-1单克隆抗体(电子和小时). 在野生型EB中，E-钙粘蛋白沿侧膜和连接区分布(d日)，而闭塞素(一)和ZO-1(b条和电子)高度集中在交界区。密切比较显示，在接合区域，ZO-1与闭塞蛋白精确地共定位(*c（c）*)，但比E-cadherin位于更顶端(*（f）*). E-cadherin之间的相同空间关系(克)和ZO-1(小时)维持在闭塞不足的EB中(我). (B类)免疫电子显微镜。用小鼠抗ZO-1单克隆抗体标记闭塞性缺失囊性EB的超薄冰冻切片。TJ被专门贴上标签。条形图：(A类)10微米；(B类)200纳米。

图4
野生型最外层细胞的超薄切片电子显微镜图像(一,*c（c）*、和电子)和闭塞性EB不足(b条,d日、和*（f）*). 野生型和闭塞型单纯EB(一和b条)，上皮细胞层与微绒毛相关的顶端膜域分化。此外，在野生型和闭塞性缺陷的囊性EB中(*c–f*)上皮细胞进一步极化，微绒毛众多(箭头)和分泌颗粒(星号). 在这些上皮细胞外侧膜的最顶端区域，发育良好的紧密连接(*TJ公司*)很容易识别为野生型(电子)以及闭塞不足的EB(*（f）*).DS公司，桥粒。条形图：(一和b条)2微米；(*c（c）*和d日)7微米；(电子和*（f）*)200纳米。

图5
野生型最外层上皮细胞紧密连接的冷冻骨折图像(一,*c（c）*,电子,*（f）*、和我)和闭塞性囊性EB(b条,d日,克,小时、和j个). 在野生型和闭塞型EB中，均检测到发育良好的连续和网状TJ链。尽管TJ链的数量因细胞而异，也因EB而异，但无论闭塞素的表达如何，TJ链都分布在相似的范围内；在野生型和闭塞型EB中，其范围为一到*c（c）*和来自b条到d日分别是。P面TJ绞线(电子和克)和互补的E面TJ凹槽(*（f）*和小时)在野生型EB和闭塞型EB之间的形态也无法区分。通过免疫复制电子显微镜，野生型EB的TJ链(我)被抗闭塞素单克隆抗体严重标记，而来自闭塞素缺乏EB的单克隆抗体(j个)未标记。条形图：(*a–d*)200纳米；(*e–h*)50纳米；(*i–j*)100纳米。

图7
野生型和闭塞型上皮细胞紧密连接通透性测定。野生型之后(一和b条)或闭塞不足(电子和*（f）*)囊性EB与NHS-LC-生物素孵育30分钟，冰冻切片与XRITC-抗坏血酸孵育以定位表面结合的生物素(一和电子). 为了可视化每个上皮细胞的轮廓，冰冻切片用荧光素-球蛋白复染(b条,d日、和*（f）*). 无论闭塞素表达如何，只有最外层上皮细胞层的顶面被生物素化，表明NHS-LC-生物素无细胞旁渗漏。相反，当野生型EB在10 mM EGTA存在下与NHS-LC-生物素孵育以影响细胞间连接时，基底外侧膜和上皮细胞的顶膜同样被生物素化(*c（c）*). 棒材，10μm。

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