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比较研究
。1998年4月6日；141(1):199-208.
doi:10.1083/jcb.141.1.199。

ZO-3，一种在紧密连接处发现的MAGUK蛋白家族的新成员，与ZO-1和occludin相互作用

J哈斯金斯 1, L Gu公司, E S威琴, J希伯德, B R史蒂文森
附属公司
比较研究

ZO-3是发现于紧密连接处的MAGUK蛋白家族的一个新成员，与ZO-1和闭塞蛋白相互作用

J哈斯金斯等。 J细胞生物学。 。

摘要

从Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞中批量纯化一种与紧密连接蛋白ZO-1共免疫沉淀的130-kD蛋白，并进行部分内肽酶消化和氨基酸序列测定。得到的19个氨基酸序列为筛选犬cDNA文库奠定了基础。五个重叠克隆包含一个2694 bp的开放阅读框，编码898个氨基酸的蛋白质，预测分子量为98414道尔顿。序列分析表明，该蛋白包含三个PSD-95/SAP90、discs-large、ZO-1（PDZ）结构域、一个src同源（SH3）结构域和一个类似鸟苷酸激酶的区域，使其与果蝇圆盘大肿瘤抑制基因产物ZO-1、ZO-2以及MAGUK蛋白家族的其他成员同源。与ZO-1和ZO-2一样，该新蛋白包含一个COOH末端酸性结构域和一个位于第一和第二PDZ结构域之间的碱性区域。与ZO-1和ZO-2不同，该蛋白在PDZ2和PDZ3之间显示出富含脯氨酸的区域，并且明显不包含选择性剪接结构域。用表位标记结构稳定转染的MDCK细胞以约130 kD的表观分子量表达外源性多肽。此外，该蛋白通过免疫荧光和免疫电子显微镜在紧密连接处与ZO-1共定位。体外亲和力分析表明，重组130-kD蛋白直接与ZO-1和闭塞素的细胞质域相互作用，而与ZO-2不相互作用。我们建议将该蛋白命名为ZO-3。

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数字

图4
图4
ZO-3和ZO-2的Northern印迹。5μg MDCK细胞聚（A）+针对ZO-3的RNA探针显示了一个～3.4-kb的转录本。ZO-2的印迹剥离和重制显示预期的5.2-kb转录本（21）。右侧的RNA标准（kb）。
图2
图2
全长ZO-3 cDNA的示意图。(一)带有EcoRI的3072-bp cDNA(E类)和XhoI(X（X）)5′端和3′端的限制性位点。(实线)未翻译区域。框中显示的开放阅读框，带有XcmI、EagI、PstI（A1 cDNA特有）和内部XhoI限制位点。(b条)从文库筛选中获得的单个克隆。对所有部分cDNA进行双链测序。(c（c）)1 kb段中的比例尺。
图3
图3
ZO-3的全长核苷酸和氨基酸序列。ZO-3包含3个PDZ域(细下划线)，SH3域(粗下划线)和GUK结构域（框），证明它是MAGUK蛋白质家族的另一个成员。ZO-3还包含PDZ1和PDZ2之间的基本结构域、PDZ2和PDZ3之间的富含脯氨酸的结构域和酸性结构域(虚线下划线). GUK框内的双下划线表示通过氨基酸测序获得的原始肽。ZO-3序列可从GenBank数据库获得，登录号为AF023617。
图9
图9
重组ZO-3与紧密连接蛋白的结合。(一)ZO-3结合MDCK细胞提取物中的ZO-1和ZO-2。含有全长ZO-3（车道）的亲和树脂1)或阴性对照肽（lanes2)与MDCK细胞膜的高盐提取物孵育，清洗、溶解并免疫印迹ZO-1(左边)或ZO-2(正确的). 含有ZO-3的树脂特别保留了ZO-1和ZO-2。(b条)ZO-3直接与ZO-1结合。体外转录/翻译产生的放射性标记ZO-1（泳道1)用含有全长ZO-3（lane）的亲和树脂培养2)或阴性对照肽（lane三). 将树脂洗涤、溶解并进行SDS-PAGE。含有ZO-3的树脂特别保留了215 kD的带。该条带通过免疫印迹法确认为ZO-1，方法是在lane中对相同的一份结合材料进行免疫印迹2含抗人ZO-1抗血清（lane4). 车道1–3，放射自显影；车道4、ECL。(c（c）)抗ZO-3抗血清的部分特征。针对部分ZO-3产生的豚鼠抗血清与整个MDCK细胞裂解液（lane）中存在的130kD带反应1). 它还显示出与ZO-1结合的带的微弱反应性(箭头). 免疫前血清（lane）未检测到与MDCK细胞蛋白的反应2). (d日)ZO-3直接与闭塞素的细胞质尾部结合。重组ZO-3与亲和树脂孵育，亲和树脂含有闭塞素（lane）的COOH末端148 aa1)或阴性对照肽（lane2). 结合物从洗涤树脂中洗脱，并用抗ZO-3抗血清进行免疫印迹。含有闭塞素的树脂特别保留ZO-3。(e（电子）)ZO-3未绑定到ZO-2。重组ZO-2（车道1)用含有ZO-3（lane）的亲和树脂培养2)或阴性对照肽（lane三). 结合物从洗涤树脂中洗脱，并用抗ZO-2抗血清进行免疫印迹。在两种情况下均未检测到绑定。从含有ZO-3（车道）的树脂中收集的未结合部分4)或阴性对照肽（lane5)用抗ZO-2抗血清进行免疫印迹。车道树脂上ZO-3的存在2通过剥离印迹并用抗ZO-3抗血清（lane6).
图1
图1
在保持蛋白质-蛋白质相互作用的条件下，从代谢标记的MDCK细胞提取物中用抗ZO-1单克隆抗体（+）或非特异性但相同的亚类单克隆抗体进行免疫沉淀，结果表明ZO-2（160 kD）和ZO-3（130 kD）与ZO-1（215 kD）特异性共沉淀。右侧分子质量标记（kD）。
图5
图5
犬ZO-3、人ZO-1（44）、犬ZO-2（7）、，果蝇属TamA（41）和dlg-A（46），采用GCG PILEUP建造。GUK结构域还与酵母鸟苷酸激酶序列（8）进行了比较。深色阴影区域表示ZO-3序列的同一性，浅色阴影是保守的aa取代。PDZ结构域中被认为在蛋白质-蛋白质相互作用（32）中重要的氨基酸被标记为（+），与ATP有关的氨基酸也被标记为(酒吧)、GMP（*）和Mg2+（o） 在GUK结构域中结合（26）表示假定亮氨酸拉链图案的aa。
图6
图6
MDCK/Z3细胞系表达约130 kD的外源性蛋白。(一)MDCK/Z3株（lane）全细胞裂解物的免疫印迹1)或母代MDCK细胞（车道2)用抗VSV-G探针检测表位标记的ZO-3结构。反应带仅出现在MDCK/Z3细胞系中，在～130 kD处运行。(b条)代谢标记MDCK细胞中ZO-1的低活性免疫沉淀(LS（负载感应）)显示了ZO-2和ZO-3的共沉淀（另请参见图1）。使用抗VSV-G（lanes）从代谢标记的MDCK/Z3或亲代（MDCK/P）细胞进行高效免疫沉淀1)，防–ZO-2（车道2)或反ZO-1（车道三)证明仅在MDCK/Z3细胞中存在比内源性130-kD带高一部分的带。这种分子量上的微小差异可以通过表位标签的额外1338D来解释。
图7
图7
MDCK/Z3细胞对ZO-3的免疫荧光共染(一)和ZO-1(b条). ZO-3和ZO-1在细胞边界上分布相同。对于ZO-3，可以看到细胞质的额外染色。棒材，5μm。
图8
图8
ZO-1（10 nm金）和ZO-3（5 nm金）在MDCK/Z3细胞分离膜上的免疫电镜共定位。(a–c)显示了三种不同的标记图像，显示ZO-3和ZO-1在紧密连接膜接触部位共定位，而所有其他膜，包括桥粒(D类)英寸b条，没有标签。棒材，100 nm。
图10
图10
示意图显示了紧密连接处发现的三个MAGUK家族成员的域排列。PDZ，斜条纹；SH3，水平条纹；GUK，黑色；基本域，点（+）；酸性域，水平虚线（−）；富含脯氨酸的波浪状水平线，交替拼接，α（ZO-1）和β（ZO-2）。
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    1. Anderson JM、Stevenson BR、Jesaitis LA、Goodenough DA、Mooseker MS。小鼠肝脏和Madin-Darby犬肾细胞紧密连接蛋白组分ZO-1的表征。细胞生物学杂志。1988;106:1141–1149.-项目管理咨询公司-公共医学
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