Pericentrin and gamma-tubulin form a protein complex and are organized into a novel lattice at the centrosome

doi:10.1083/jcb.141.1.163

.1998年4月6日；141(1):163-74.

doi:10.1083/jcb.141.1.163。

圆心蛋白和γ-管蛋白形成蛋白质复合物，并在中心体处组织成新的晶格

J B Dictenberg博士¹, W齐默尔曼, C A火花, 一个年轻人, C维达尔, Y Zheng先生, W卡林顿, F S费伊, S J Doxsey公司

附属公司

PMID： 9531556
预防性维修识别码： PMC2132723型
内政部： 10.1083/jcb.141.1.163号

圆心蛋白和γ-管蛋白形成蛋白质复合物，并在中心体处组织成新的晶格

J B Dictenberg博士等。 J细胞生物学. 1998.

.1998年4月6日；141(1):163-74.

doi:10.1083/jcb.141.1.163。

作者

J B Dictenberg博士¹, W齐默尔曼, C A火花, 一个年轻人, C维达尔, Y Zheng先生, W卡林顿, F S费伊, S J Doxsey公司

附属

¹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学中心分子医学和细胞生物学系项目，邮编：01655。

PMID： 9531556
预防性维修识别码： PMC2132723型
内政部： 10.1083/jcb.141.1.163年10月10日

摘要

中心蛋白和γ-微管蛋白是在微管成核和组织中起作用的完整中心体蛋白。在这项研究中，我们检测了细胞质和中心体中这些蛋白质之间的关系。从非洲爪蟾卵制备的提取物中，蛋白质是一个大型复合物的一部分，蔗糖梯度沉淀、凝胶过滤和共免疫沉淀分析证明了这一点。围绕中心蛋白-γ-微管蛋白复合物与之前描述的γ-微管蛋白环复合物（gamma-TuRC）不同，因为纯化的γ-TuRC组分不含可检测到的围绕中心蛋白。当组装在中心体时，这两种蛋白保持在很近的距离，如荧光共振能量转移所示。这些蛋白中心体相关部分的三维结构用改进的免疫荧光法测定。该分析揭示了一种新颖的网状结构，从哺乳动物到两栖动物都有这种结构，并且这种结构独立于中心粒。在细胞周期中，晶格发生了显著变化，从G1期扩大到有丝分裂期，然后随着细胞退出有丝分裂而迅速解体。在被标记为检测中心体和有核微管的细胞中，晶格元素似乎与有核微管负端接触。我们的结果表明，中心蛋白和γ-管蛋白组装成独特的中心体晶格，代表中心体微管成核位点的高阶组织。

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图3
周中心蛋白与γ-微管蛋白共免疫沉淀，但不是分离的γ-TuRC的一部分。将各种细胞组分暴露于SDS-PAGE，并用中心蛋白或γ-微管蛋白抗体进行免疫印迹。(A类)中心体组分制备自爪蟾如前所述的组织培养细胞（Blomberg和Doxsey，1998），并用中心蛋白抗体进行探测。圆心蛋白(B类)或γ-微管蛋白(C类)新制备的免疫沉淀爪蟾提取物并用中心蛋白抗体进行印迹。γ-管蛋白(D类)或中心蛋白(E类)新鲜制备的免疫沉淀爪蟾提取液并用γ-微管蛋白抗体进行印迹。用免疫前血清进行沉淀并用免疫前抗体进行印迹(F类)或无抗体（仅免疫球），并用γ-微管蛋白抗体印迹(*G公司*). 用γ-微管蛋白抗体免疫印迹纯化的γ-TuRC组分(*H（H）*)或中心蛋白(我).

图4
圆心蛋白在中心体形成一种新的晶格。α-微管蛋白抗体染色的CHO细胞微管aster和中心体(A类)和中心蛋白(B类)并用常规免疫荧光方法成像。(C类)高倍放大未固定CHO细胞中心体成像(B类). (D类)相同中心体的图像如所示(C类)使用市售的去卷积软件（Scanalytics）。(E类和F类)中同一中心体的高分辨率立体图像(C类)由Carrington算法恢复（1995）(D类，+6度；E类，−6度）。(*G–K型*)从CHO细胞中分离出的中心体，并用抗中心蛋白抗体标记以显示晶格(*G–I型*)和α-微管蛋白可视化中心粒(J型和K). 修复前，pericentrin(*G公司*)和α-微管蛋白(K). 修复后，中心蛋白染色显示整个三维数据集(*H（H）*)或五个中央平面(我)α-微管蛋白染色显示三个中心平面(J型). 两个区域没有心室周染色(我)表示中心粒占据的位置(J型). (*L–O型*)GFP–在COS细胞中表达的中心蛋白(*M（M）*)α-微管蛋白免疫荧光染色检测aster定位于微管中心(*L（左）*). GFP-前中心蛋白(N个)以及之后(*O（运行）*)图像恢复。条形图：(B类)10μm用于A类和B类; (C类)1微米；(F类)1μm用于*D–F型*; (K)1μm用于*G–K型*; (*M（M）*)10μm用于*L（左）*和*M（M）*; (*O（运行）*)，1μm用于N个和*O（运行）*.

图6
γ-管蛋白和中心蛋白是同一晶格的一部分。(A类和B类)γ-微管蛋白免疫荧光标记CHO细胞两个早期中心体的恢复图像(A类)和中心蛋白(B类). (C类和D类)动力蛋白染色CHO细胞中心体(C类)和中心蛋白(D类). (E类)使用不同荧光团标记的二级抗体对CHO细胞中心体蛋白的一致性进行定量分析（见材料和方法）。列1，大鼠抗中心蛋白/兔抗中心蛋白；柱2，兔抗中心蛋白/混合（荧光素和罗丹明结合）抗兔IgG；柱三，大鼠抗中心蛋白/兔抗γ-微管蛋白；柱4，兔抗中心蛋白/小鼠抗中心蛋白；和列5，大鼠抗中心蛋白/兔抗动力蛋白。棒材，1μm。

图6
γ-管蛋白和中心蛋白是同一晶格的一部分。(A类和B类)γ-微管蛋白免疫荧光标记CHO细胞两个早期中心体的恢复图像(A类)和中心蛋白(B类). (C类和D类)动力蛋白染色CHO细胞中心体(C类)和中心蛋白(D类). (E类)使用标记有不同荧光团的二级抗体定量分析CHO细胞中心体蛋白的一致性（见材料和方法）。列1，大鼠抗中心蛋白/兔抗中心蛋白；柱2，兔抗中心蛋白/混合（荧光素和罗丹明结合）抗兔IgG；柱三，大鼠抗中心蛋白/兔抗γ-微管蛋白；柱4，兔抗中心蛋白/小鼠抗中心蛋白；和列5，大鼠抗中心蛋白/兔抗动力蛋白。棒材，1μm。

图8
心室周蛋白和γ-微管蛋白的细胞内分布和晶格结构发生了显著的细胞周期变化。(A类)定量分析细胞周期不同阶段CHO细胞中心体相关的中心蛋白和γ-微管蛋白的免疫荧光信号（见材料和方法）。蛋白质水平从G1到有丝分裂逐渐上升，然后急剧下降到基础水平。(B类)有丝分裂结束后，中心蛋白和γ-微管蛋白的水平似乎没有变化。裂解物由中期细胞制备(*M（M）*)或从相同数量的中期细胞诱导进入末期(T型; 参见材料和方法）。如图3所示，从裂解物中免疫沉淀中心蛋白并用中心蛋白抗体进行免疫印迹(*面板1*). 其他裂解物用于γ-微管蛋白抗体的免疫印迹（图3B类,*面板2*)或细胞周期蛋白B抗体（图3B类,*面板3*). 注意，细胞周期蛋白B信号从*M（M）*到T型而在这段时间内，中心蛋白和γ-微管蛋白的水平似乎没有变化。(C类)晶格结构的变化与中心体相关蛋白水平的变化密切相关。中心粒点阵在G1中最简单，在G2时扩大到最大尺寸和复杂性，然后分离形成一对中心体，其在中期的组合尺寸(*M（M）*)略大于G2中心体。当细胞退出有丝分裂时，晶格迅速恢复到最简单的形式（与G1相似）。γ-微管蛋白抗体也观察到类似结果。细胞周期阶段：G1;*S公司*;*G2级*;*M（M）*，中期；A类后期；和T型，末期。棒材，1μm。

图8
围绕中心蛋白和γ-微管蛋白的细胞内分布和晶格结构发生了显著的细胞周期变化。(A类)定量分析细胞周期不同阶段CHO细胞中心体相关的中心蛋白和γ-微管蛋白的免疫荧光信号（见材料和方法）。蛋白质水平从G1到有丝分裂逐渐上升，然后急剧下降到基础水平。(B类)有丝分裂结束后，中心蛋白和γ-微管蛋白的水平似乎没有变化。从中期细胞制备裂解物(*M（M）*)或从相同数量的中期细胞诱导进入末期(T型; 参见材料和方法）。如图3所示，从裂解物中免疫沉淀中心蛋白并用中心蛋白抗体进行免疫印迹(*面板1*). 其他裂解物用于γ-微管蛋白抗体的免疫印迹（图3B类,*面板2*)或细胞周期蛋白B抗体（图3B类,*面板3*). 注意，细胞周期蛋白B信号从*M（M）*到T型而在这段时间内，中心蛋白和γ-微管蛋白的水平似乎没有变化。(C类)晶格结构的变化与中心体相关蛋白水平的变化密切相关。中心粒点阵在G1中最简单，在G2时扩大到最大尺寸和复杂性，然后分离形成一对中心体，其在中期的组合尺寸(*M（M）*)略大于G2中心体。当细胞退出有丝分裂时，晶格迅速恢复到最简单的形式（与G1相似）。γ-微管蛋白抗体也观察到类似的结果。细胞周期阶段：G1;*S公司*;*G2级*;*M（M）*，中期；A类后期；和T型，末期。棒材，1μm。

图1
周心蛋白和γ-微管蛋白在蔗糖梯度中共沉淀。(A类)体外-翻译[³⁵S] 按照材料和方法中的描述，在蔗糖梯度（10–40%）中沉淀蛋氨酸标记的小鼠中心蛋白，并暴露于SDS-PAGE。(A类和B类)爪蟾将提取物沉淀在蔗糖梯度中，并使用抗中心蛋白抗体进行免疫印迹(B类)或γ-微管蛋白(C类). 免疫缺失γ-微管蛋白同一提取物的平行样品(D类和E类)或用0.1%Triton X-100处理(F类和*G公司*)梯度离心前。圆心蛋白免疫印迹(B类,D类、和F类); γ-微管蛋白免疫印迹(C类,E类、和*G公司*). 分子量标准适用于所有面板。

图2
通过凝胶过滤，周中心蛋白和γ-微管蛋白共分馏。爪蟾用Superose-6柱通过凝胶过滤对提取物进行分级。用三氯乙酸从组分中沉淀蛋白质，用抗中心蛋白或γ-微管蛋白抗体进行免疫印迹，然后对所得条带进行量化（详细信息见材料和方法）。在最佳条件下，大多数γ-微管蛋白和中心蛋白以分馏形式一起洗脱*3–5*表明它们是一个大型综合体的一部分(A类和B类,*闭合箭头*). 部分洗脱的培里centrin的可变部分*5–7*和γ-微管蛋白*9–11*(B类,*打开箭头*)当提取物在冰上长时间培养时（1小时）。Y轴表示Western blots的带强度单位。

图5
晶格是中心体和其他MTOC的保守特征。(A类和B类)爪蟾心轴在体外组装。(A类)主轴上标记有中心蛋白(绿色)，α-微管蛋白(红色)和DNA(蓝色)，用常规方法成像并叠加。(B类)年心轴上极中心体的恢复图像A类. (C类和D类)无着丝粒小鼠减数分裂纺锤体阻滞于中期II。(C类)主轴标记α-微管蛋白(绿色)，中心蛋白(红色)，和DNA(蓝色)按中所述准备A类. (D类)中图像顶部的心轴极还原图像(C类). 注意放大倍数之间的差异B类和D类.棒材：(A类和C）5微米；(B类和D类)1微米。

图7
γ-微管蛋白和中心粒蛋白在中心体的接近程度足以产生FRET。为中心蛋白标记的中心体(A类，荧光素）和γ-微管蛋白(B类，罗丹明），或用于培里centrin(C类，荧光素）和中心蛋白(D类，罗丹明）被照亮以激发荧光素。使用荧光素和罗丹明发射滤光片拍摄图像，并按图4所示进行恢复。能量转移到与γ-微管蛋白结合的罗丹明标记抗体的图像(B类)与施主信号产生的信号非常相似(A类). 相反，当与中心蛋白结合的抗体作为受体时产生的图像(D类)表示pericentrin图像的一个小子集(C类). FRET比率(E类)表示为受体产生的荧光与施主产生的荧光的比例（在有效转移后被猝灭）。中心蛋白和γ-微管蛋白的FRET比值(2)与用两种心室周蛋白抗体获得的结果相似(1)远大于中心蛋白和中心蛋白(三). 棒材，1μm。

图7
γ-微管蛋白和中心粒蛋白在中心体的接近程度足以产生FRET。中心体为心室周蛋白染色(A类，荧光素）和γ-微管蛋白(B类，罗丹明），或用于培里centrin(C类，荧光素）和中心蛋白(D类，罗丹明）被照亮以激发荧光素。使用荧光素和罗丹明发射滤光片拍摄图像，并按图4所示进行恢复。能量转移到与γ-微管蛋白结合的罗丹明标记抗体的图像(B类)与施主信号产生的信号非常相似(A类). 相反，当与中心蛋白结合的抗体作为受体时产生的图像(D类)表示心周图像的一小部分(C类). FRET比率(E类)表示为受体产生的荧光与施主产生的荧光的比例（在有效转移后被猝灭）。中心蛋白和γ-微管蛋白的FRET比值(2)与用两种中心蛋白抗体获得的抗体相似(1)远大于中心蛋白和中心蛋白(三). 棒材，1μm。

图9
有核微管与晶格接触。有核微管的图像(红色)和中心蛋白(*黄色的*)合并后显示有核微管的数量在中心体汇聚（许多捆绑在一起*G2级*)而中心粒晶格的尺寸从*S公司*到*G2级*（另请参见图8，A类和C类). 第一块面板中的插图显示了简单的早期S相中心体中的微管-晶格接触。插图显示了交互区域(白色)显示微管末端与晶格元素几乎完全重叠。请参见材料和方法。γ-微管蛋白也得到了类似的结果。棒材，1μm。

**图10**
中心体组装模型。中心蛋白和γ-微管蛋白的化学计量比与一个由一个中心蛋白复合物和两个γ-微管蛋白复合物组成的大型复合物一致。该模型适用于目前提出的微管成核复合物的两种方案（Zheng等人，1995；Erickson和Stoffler，1996）（见讨论）。复合体似乎在中心体聚集形成独特的晶格(左边). 当分离时，该复合物产生一个中心蛋白亚复合物、一个γ-微管蛋白亚复合体，可能还有其他蛋白质(*正确的*). 虽然在本研究中尚未对γ-微管蛋白亚复合物进行表征，但先前已经证明纯化的γ-TuRCs能够在体外形成微管核，但不能组装到中心体上（见讨论）。中心蛋白复合物可能有助于γ-微管蛋白复合物组装到中心体晶格中。中心体的组装和稳定可能需要其他蛋白质。

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1. Albers K，Fuchs E.中间丝的分子生物学。Int Rev细胞。1992;134:243–279.-公共医学
1. Archer J，Solomon F.解构微管组织中心。单元格。1994;76:589–592.-公共医学
1. Blomberg，M.和S.J.Doxsey。1998.中心体的快速分离。方法酶制剂。新闻界。-公共医学
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