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.1998年4月；9(4):875-84.
doi:10.1091/mbc.9.4875。

人类肥大细胞合成、储存和释放血管内皮生长因子/血管通透性因子（VEGF/VPF）：VEGF206的生物学意义

格鲁茨考 1, S Krüger-Krasagakes公司, H鲍迈斯特, C施瓦兹, Högel公司, P Welker（P韦尔克）, U利珀特, B M亨兹, 米勒
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人类肥大细胞合成、储存和释放血管内皮生长因子/血管通透性因子（VEGF/VPF）：VEGF206的生物学意义

格鲁茨考等。 分子生物学细胞. 1998年4月.
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摘要

肥大细胞与各种伴随新生血管形成的疾病有关。然而，肥大细胞介导血管生成反应的确切机制尚不清楚，因此，我们研究了血管内皮生长因子/血管通透性因子（VEGF/VPF）在人类肥大细胞系HMC-1和人类皮肤肥大细胞中的可能表达。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析显示肥大细胞组成性表达VEGF121、VEGF165和VEGF189。在用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）和离子载体A23187长时间刺激细胞24小时后，可检测到代表VEGF206的额外转录物，这可以通过序列分析进行验证。Western blot分析在蛋白质水平上证实了这些结果。当比较未刺激和刺激条件下释放的VEGF数量时，刺激细胞后可检测到明显增加。人类微血管内皮细胞（HMVEC）对未刺激HMC-1细胞的上清液产生剂量依赖性有丝分裂效应，在VEGF特异性单克隆抗体存在下可中和高达90%。用流式细胞术和包埋后免疫电镜检测细胞相关形式的VEGF。VEGF仅在分离的人皮肤肥大细胞的分泌颗粒中检测到。这些结果表明，正常人和白血病人肥大细胞组成性地表达具有生物活性的VEGF。此外，这项研究有助于理解强肝素结合VEGF亚型的生理作用，因为首次发现这些亚型在HMC-1细胞中以激活依赖的方式表达。

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数字

图1
图1
血管内皮生长因子转录物在HMC-1细胞中的表达。半定量RT-PCR分析未刺激HMC-1细胞（第3通道）和用PMA/A23187刺激24小时的细胞（第4通道）的mRNA。（A） 选择用于此扩增的引物可以检测到所有VEGF亚型。（B） 血管内皮生长因子206-选择特定的引物对（图2A），从凝胶中切割扩增产物并通过直接测序进行鉴定（图2B）。车道1，尺寸标记；通道2，阴性对照（不含cDNA的样本）。尺寸标记的位置在左侧，放大产物的尺寸显示在右侧。
图2
图2
（A） 设计PCR引物，用于扩增含有67%VEGF的VEGF特异性序列（438 bp）206-特异性外显子6b。（B） 扩增产物用PCR扩增的正义引物直接测序。扩增子序列的3′端显示出预期的外显子6b特异性核苷酸序列。
图3
图3
HMC-1细胞衍生上清液的免疫印迹分析。使用PMA/A23187刺激24小时的未刺激细胞（1区）和HMC-1细胞（2、3和6区）的浓缩上清液进行SDS-PAGE分析，并在硝化纤维素膜上进行印迹。有必要使用肝素珠对上清液进行预清洗，以减少背景染色，但在此步骤中，VEGF121在很大程度上失去了。重组人VEGF165作为阳性对照（第4和第5车道）。用VEGF特异性抗体探测通道1-5，用等型特异性对照抗体探测通道6。
图4
图4
VEGF特异性ELISA测定的非刺激和刺激条件下VEGF的时间依赖性分泌。此外，在蛋白合成抑制剂1μM环己酰亚胺（CHX）存在下监测VEGF的刺激和非刺激释放。给出了五个独立实验的平均值±SD。
图5
图5
流式细胞术检测未经染色HMC-1细胞内的VEGF。抗体染色前，将细胞固定在4%多聚甲醛和0.1%戊二醛的混合物中，并用0.03%皂苷进行渗透。荧光直方图重叠的虚线表示VEGF特异性单克隆抗体的结合，实线表示同型特异性对照单克隆抗体非特异性结合。
图6
图6
HMVEC对HMC-1细胞衍生上清液的增殖反应。通过超滤将未刺激HMC-1细胞的CM浓缩10倍，并在HMVEC增殖试验中测试稀释液的促有丝分裂活性。HMVEC增殖率呈剂量依赖性增加。一式三份显示了一个代表性实验的结果。在四个独立的实验中也得到了类似的结果（我们未公布的数据）。
图7
图7
用中和VEGF特异性抗体抑制HMC-1和VEGF诱导的HMVEC增殖。（A） 在中性VEGF特异性单克隆抗体存在下，VEGF（10 ng/ml）和100%CM的促有丝分裂作用分别被抑制达100%和90%，或通过将CM与肝素结合琼脂糖珠预孵育，抑制达75%。数据表示为与对照培养基相比HMVEC增殖刺激的百分比。（B） 该图显示了VEGF特异性单克隆抗体诱导的CM有丝分裂效应的剂量依赖性中和作用。所用抗体在25 ng/ml的浓度下显示出其半最大抑制作用。对照抗体没有显示出抑制作用。在这两张图中，显示了三个独立实验的平均值±SD。
图8
图8
血管内皮生长因子在LR-White树脂包埋的人皮肤肥大细胞超薄切片中的免疫电镜定位。（A） 显示了通过酶分散和淘析富集从人包皮中分离出的典型肥大细胞。箭头表示肥大细胞特有的颗粒。N、 核心。棒材，3μm。（B） 免疫标记仅在肥大细胞特异性颗粒（箭头）中检测到。N、 核心。棒材，1μm。（C） 在存在同型匹配的无关单克隆抗体的情况下，几乎没有确定免疫反应结构。N、 核心。棒材，1μm。
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