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.1998年2月9日；140(3):525-40.
doi:10.1083/jcb.140.3.525。

一种成孔毒素与GPI锚定蛋白相互作用，导致内质网空泡化

L阿布拉米 1, M菲瓦兹, P E Glauser公司, R G Parton公司, F G范德古特
附属公司

一种成孔毒素与GPI锚定蛋白相互作用，导致内质网空泡化

L阿布拉米等。 J细胞生物学. .

摘要

本文研究了嗜水气单胞菌产生的造孔毒素溶气素对哺乳动物细胞的影响。我们的数据表明，原毒素与BHK细胞上的80-kD糖基-磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白结合，并且结合毒素与特殊的质膜域有关，被描述为去污剂不溶性微域或胆固醇-糖脂“筏”我们发现，原毒素随后被宿主细胞蛋白酶加工成成熟形式。我们提出，毒素通过与GPI锚定的蛋白质结合，与筏的优先结合可能会增加局部毒素浓度，从而促进低聚，这是通道形成的先决条件。我们表明，通道的形成不会导致质膜的破坏，而是导致对钾等小离子的选择性渗透，从而导致质膜去极化。接下来，我们研究了通道形成对细胞膜组织和动力学的影响。令人惊讶的是，我们发现毒素会引起内质网的空泡化，但不会影响其他细胞内的隔室。同时，我们发现COPI外壳从生物合成膜中释放，新合成的水疱性口炎病毒跨膜G蛋白的生物合成运输受到抑制。我们的数据表明，前溶血素与GPI-锚定蛋白的结合以及毒素的加工导致质膜寡聚和通道形成，进而导致早期生物合成膜动力学的选择性紊乱。

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图1
图1
的绑定125I-前溶血素到BHK细胞。(一)抑制125I-前溶血素通过未标记毒素与BHK细胞结合。将细胞与4nM的125I-前溶血素加上指示量的未标记野生型毒素(▪). 当存在16 nM未标记的前溶血素时，抑制率为50%。条形图表示标准偏差(n个= 3). 野生型装订125I-前溶血素也可以与过量的未标记G202C-I445C突变体前溶血酶竞争（□）(b条)特定结合动力学125I-前溶血素在4°C下对BHK细胞的作用。用4 nM培养细胞125I-前溶血素并在指定时间清洗。通过减去在存在50倍过量未标记毒素的情况下获得的值来测定特异性结合的前溶血素。条形图表示标准偏差(n个= 3). (c（c）)与BHK细胞结合的前溶血素的浓度依赖性。细胞在4°C下培养2.5小时125在不存在（○）或存在50倍过量未标记毒素（□）的情况下的I-原脂蛋白。特异性结合(♦) 用总结合毒素（○）减去非特异性结合毒素（□）计算。结果代表两个独立实验的平均值。最大误差<16%。
图2
图2
前溶血素结合BHK细胞上的80-kD蛋白。将细胞在4℃下用2 nM前溶血素处理或不处理1 h，彻底清洗、均质，并制备PNS。20μg有毒处理细胞的PNS（lane1)和控制单元（车道2)按照材料和方法中的描述，提交前溶血素覆盖试验。用未标记的溶血素原进行覆盖，并用抗溶血素抗体进行显示。箭头表示前溶血素和溶血素（仅在lane中与质膜结合）1)以预期分子量迁移。箭头表示前溶血素在覆盖过程中与硝化纤维素膜上的特定蛋白质结合。
图4
图4
PI-PLC抑制前溶血素与BHK细胞的结合。在存在10μg/ml环己酰亚胺的情况下，在37°C下用或不用6 U/ml PI-PLC培养细胞1小时。然后将细胞在有或无2 nM前溶血素的情况下在4°C下培养1小时，彻底清洗并均质。(一)通过Western blotting检测PNS中是否存在前溶血素。(b条)通过原溶脂蛋白覆盖分析PNS中是否存在原溶脂蛋白结合蛋白。车道1，控制细胞；车道2前溶血素处理细胞；车道三PI-PLC和前溶血素处理细胞。箭头表示前溶血素和溶血素（与质膜结合）以预期分子量迁移。箭头表示前溶血素与硝化纤维素膜上的特定蛋白质结合。
图3
图3
前溶血素与BHK细胞质膜上不溶于洗涤剂的微区结合。用前溶血素（4°C）处理的细胞在1%Triton X-100中溶解，不溶于洗涤剂的部分在蔗糖梯度上浮动。坡度（车道）的10个分数1到10;顶部到底部用Western Blot分析加载区（3ml）和起始匀浆中是否存在前溶血素(PA公司)，caveolin-1的(冠状病毒1型)和转铁蛋白受体(Trf-R型). 通常情况下，可以观察到两种形式的小窝蛋白-1。硝酸纤维素膜也接受了前溶血素覆盖试验，使用放射性标记毒素定位80-kD前溶血酶结合蛋白(PA-R型). 除车道外，每条车道都装载了18μg蛋白质1其中含有13μg。
图5
图5
前溶血素在BHK细胞质膜上的分布。细胞在4°C下与前溶血素（2 nM）孵育1小时。(一)用多聚甲醛固定细胞，并按照材料和方法中的描述进一步处理免疫荧光。(b条)细胞在37°C下培养15分钟，然后按照a。(c（c）和d日)如材料和方法所述，用PLAP cDNA瞬时转染BHK细胞。将细胞保存在4°C下，并用前溶血素（2 nM）孵育1 h，用抗前溶血酶单克隆抗体和抗碱性磷酸酶多克隆抗体孵育1h，用相应的二级抗体孵养1h。然后用多聚甲醛固定细胞。两种溶血素原染色的细胞相同(c（c）)和PLAP(d日). (e（电子）和如果)BHK细胞保存在4°C下，用前溶血素（2nM）孵育1h，用抗前溶血酶单克隆抗体孵育1 h，用FITC-偶联的山羊抗兔抗体孵养1 h，然后固定细胞并用甲醇渗透(e（电子）). 用甲醇固定细胞，并在室温下用抗小窝蛋白-1抗体孵育30分钟，在室温下使用赖氨酸罗丹明磺酰氯偶联山羊抗鼠IgG孵育30min(如果). 棒材，6.7μm。
图6
图6
原溶血素由宿主细胞蛋白酶处理。BHK细胞与0.95 nM孵育125I-前溶血素在4°C下培养1小时，彻底清洗并在37°C下用无毒培养基培养。在规定的时间后，将细胞均质，制备PNS并用SDS-PAGE（10%凝胶）分析，然后进行放射自显影。车道一前溶血素标记；车道b条胰蛋白酶激活的溶血素标记物；所有其他车道均根据37°C下的孵化时间进行标记。每条车道装载15μg PNS总蛋白。请注意，溶血素七聚体虽然不是共价的，但在SDS中煮沸时不会分解，因此很容易在凝胶顶部看到。
图7
图7
前溶血素对BHK细胞内钾浓度和膜电位的影响。(一)将细胞与不同浓度的原胆固醇溶素在4°C下孵育1小时，彻底洗涤，并在37°C下与无毒素培养基孵育15分钟。用火焰光度法测定钾含量。实验一式三份，并计算标准偏差。(b条)在37°C下，在10μg/ml环己酰亚胺的存在下，用或不用6 U/ml PI-PLC培养细胞1小时，在4°C下用或不使用0.38 nM前溶血素处理细胞1小时。彻底清洗细胞，并在37℃下用无毒培养基培养15分钟。然后通过火焰光度法测定钾含量。(c（c）)用膜电位敏感染料DiS-C培养胰蛋白酶化BHK细胞三（5） 如材料和方法所述。箭头表示添加前溶血素的时间。在每个实验结束时，通过添加1μg/ml（最终浓度）胰蛋白酶活化的溶血素，可获得最大去极化(箭头). ♦, 100 ng/ml野生型原胆固醇溶素；□, 20 ng/ml野生型溶血素原；○, 100 ng/ml G202C-I445C前溶血素。在用G202C-I445C突变体前溶血素处理的细胞中观察到的荧光轻微增加并不显著，因为在没有毒素的情况下观察到类似的漂移。
图8
图8
前溶血素对BHK细胞活力和形态的影响。(一)细胞在37°C下与0.38 nM的前溶血素孵育75分钟，然后提交至DEAD/LIVE活性分析（见正文）。此时，所有细胞都排除了乙炔二聚体-1和所有保留的细胞酯酶，钙调素-AM转化为荧光钙黄绿素就是证明。对照细胞的相位对比图(b条)，细胞与0.34 nM前溶血素孵育(c（c）)在37°C下保持1小时。在d日，在10μg/ml环己酰亚胺存在下，将细胞与6U/ml的PI-PLC在37°C下孵育1小时，然后与0.38 nM的原脂蛋白在4°C下孵育1小时，洗涤并在37°C的无毒素培养基中孵育1小时。棒材，10.5μm。
图10
图10
转铁蛋白受体的分布(Trf-R型)，KDEL受体ERD2(应急需求2)，甘露糖苷酶II(男子II)和甘露糖-6-磷酸受体(MPR（最大功率比）)BHK细胞中的前溶血素不受影响。在有或无0.38 nM前溶血素的情况下培养细胞50分钟(MPR（最大功率比）)或1小时(Trf-R型，应急需求2、和男子II)37°C，然后按照材料和方法中的描述进行免疫荧光处理。酒吧：(Trf-R型)20微米；(应急需求2，男子II、和MPR（最大功率比）)13微米。
图9
图9
前溶血素对calnexin在BHK细胞中分布的影响。细胞在0.38 nM前溶血素存在下于37°C孵育不同时间，立即用甲醇固定，然后按照材料和方法中的描述进行免疫荧光处理。无毒素培养的细胞(一)用毒素浸泡20分钟(b条)，60分钟(c（c）)和90分钟(d日).e（电子），电池的相位对比图如所示d。酒吧：(一)15微米；(b条)17微米；(c（c）)14微米；(d日和e（电子）)12微米。
图11
图11
溶血素处理的BHK细胞的超微结构分析。将细胞与0.38nM的前溶血素在37°C下孵育1h，固定，然后处理以包埋在Epon中并切片。A类和B类是显示细胞典型形态的低倍概述。大的电子透明液泡是处理细胞的显著特征。在许多部分，空泡明显与核膜连续(A类，箭头; 另请参见E类). 再加上膜相关核糖体的存在，这表明液泡是内质网的一部分。尽管内质网形态受到严重影响，但细胞的一般超微结构得到了很好的保存。注意细胞质致密，线粒体(米; 例如。，D类)不肿胀，内体(e（电子）)显示正常形态(C–E类). 高尔基复合体轻微肿胀，但仍可辨认(克;C类和D类).n个，细胞核。条形图：(A类和B类)0.5微米；(C–E类)：0.25微米。
图12
图12
ε-COP和BFA的降解不会影响溶血素诱导的空泡化。ldlF细胞在34°下培养(一)和40°C(b条)在培养基中培养6h。然后将细胞转移到37°C，并与20 ng/ml的原胆固醇溶素一起孵育60分钟。BHK细胞与(d日)或不带(c（c）)添加毒素前，在37°C下BFA 45分钟。在添加毒素后60分钟，对活细胞拍摄图像。在d日，在毒素治疗期间也存在BFA。棒材，10.5μm。
图13
图13
诺卡唑解聚微管网络后，原溶血素诱导的空泡化被抑制。用(b条和d日)或不带(一和c（c）)在添加毒素之前，在37°C下使用10μM的诺可达唑1小时。微管解聚药物在毒素治疗期间仍然存在。60分钟后，用甲醇固定细胞并用抗calnexin抗体染色(一和b条)或抗管蛋白抗体。棒材，6.7微米
图14
图14
前溶血素导致β-COP逐步释放到胞浆中。细胞在0.38 nM前溶血素存在下于37°C孵育不同时间，立即用甲醇固定，然后按照材料和方法中的描述进行免疫荧光处理。无毒素培养的细胞(一)用毒素浸泡20分钟(b条)，60分钟(c（c）)和90分钟(d日). 棒材，16μm。
图15
图15
在前溶血素处理的细胞中，新合成的VSV-G向质膜的转运受到抑制。在没有毒素的情况下，在39.5°C下用tsO45-VSV感染细胞3小时10分钟。在含有或不含0.38 nM前溶血素的IM中再培养细胞20分钟。将环己酰亚胺添加到细胞中，然后将其移至31°C保持45分钟。然后用多聚甲醛固定细胞，并直接用抗体修饰以进行质膜染色或用Triton X-100渗透(T-X100型)观察细胞内染色。按照材料和方法中的描述进行免疫荧光处理。棒材，15μm。
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