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.1998年2月；18(2):839-45.
doi:10.1128/MCB18.2839。

蛋白激酶C的激活触发其泛素化和降解

Z Lu公司 1, D刘, 阿霍尼亚, W德文尼斯, M帕加诺, D A福斯特
附属公司

蛋白激酶C的激活触发其泛素化和降解

Z Lu公司等。 分子细胞生物学. 1998年2月.

摘要

用促进肿瘤的佛波酯治疗细胞会激活佛波酯反应蛋白激酶C（PKC）亚型，但随后会耗尽。泛素蛋白酶体途径参与调节许多细胞蛋白质的水平，包括那些参与细胞周期控制的蛋白质。我们在此报告，在3Y1大鼠成纤维细胞中，蛋白酶体抑制剂可防止PKC亚型α、δ和ε的耗竭，以响应促肿瘤佛波酯12-O-十四烷基佛波-13-乙酸酯（TPA）。蛋白酶体抑制剂还阻断了TPA对过表达c-Src的3Y1细胞的促瘤作用，这是由PKCδ的缺失引起的。与泛素-蛋白酶体途径参与PKC异构体的降解一致，在TPA处理的30分钟内检测到泛素化的PKCα、δ和ε。PKC的生理激活剂二酰甘油也刺激PKC的泛素化和降解，表明泛素化是PKC激活的生理反应。抑制PKC活化的化合物可阻止TPA和二酰甘油诱导的PKC耗竭和泛素化。此外，PKC-α的激酶缺失型ATP结合突变体不能被TPA处理耗尽。这些数据与自杀模型一致，PKC的激活通过泛素蛋白酶体途径触发其自身降解。

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数字

图1
图1
蛋白酶体抑制剂可防止TPA诱导的PKC耗竭。用TPA（400 nM）对过度表达c-Src的3Y1细胞进行指定时间的处理，并如前所述通过Western blot分析监测PKC耗竭（7）。MG101、MG132或E64（均为50μM）的效果通过在添加TPA前30分钟添加这些化合物来确定，如图所示。PKCδ、α、ɛ和ζ的水平是通过使用这些亚型的特异性抗体来确定的。
图2
图2
经TPA治疗后，PKC变得无所不在。将c-Src过度表达的3Y1细胞用TPA（400 nM）处理指定时间。然后对PKCδ、α、ɛ和ζ进行免疫沉淀（IP），并用抗泛素抗体通过Western blot分析测定泛素化PKC的水平。MG101（50μM）对未经处理的细胞和经TPA处理的细胞的泛素化有影响。左边的数字是以千为单位的分子量。
图3
图3
PKC的降解依赖于PKC激酶的活性。（A） 用TPA（400 nM）处理过度表达c-Src的3Y1细胞6小时，以耗尽PKC细胞。然后，在PKC抑制剂staurosporine（Stauro）、双吲哚甲酰亚胺II（Bis）、Go6976和rottlerin（Rott）存在的情况下，按照指示的浓度进行检测，并通过Western blot分析测定PKC水平，如图1所示。（B） PKC抑制剂对TPA诱导的PKCα和δ泛素化的影响如图2所示。（C） 通过Western blot分析TPA治疗前后细胞溶质和膜组分中存在的PKC亚型，研究了TPA在PKC抑制剂存在下诱导PKC异构体从细胞溶质转移到膜的能力。（D和E）分别检测了非活性佛波酯4α-佛波酯12，13-双癸酸酯（4α-PDD）（400 nM）对PKC亚型下调（D）诱导和PKCδ（E）泛素化的影响，如面板A和面板B。
图3
图3
PKC的降解依赖于PKC激酶的活性。（A） 用TPA（400 nM）处理过度表达c-Src的3Y1细胞6小时，以耗尽PKC细胞。然后，在PKC抑制剂staurosporine（Stauro）、双吲哚甲酰亚胺II（Bis）、Go6976和rottlerin（Rott）存在的情况下，按照指示的浓度进行检测，并通过Western blot分析测定PKC水平，如图1所示。（B） PKC抑制剂对TPA诱导的PKCα和δ泛素化的影响如图2所示。（C） 通过对TPA治疗前后细胞溶质和膜组分中存在的PKC亚型进行Western blot分析，研究了TPA在PKC抑制剂存在下诱导PKC异构体从细胞溶质转移到膜的能力。（D和E）对于图A和B，分别检测了无活性佛波酯4α-佛波酯12，13二癸酸酯（4α-PDD）（400 nM）对PKC亚型下调（D）和PKCδ泛素化（E）的诱导作用。
图4
图4
PKCα的激酶缺失突变体未被TPA下调。c-Src过度表达的3Y1细胞稳定转染了一个突变的PKCα基因，该基因在ATP结合位点发生突变（15）。（A） 然后用TPA（400 nM，）处理突变的PKC-α-过度表达细胞，并在6小时和72小时后测定这些细胞和亲本细胞中PKCα、δ和ɛ的水平，如图1所示。（B） 如图3C所示，测定了TPA诱导PKC亚型从亲本细胞和表达激酶脱失PKCα的细胞中的胞浆移位到膜的能力。
图5
图5
PKC在蛋白酶体和激酶依赖机制中下调并泛素化，以响应DG。（A） 用DiC8（10μg/ml）处理c-Src过度表达的3Y1细胞，并在E64（50μM）、MG101（50μM）、双吲哚马来酰亚胺II（Bis）（1μM）或Go6976（2μM）存在下处理指定时间，然后通过Western blot分析测定PKCα、δ和ɛ的水平，如图1所示。（B） 如图2所示，在蛋白酶体抑制剂MG101（50μM）和PKC抑制剂staurosporine（Stauro）（50 nM）、双吲哚甲酰胺II（1.0μM）、Go6976（2.0μM）以及rottlerin（80μM）存在的情况下，测定DiC8对PKCδ泛素化的影响。
图6
图6
蛋白酶体抑制剂阻止TPA诱导过度表达c-Src的3Y1细胞转化。（A） 在MG101（50μM）或E64（50μM）存在下，过度表达c-Src的3Y1细胞未经处理或用TPA（400 nM；10 h）处理，并检查细胞的形态。MG101对v-Src转化的3Y1细胞的作用也显示出来。（B） 通过Western blot分析TPA治疗前后细胞溶质和膜组分中存在的PKC亚型，研究了TPA在MG101和E64存在下诱导PKC异构体从细胞溶质转移到膜的能力。
图6
图6
蛋白酶体抑制剂阻止TPA诱导过度表达c-Src的3Y1细胞转化。（A） 在MG101（50μM）或E64（50μM）存在下，过度表达c-Src的3Y1细胞未经处理或用TPA（400 nM；10 h）处理，并检查细胞的形态。MG101对v-Src转化的3Y1细胞的作用也显示出来。（B） 通过Western blot分析TPA治疗前后细胞溶质和膜组分中存在的PKC亚型，研究了TPA在MG101和E64存在下诱导PKC异构体从细胞溶质转移到膜的能力。
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