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。1998年2月；18(2):790-8.
doi:10.1128/MCB18.2.790。

传统、新型和非典型蛋白激酶C同型激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶途径

D C Schönwasser公司 1, R M马莱, C J马歇尔, P J帕克
附属公司

传统、新型和非典型蛋白激酶C同型激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶途径

D C舍恩瓦瑟等。 摩尔细胞生物学。 1998年2月。

摘要

福尔波酯处理静止的瑞士3T3细胞可导致细胞增殖，这一反应被认为是由蛋白激酶C（PKC）介导的，蛋白激酶C是这类药物的主要细胞受体。我们在此证明，这种增殖依赖于细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）级联的激活。结果表明，显性负性PKC-α通过佛波酯抑制Cos-7细胞中ERK/MAPK通路的刺激，表明PKC在这一激活中发挥作用。为了评估介导这一过程的PKC等型的潜在特异性，我们使用了六种PKC等型（α、β、δ、ε、eta和zeta）的组成活性突变体。将这些PKC突变体瞬时转染到Cos-7细胞中表明，所有三组PKC（常规、新型和非典型）的成员都能够激活p42 MAPK及其直接上游激活物MAPK/ERK激酶MEK-1。在磷酸化MEK-1的激酶Raf水平上，激活级联发散；虽然传统和新型PKCs（同种型α和eta）是c-Raf1的有效激活剂，但非典型PKCζ不能增加c-Raf1的活性，通过一种独立的机制刺激MEK。对于RafCAAX，PKC-α和PKC-eta对c-Raf1的刺激被取消，RafCAAK是一种膜定位的部分活性形式的c-Raf1。我们进一步证实，Raf的激活与丝氨酸残基259和499的磷酸化无关。除了激活外，我们还描述了一种由PKC-α诱导的新型Raf脱敏，其作用是阻止生长因子进一步刺激Raf。因此，研究结果证明了PKC和p42 MAPK在12-O-十四烷酰基佛波-13-乙酸酯诱导的有丝分裂中的必要作用，并为多个PKC控制作用于该MAPK级联反应提供了证据。

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数字

图1
图1
佛波酯对瑞士3T3细胞的影响。福尔波酯处理通过ERK/MAPK途径诱导DNA合成。用400 nM TPA或20%胎牛血清处理静止的瑞士3T3细胞40小时，或在MEK-1抑制剂PD 098059（30μM）存在（+）或不存在（-）的情况下，不进行刺激。DNA合成通过测量[三H] 胸腺嘧啶掺入。每个值是代表两个独立实验的三个盘子平均值的平均值±标准误差。（插图）福尔波酯处理激活p42 MAPK。用400 nM TPA处理静止的瑞士3T3细胞不同的时间间隔，并通过10%聚丙烯酰胺凝胶中p42 MAPK蛋白的迁移率变化分析来测量p42 MAPK的活化，作为激酶活性的读数。对瑞士3T3细胞进行福尔波酯处理后，p42 MAPK迅速激活（1分钟），持续时间长达2小时。
图2
图2
显性负性PKC-α抑制TPA治疗后p42 MAPK的激活。血清饥饿的Cos-7细胞与myc-p42 MAPK和显性阴性PKC-α（T/A）共转染三或使用空向量作为控件。转染后（48小时），用TPA（250 nM）刺激细胞0、1、3和6分钟，用MBP作为底物的免疫复合物激酶测定myc-p42 MAPK活性。将活性标准化为免疫复合物中的myc-p42 MAPK蛋白水平。对于每个时间点，使用三份样品，当其大于相应平均值的8%时，显示标准误差（误差条）。由吨测试时，6分钟的时间点会导致P（P）值小于0.001。
图3
图3
p42 MAPK在体内被各种PKC异构体激活。代表传统（α和β1)将myc-p42 MAPK与该家族的新（δ、ɛ和η）和非典型（ζ）亚类以及空载体共同转染到Cos-7细胞中。转染48 h后取重复培养皿，免疫沉淀myc-p42 MAPK，测定其活性。myc-p42 MAPK活性随蛋白质表达以任意单位呈现。图下方的面板显示了底物磷酸化的量，以磷成像扫描仪（分子动力学）的单位表示（上面板），以及反应中存在的蛋白质量（重复；下面板）。显示了三个类似实验之一的结果。在收获细胞前20分钟，用TPA（400nM）和FCS（20%）的混合物刺激用空载体和myc-p42 MAPK转染的对照样品，导致myc-p42 MAPK活化14至83倍，这取决于个体实验（数据未显示）。星号表示与其他印迹相比，PKC-η转染细胞中显示myc-p42 MAPK蛋白的Western印迹暴露时间更长。
图4
图4
PKC-α、-η和-ζ在体内激活MEK-1。在Cos-7细胞中，PKC-α、-η和-ζ的组分活性形式和空载体与myc标记的MEK-1结构体共存。细胞培养48小时后收获，免疫沉淀myc-MEK-1。以重组p42 MAPK蛋白和MBP为底物，通过体外激酶偶联试验测定Myc-MEK-1活性。图下方的面板表示32P并入MBP（上面板）和每个反应中存在的myc-MEK-1酶的数量（重复；下面板）。每个值都是重复样本的平均值。误差条表示标准误差。在收获前，通过TPA（400 nM）和FCS（20%）的混合物刺激用空载体和myc-MEK-1转染的对照样品20分钟，导致myc-MEK-1活化8到10倍（数据未显示）。所示数据来自两个类似实验中的一个。
图5
图5
c-Raf 1被PKC-α和-η激活，而不是PKC-ζ。PKC-α、-η和-ζ的组分活性结构和空载体与myc标记的c-Raf1结构共同转染到Cos-7细胞中。转染后45小时，myc-Raf蛋白被免疫沉淀，并以重组MEK和p42 MAPK蛋白和MBP为底物，通过体外激酶联用检测其活性。底物磷酸化的量（上图）和每个反应中myc-Raf酶的量（重复；下图）显示在图表下方的成对面板中。收获前，用TPA（400 nM）和FCS（20%）的混合物刺激空白载体和myc-Raf转染的对照样品10分钟，导致myc-Rav活化6至22倍（数据未显示）。所示数据来自三个类似实验中的一个。
图6
图6
PKC-α和-η能够激活Raf S259A和Raf S499A。Cos-7细胞与组成活性PKC-α和-η的构建物或空载体结合myc标记的野生型（wt）c-Raf1或突变的Raf构建物c-Raf S259A或c-Raf S499A共同转染。转染后（40 h），收集细胞，免疫沉淀野生型或突变型Raf蛋白，并用体外激酶联用测定其活性。底物磷酸化标准化为每个激酶反应中的Raf蛋白量；Raf激活表示为空载体控制活动的百分比。在收获前，通过TPA（400 nM）和FCS（20%）的混合物刺激空白载体和myc-Rafwt、myc-Raf S259A或myc-Rav S499A转染的对照样品10分钟，分别导致活化6倍、4至10倍和7至9倍（数据未显示）。该实验分为两次进行，是三个独立实验的代表。
图7
图7
Raf的膜定位突变体不能被组成活性PKC激活。将Cos-7细胞与myc-RafCAAX和组成型活性PKC-α、-η或-ζ空载体共转染。转染后45小时，对照细胞未经处理或用20%的血清和400 nM TPA刺激10分钟，然后收获。总细胞裂解液的一部分用于免疫沉淀myc-RafCAAX，并在依赖于添加重组MEK、p42 MAPK和MBP的偶联分析中测定其活性。底物磷酸化（上面板）标准化为每个样品中的蛋白质量（重复；下面板）。收获前，通过TPA（400 nM）和FCS（20%）的混合物刺激空白载体和myc-RafCAAX转染的对照样品10分钟，导致myc-RavCAAX激活3到8倍（数据未显示）。此实验一式两份，是三种独立分析的代表。
图8
图8
PKC-α在MAPK级联的不同水平上发挥脱敏作用。将组成活性PKC-α（α）或空载体与myc表位标记的p42 MAPK（a）、myc-MEK-1（B）、myc-Raf1（c）或myc-RafCAAX（D）联合转染Cos-7细胞。在表达40小时后，在p42 MAPK和MEK-1的情况下，用20%血清和400 nM TPA刺激一半样本20分钟，在c-Raf 1和RafCAAX的情况下刺激10分钟；未刺激细胞呈深灰色，血清TPA刺激细胞呈浅灰色。myc标记蛋白免疫沉淀后，测定p42 MAPK、MEK-1、c-Raf1和RafCAAX的活性。所有显示的数据都已标准化为每个样本中表达的报告构造量。每项分析重复进行。
图9
图9
说明不同PKC同工酶如何激活ERK/MAPK级联的模型。cPKCs（α和β1)具有在体内激活c-Raf1的潜力，同时阻断生长因子和其他PKC同种型的进一步激活。PKC-δ、-ɛ和-η代表PKC超家族新亚类的等型，激活MAPK级联，但没有脱敏效应。aPKC-ζ在MEK活化方面不同于其他PKC异构体。当PKC-α和-η通过Raf向MEK发出信号时，PKC-ζ通过Raf非依赖性途径发挥作用。
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    1. Adams P D，Parker P J.TPA诱导MAP激酶活化。FEBS信函。1991;290:77–82.-公共医学
    1. Ahmed S、Kozma R、Monfries C、Hall C、Lim H H、Smith P、Lim L。人脑n-嵌合体cDNA编码一种新的佛波酯受体。《生物化学杂志》，1990年；272:767–773.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Alessi D R、Cuenda A、Cohen P、Dudley D T、Saltiel A R.PD 098059是体内外丝裂原活化蛋白激酶活化的特异性抑制剂。生物化学杂志。1995;270:27489–27494.-公共医学
    1. Alessi D R、Saito Y、Campbell D G、Cohen P、Sithanandam G、Rapp U、Ashworth A、Marshall C J、Cowley S。p74raf-1磷酸化MAP激酶-1中位点的鉴定。EMBO J.1994；13:1610–1619.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Avruch J，Zhang X F，Kyriakis J M.Raf与Ras会面：完成信号转导途径的框架。生物化学科学趋势。1994;19:279–283.-公共医学