An arenavirus RING (zinc-binding) protein binds the oncoprotein promyelocyte leukemia protein (PML) and relocates PML nuclear bodies to the cytoplasm

doi:10.1128/JVI.72.1.758-766.1998

。1998年1月；72(1):758-66.

doi:10.1128/JVI.72.1.758-766.1998。

沙粒病毒环（锌结合）蛋白结合癌蛋白早幼粒细胞白血病蛋白（PML）并将PML核体重新定位到细胞质

K L边框¹, E J坎贝尔·德怀尔, M S萨尔瓦多

附属公司

PMID： 9420283
PMCID公司：项目经理109432
内政部： 10.1128/JVI.72.1.758-766.1998

沙粒病毒环（锌结合）蛋白结合癌蛋白早幼粒细胞白血病蛋白（PML）并将PML核体重新定位到细胞质

K L边框等。 J维罗尔。 1998年1月。

。1998年1月；72(1):758-66.

doi:10.1128/JVI.72.1.758-766.1998。

作者

K L带边框¹, E J坎贝尔·德怀尔, M S萨尔瓦多

附属

¹加拿大新斯科舍省哈利法克斯达尔豪西大学生物化学系。

PMID： 9420283
PMCID公司：项目经理109432
内政部： 10.1128/JVI.72.1.758-766.1998

摘要

早幼粒细胞白血病蛋白（PML）形成核体，在某些疾病条件下会发生改变。我们报道了细胞质RNA病毒淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）影响PML小体的分布。在感染LCMV的细胞中，Z蛋白和PML主要在细胞质中形成大体。瞬时转染研究表明，仅Z就足以将PML重新分配到细胞质，PML和Z共定位。免疫共沉淀研究显示PML和Z蛋白之间存在特异性相互作用。另一种沙粒病毒（拉沙病毒）的Z蛋白也观察到类似的结果，这表明这是沙粒病毒科的一般特征。利用PML的基因工程突变表明Z蛋白结合PML的N末端区域，不需要PML环或核定位信号来共同定位。Z蛋白主要用于克服在几个PML突变体中观察到的弥漫表型。PML和Z之间的相互作用可能会影响沙粒病毒感染的某些独特特征。

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图1
LCMV感染对PML核小体的影响。（A）未感染NIH 3T3细胞；（B） 70小时LCMV感染NIH 3T3细胞；（C） 90小时LCMV感染细胞。材料和方法中描述了LCMV感染。用材料和方法中描述的PML多克隆抗体和FITC-结合二级抗体对细胞进行染色。用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光。放大倍数，×40物镜，变焦2.6（A）、1.7（B）和3.9（C）。

图2
Z蛋白、PML的亚细胞定位，以及Z蛋白表达对PML亚细胞分布的影响。实验按照材料和方法中的描述进行。（A）仅用Z构建物转染细胞并用亲和纯化的Z抗体染色，然后进行FITC；（B）同一单元的相位对比图；（C）两个细胞，其中一个细胞转染了PML结构，以显示细胞核中69-kDa亚型的正常PML表型（见参考文献和其中的参考文献）。有关更多详细信息，请参阅文本。（D至F）转染Z和PML表达结构的细胞，但仅用PML多克隆抗体染色，然后进行FITC染色。用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光。FITC在488nm处被激发。放大倍数：×40物镜，变焦3.5（A和B）、3.5（C）、3.0（D）和3.0（E）；×25物镜，缩放6.0（F）。

图3
Z蛋白和PML的克隆化研究。按照材料和方法中的描述，用等量的含Z和PML的哺乳动物表达载体转染细胞。上面板与下面板相对应。（A和D）用德克萨斯红标记的抗小鼠二级抗体用PML MAb 5E10染色的细胞；（B和E）细胞用亲和纯化的Z抗体和FITC-标记的抗兔次级抗体染色；（C和F）叠加（共定位为黄色）。FITC在488nm处被激发，而Texas Red在568nm处激发。这两个通道是独立记录的。图像被覆盖在Photoshop中。放大倍数，×40物镜，变焦2。图像在Photoshop中进一步放大以供展示。

图4
共免疫沉淀显示PML和Z之间的直接蛋白相互作用。研究了LCMV和拉萨病毒的Z蛋白。将相应的Z-GST融合蛋白与PML蛋白混合，并与材料和方法中所述的抗GST抗体共免疫沉淀。在SDS-20%PAGE凝胶上运行样品，然后将其印在PVDF膜上。使用增强化学发光检测系统（ECL；Amersham）和MAb 5E10进行西方分析，以检测免疫沉淀的PML。S、上清液；P、沉淀。放射自显影的Lane P表明PML与LCMV Z和Lassa病毒Z融合蛋白共沉淀。Lane S显示，共免疫沉淀后的上清液仅保留微量PML。

图5
绘制PML和Z之间的相互作用。（A）这些研究中使用的结构总结。这些方框表示PML中发现的各种图案；B1和B2，各自的B盒；nls，核定位信号（见正文）。线表示PML的删除区域。有关构造的详细信息，请参见材质和方法。（B） PML和Z的联合免疫沉淀（Co-IP）结果总结。这些研究使用Z蛋白而非Z-GST。+和−，PML和Z分别有和没有免疫沉淀。突变如图A.WT野生型所述。（C）用于面板B.P中数据的相关放射自显影，沉淀物；S、上清液；W、每次免疫沉淀都要洗两次。实验按照材料和方法中的描述进行。（D）亲和纯化Z抗体的特异性。对细胞裂解物的S100部分进行免疫印迹，并用亲和纯化的Z抗体进行检测。分子量标记如图所示。有关更多详细信息，请参阅文本。

图6
与LCMV Z基因共转染的PML突变体。用PML多克隆抗体和FITC二级抗体染色的突变体。通过共焦激光显微镜收集图像。（A）与Z共转染的PML RING突变体；（B）与Z共转染的PML B1 B盒突变体。突变描述见材料和方法。放大倍数，×40，变焦1.7（A）和2.8（B）。

图7
野生型PML和Z基因的联合转染，RING区域出现双点突变。用亲和纯化的抗Z抗体和FITC次级（A）或PML MAb 5E10和德克萨斯红次级抗体（B）对细胞进行染色。（C）覆盖层以黄色显示同位化；（D）相位图和荧光叠加。在共焦激光显微镜上采集图像，分别激发每个通道。放大倍数，×40，变焦1.9。

图8
当PML和Z在RING域都发生突变时，瞬时转染的效果。用PML MAb 5E10和德克萨斯红（A）或亲和纯化Z抗体和FITC二级抗体（B）对细胞进行染色。有关突变体的描述，请参见材料和方法。通过单独激励每个通道，在共焦激光显微镜上收集图像。放大倍数，×100。

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1. Borden K L B，Freemont P S.《无名指：序列结构家族的一个例子》。当前操作结构生物。1996;6:395–401.-公共医学

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