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.1997年10月6日;186(7):1159-63。
doi:10.1084/jem.186.7.1159。

单核细胞增生李斯特菌李斯特菌溶血素O对巨噬细胞吞噬体的pH依赖性穿孔

附属公司

单核细胞增多性李斯特菌李斯特菌溶素O对巨噬细胞吞噬体的pH依赖性穿孔

K E Beauread公司等。 实验医学杂志. .

摘要

成孔毒素李斯特菌溶血素O(LLO)是单核细胞增生李斯特菌从吞噬细胞空泡中逃逸的主要毒力因子。在这里,我们描述了LLO对液泡穿孔的pH依赖性,使用膜免疫荧光团8-羟基芘-1,3,6-三磺酸(HPTS)监测小鼠骨髓源性巨噬细胞中液泡的pH值和完整性。当含有野生型单核细胞增生李斯特菌的酸性液泡的pH值突然升高并向胞浆中释放HPTS时,观察到穿孔。LLO缺陷突变体没有出现这些变化。穿孔发生在酸性液泡pH值(4.9-6.7)时,当巨噬细胞被溶酶体促生长剂氯化铵或巴非霉素A1处理时,穿孔频率降低或完全被阻止。我们得出结论,酸性pH有助于体内LLO活性。

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数字

图1
图1
HPTS荧光显示吞噬体pH值和膜完整性。相差显微镜显示巨噬细胞()含有两个突出的亮相囊泡。囊泡1是一个大松果体和囊泡2是一个宽敞的吞噬体,包含三种细菌,可见为相敏杆。这些囊泡中包含的HPTS的荧光显示为exc.440nm(b条)和405纳米(c(c)). 每个序列中的四帧显示以30秒为间隔拍摄的图像,最左侧的图像与相位对比度图像相对应。在低pH值下,HPTS的荧光在exc.405nm处大于440nm处;相反,在中性pH下,exc.440nm处的荧光比405nm处的大。因此,这两个囊泡在早期时间点都呈酸性。囊泡1在整个系列中保持酸性,但囊泡2显示pH值突然升高(b条c(c),第三帧),然后是染料损失(b条c(c),第四帧)。
图2
图2
来自穿孔吞噬体的HPTS扩散到细胞质和细胞核。时间序列显示相位对比显微照片(),相应的HPTS荧光激发于440 nm(b条)和405纳米(c(c)). 每行中的帧以45-s的间隔隔开。相-右吞噬体(a–c,囊泡1)和大松果体(a–c,囊泡2)含有HPTS。最初,囊泡1在exc.440nm处显示出明亮的荧光,但在exc.405nm处几乎没有荧光;因此,它的pH值相对较高。当染料进入细胞质时,其exc.440nm荧光降低。囊泡2在异常405 nm处呈荧光,但在440 nm处无法检测到,表明存在酸性隔间pH值。在整个时间序列中,它保持完整,并处于低pH值。囊泡最初在两个激发波长上都有荧光,但在第一帧和第二帧之间的间隔中失去了所有荧光。染料在细胞质和细胞核中的积累(n个)在exc.440nm处的荧光增强表明,荧光在整个细胞中弥散分布。
图3
图3
LLO在吞噬体和大松果体酸化时穿孔。巨噬细胞中的三个相-右小泡()用HPTS标记。90秒间隔的荧光图像显示为中的时间序列b条(440 nm)和c(c)(405纳米)。囊泡1是一种大松果体,通过前三帧酸化,然后突然增加其pH值(b条c(c),框架4)在失去染料之前(b条c(c),框架5). 囊泡2包含单核细胞增生李斯特菌; 它最初的pH值相对较高(b条c(c),框架1). 然后酸化(b条c(c),框架2),突然又变成碱性(b条c(c),框架),并失去了它的染料(b条c(c),框架4). 囊泡另一种吞噬体最初处于高pH值,直到失去大部分染料。
图4
图4
pH值分析单核细胞增生李斯特菌–包含液泡。用定量荧光显微镜测定感染后含HPTS的液泡的荧光强度李斯特菌。使用pH至440:405 nm强度比的标准曲线校准荧光强度的pH值。这些图表是来自几个实验的代表性时间进程。开放符号表示液泡中荧光的突然丧失,因此,实验结束。以闭合符号结束的痕迹是那些没有显示荧光突然消失的痕迹。这些实验一直持续到荧光信号因HPTS的猝灭和再循环而丢失。(A类)含有野生型的噬菌体单核细胞增生李斯特菌。随着HPTS释放到细胞质中,液泡的pH值突然升高,随后荧光信号降低。在某些情况下,吞噬体会重新酸化,并显示出二次pH值升高(正方形). (B)控制感染野生型细胞中的液泡单核细胞增生李斯特菌。这些液泡酸化,偶尔出现穿孔迹象(正方形). (C类)细胞感染DP-L2161(钻石,吞噬体;广场,控制液泡)。这个单核细胞增生李斯特菌由于hly缺失,突变体缺乏LLO。(D类)细胞感染野生型单核细胞增生李斯特菌在0.5μM巴非霉素A存在下1.
图5
图5
野生型单核细胞增生李斯特菌在平均pH值为5.94时穿孔液泡。为了确定液泡穿孔是否需要pH值,记录一次pH值升高之前液泡达到的最低pH值。在每个pH值下显示穿孔的液泡数量如图所示。当pH值约为6.0时,穿孔频率增加。

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引用人

参考文献

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