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.1997年9月22日；138(6):1219-28.
doi:10.1083/jcb.138.6.1219。

Bcl-2维持内质网钙稳态

H He公司 1, M Lam先生, T S McCormick公司, C W Distelhorst公司
附属公司

Bcl-2维持内质网钙稳态

H He公司等。 J细胞生物学. .

摘要

癌基因bcl-2编码一个定位于细胞膜（包括内质网、线粒体和核周膜）的26-kD蛋白，但其作用机制尚不清楚。我们一直在研究Bcl-2调节钙离子（Ca2+）通过内质网膜的运动这一假说。本实验室的早期发现表明，Bcl-2可减少经Ca2+-ATPase抑制剂thapsigargin（TG）治疗的WEHI7.2淋巴瘤细胞内质网腔的Ca2+流出，但不能阻止细胞外钙的电容性进入。在本报告中，我们表明TG诱导细胞凋亡不需要因电容进入而持续升高胞浆Ca2+，这表明内质网钙库耗竭可能触发细胞凋亡。Bcl-2过表达维持TG处理细胞内质网中Ca2+的摄取，防止TG诱导的内源性糖蛋白组织蛋白酶D腔内处理延迟。此外，当细胞外Ca2+较低时，Bcl-2过度表达保留未处理细胞中的内质网Ca2+池。然而，低细胞外Ca2+降低了Bcl-2的抗凋亡作用，这表明由于电容性进入导致的胞浆Ca2+升高可能是Bcl-2优化内质网池填充和抑制凋亡所必需的。总之，研究结果表明，Bcl-2维持内质网内Ca2+稳态，从而抑制TG诱导的凋亡。

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数字

图1
图1
Bcl-2介导ER-Ca2+吸收。吸纳45钙2+在没有地高辛的情况下，在地高辛渗透细胞中进行测定(A类)或存在草酸盐(B–F类)，在缺席的情况下(A类和B类)或存在5 nM TG(C类)，10 nM TG(D类)，20 nM TG(E类)，或100 nM TG(F类). 开放符号，WEHI7.2单元格；闭合符号，W.Hb12单元格。符号表示在重复至少两次且结果相似的单个实验中重复测定的平均值。
图2
图2
Bcl-2不增加Ca的表达2+-结合蛋白。水平轴上列出的未处理细胞的提取物通过SDS-PAGE进行分解，并转移到硝化纤维素膜上。车道1–4使用抗Bcl-2抗体进行Western印迹1和2)和抗血清蛋白抗体（lanes三和4)作为探针。车道5–8与45钙2+然后暴露在x射线胶片上。分子质量标准在车道上9车道内约80-kD处检测到一种与抗lbindin抗体发生免疫反应的未知蛋白质4和一个身份不明的Ca2+-在CaBP20细胞（lane）中检测到结合蛋白5)介于49.5和80-kD标记之间。这些蛋白质的外观在实验中是可变的，因此被认为不重要。
图3
图3
Bcl-2防止组织蛋白酶D处理中TG诱导的延迟。野生型S49细胞组织蛋白酶D处理的脉冲追踪分析(−Bcl-2)和Bcl-2转染剂(+Bcl-2型)有无200 nM TG[35S] 蛋氨酸标记的组织蛋白酶D经免疫沉淀，在还原和变性条件下用PAGE溶解，并用放射自显影分析。
图4
图4
Bcl-2防止ER-Ca2+水池枯竭。WEHI7.2细胞(A–D)和W.Hb12细胞(E–H（E–H）)孵育3小时(A类,B类,E类、和F类)或18小时(C类,D类,G公司、和H（H）)在含有Ca的介质中2+浓度为1.3 mM(A类,C类,E类、和G公司)或含Ca的中等2+0.13 mM的浓度(B类,D类,F类、和H（H）)然后加载Fura2-AM。所示为连续荧光跟踪，其中添加100 nM TG(右手箭头)诱导胞浆钙增加2+浓度。注意EGTA(左手箭头)在TG前立即添加以螯合细胞外钙2+; 因此，细胞溶质钙的增加2+TG添加后代表钙的释放2+从ER池中。每次示踪开始时附近荧光的大垂直振荡对应于EGTA和TG添加期间的短暂曝光。
图5
图5
Bcl-2对细胞生长和活力的影响。WEHI7.2细胞(A类,B类,E类、和F类)和W.Hb12细胞(C类,D类,G公司、和H（H）)在含有1.3 mM Ca的培养基中培养2+(打开的符号)或0.13 mM Ca2+(闭合符号)在没有TG的情况下(A–D)或存在100 nM TG(E–H（E–H）)在不同的时间点，根据吖啶橙染色细胞的荧光显微镜检测到的细胞核凋亡变化，测量活细胞的数量（定义为不含台盼蓝染料的细胞）和凋亡细胞的百分比。符号表示在重复三次且结果相似的单个实验中重复测定的平均值。
图6
图6
低细胞外钙2+抑制细胞溶质钙2+TG处理细胞的升高。WEHI7.2细胞(A类)和W.Hb12细胞(B类)在含有1.3 mM Ca的培养基中培养2+或0.13 mM Ca2+在存在或不存在100 nM TG的情况下，在加载Fura-2 AM之前保持4小时。细胞溶胶Ca2+根据Fura-2荧光测定浓度。符号表示三个单独实验中多次测定的平均值±SE。
图7
图7
模型：Bcl-2调节钙2+内质网内稳态。钙与2+细胞质和内质网中的池如图所示。A–D代表在含有生理浓度钙的培养基中培养的细胞2+（1.3 mM），以及E–H（E–H）代表在含有低浓度钙的培养基中培养的细胞2+（0.13毫米）。A类,C类,E类、和G公司代表缺乏Bcl-2的细胞，以及B类,D类,F类、和H（H）表示表达Bcl-2的细胞。A类,B类,E类、和F类代表未经处理的细胞，其中钙2+由Ca泵入ER2+-ATP酶，以及C类,D类,G公司、和H（H）代表Ca2+-ATP酶泵被TG抑制。Bcl-2由锚定在ER膜上的两条平行线表示。
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