COOH terminus of occludin is required for tight junction barrier function in early Xenopus embryos

doi:10.1083/jcb.138.4.891

.1997年8月25日；138(4):891-9.

doi:10.1083/jcb.138.4.891。

早期爪蟾胚胎紧密连接屏障功能需要闭塞素的COOH末端

Y Chen先生¹, C梅兹多夫, D L保罗, D A好了

附属公司

PMID： 9265654
预防性维修识别码： PMC2138038型
内政部： 10.1083/jcb.138.4891

早期爪蟾胚胎紧密连接屏障功能需要闭塞素的COOH末端

Y Chen先生等。 J细胞生物学. 1997.

.1997年8月25日；138(4):891-9.

doi:10.1083/jcb.138.4.891。

作者

Y Chen先生¹, C梅兹多夫, D L保罗, D A好了

附属

¹哈佛医学院细胞生物学系，美国马萨诸塞州波士顿02115。

PMID： 9265654
预防性维修识别码： PMC2138038型
内政部： 10.1083/jcb.138.4891

摘要

封闭蛋白是唯一已知的位于紧密连接的膜-膜相互作用点的完整膜蛋白。我们使用非洲爪蟾胚胎作为检测系统来检测：（a）突变occludin在胚胎中的表达是否会破坏紧密连接的屏障功能，以及（b）occludin结构中是否存在靶向连接相互作用位点所需的信号。从一系列COOH末端截短的闭塞素突变体转录的mRNA被微注射到八细胞胚胎的前背卵裂球中。注射后8小时，全长和五个COOH末端截短的蛋白都在紧密连接处检测到，如通过与内源性occludin和闭塞带-1共定位所定义的，这表明外源occludin正确地靶向紧密连接。重要的是，我们的数据表明，包含四个COOH末端截短的闭塞蛋白的紧密连接是泄漏的；顶端细胞之间的细胞间隙被磺基琥珀酰亚胺-6-（生物胺基）己酸盐（NHS-LC-生物素）穿透。相反，注射了编码全长、截短最少或可溶性COOH末端的信使核糖核酸的胚胎对NHS LC生物素示踪剂仍然是不可渗透的。突变的闭塞素诱导的渗漏可以通过与全长闭塞素mRNA共注射来挽救。对去污剂溶解的胚胎膜进行免疫沉淀分析表明，外源闭塞素在体内与内源性爪蟾闭塞素结合，表明闭塞素在紧密连接组装过程中寡聚。我们的数据表明，闭塞蛋白的COOH末端是正确组装紧密连接屏障功能所必需的。我们还首次提供证据表明，在紧密连接组装的正常过程中，闭塞素形成寡聚体。我们的数据表明，突变的闭塞蛋白通过与全长内源性分子齐聚的能力靶向紧密连接。

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数字

图1
全长示意图(*504*)和六个截短的鸡闭塞素蛋白亚克隆到表达载体SP64T中。每个分子都有一个FLAG表位标签(*黑匣子*)在COOH终点处，以区别于爪蟾闭塞素。分子的阴影部分预计会穿过膜四次，并且含有NH₂末端面向细胞质，两个细胞外环结构域和一个细胞质环结构域。预计未着色的一半蛋白质面向细胞质。右边的数字表示每个蛋白质中氨基酸的总数。*计算机断层扫描*，可溶性NH₂-末端20个氨基酸与预测的细胞质尾部融合；N个，新罕布什尔州₂终点；C类，COOH总站。

图2
蛋白质印迹分析爪蟾注射与图1所示闭塞蛋白相对应的mRNA的卵母细胞。将mRNA微注射到第VI期卵母细胞的植物半球，并将注射的卵母细胞在17°C下孵育过夜。卵母细胞匀浆在12%SDS-PAGE上分离，转移到Immobilon膜，然后用抗闭塞素抗体11350免疫印迹(一)或使用抗FLAG单克隆抗体M2(b条). 每条通道顶部的数字标识了图1中命名的每个蛋白质。星号在一和b条指出每个表达蛋白的预测位置。除了可溶性CT外，表达的蛋白质形成如箭头所示的二聚体。请注意，几乎全部COOH末端缺失的蛋白质266未被11350抗体识别。*H（H）₂哦*，控制注射水的卵母细胞。分子量标记（从上到下）：97.4、66、45和31kD。

图3
通过表面生物素化测定紧密连接的功能爪蟾注射鸡全长或截短闭塞素的胚胎。mRNA注射后6 h（2000细胞囊胚），通过在1 mg/ml NHS-LC-生物素中在10°C孵育12 min，清洗胚胎，然后将其固定在80 mM碳酸钠中的3%甲醛中。冰冻切片用RITC-亲和素染色并用荧光显微镜观察。在所有胚胎中，NHS-LC-生物素与卵黄膜、卵黄下间隙和卵裂球顶端质膜中的分子发生反应，这些分子在胚胎表面共同形成一条粗而连续的线。注射504的胚胎紧密连接(一，全长）或486(b条mRNAs中COOH末端截短最少的）阻断物阻止生物素进入细胞间隙，卵裂球基底外侧膜未染色。在注射了385的胚胎中(*c（c）*), 336 (d日) 320 (*e（电子）*)、和266(*（f）*)（四个COOH末端截短的mRNAs），生物素分子渗入细胞间隙，表明紧密连接密封被破坏。棒材，10μm。

图4
全长（504）的闭塞素mRNA与COOH末端截短的闭塞素最大的mRNA（266）共同注射，挽救了仅注射构建物266引起的紧密连接泄漏。实验程序与图3相同。胚胎冷冻切片注射504～2 pg(一), 266 (b条)，或504和266(*c（c）*)构建的mRNA用RITC-亲和素染色。胚胎外空间朝向图的顶部一，并留在b条和*c（c）*。感染504 mRNA的胚胎中未发现渗漏(一). 生物素分子清楚地穿透紧密连接处，并标记注射266mRNA的胚胎顶端细胞之间的细胞间隙(b条). 然而，注射504和266 mRNA的胚胎中没有检测到泄漏(*c（c）*). 棒材，15μm。

图5
冰冻切片的双重标签*非洲爪蟾*含有抗闭塞素11350的胚胎(一)和防FLAG M2(b条). 将突变266mRNA的4nl（～10pg）微注射到八细胞期胚胎的前、后卵裂球中，在室温下孵育8h后冷冻。箭头表示的是爪蟾连接复合体处的全长闭塞素和鸡截短闭塞素。棒材，10μm。

图6
免疫共定位爪蟾ZO-1与突变体266（在爪蟾胚胎。冷冻切片由注射突变266 mRNA的胚胎制成，并用抗ZO-1抗体染色(一)或带防FLAG M2(b条). 箭头表示这两种蛋白质在结合复合体上的共定位。棒材，10μm。

图7
相互作用爪蟾用免疫沉淀法测定鸡体内闭塞素和闭塞素。胚胎被微量注射COOH末端截短的闭塞素mRNA(*266*;一和b条，*左侧车道*)或水(C类;一和b条，*右车道*)并在室温下孵育10小时。均化后，将样品在100000下离心克在4°C下保持30分钟。将膜沉淀溶解在改良的RIPA缓冲液中（见材料和方法），并在100000下离心克在4°C下保持1小时。所得上清液用抗闭塞素11350免疫沉淀(一)或防FLAG M2(b条)在4°C下过夜。用抗FLAG M2免疫印迹免疫沉淀物(一)或抗闭塞素11350(b条). 对应于鸡截断闭塞蛋白的特定带（与图2相比b条，车道*266*)出现在中一(*左车道*)用抗闭塞素11350免疫沉淀后。这个爪蟾在b条(*左车道*)用抗FLAG M2免疫沉淀后。两条厚厚的带子b条是IgG重链。

图8
突变体与内源性闭塞素的协同免疫沉淀不是洗涤剂溶解寡聚物之间单体交换的结果。将汇合的A6细胞单层代谢标记为150μCi/ml[³⁵S] 蛋氨酸/半胱氨酸在27°C下溶解20小时，在非变性条件下溶解，然后与来自爪蟾注射266的胚胎在双细胞期构建mRNA，并在室温下孵育10h。用抗闭塞素11350免疫沉淀后(*左车道*)，防FLAG M2(*中间车道*)或免疫前兔血清(*右车道*)，样品在12%SDS-PAGE上分离并放射自显影。³⁵S标记的闭塞素不能与抗FLAG M2免疫沉淀(*中间车道*)这表明，在提取后将突变体与野生型分子混合不会导致洗涤剂介导的蛋白质单体交换。箭头上方的条表示分子量标记66 kD。

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