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.1997年6月30日；137(7):1469-82.
doi:10.1083/jcb.137.7.1469。

酿酒酵母分泌途径中膜蛋白后期分选的生理调控

K J罗伯格 1, N罗利, C A凯撒
附属公司

酿酒酵母分泌途径中膜蛋白后期分选的生理调控

K J罗伯格等。 J细胞生物学. .

摘要

在哺乳动物细胞中，细胞外信号可以调节特定蛋白质向质膜的递送。我们在酿酒酵母的晚期分泌途径中发现了一个新的调节蛋白分类的例子。在氨或尿素培养基上培养的酵母细胞中，一般氨基酸通透酶（Gap1p）从高尔基复合体运输到质膜，而在谷氨酸培养基上生长的细胞中，Gap1p从高尔基体运输到液泡。我们还发现高尔基体中Gap1p的排序由SEC13控制，SEC13是一个先前显示编码COPII囊泡外壳成分的基因。在氨培养的sec13突变体中，Gap1p从高尔基体运输到液泡，而不是质膜。PEP12是一种从高尔基体到流行隔室的囊泡转运所需的基因，其缺失抵消了sec13突变的影响，并部分恢复了Gap1p向质膜的转运。总之，这些研究表明，氮素敏感机制和Sec13p控制Gap1p从高尔基体到质膜的转运。

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数字

图1
图1
Gap1蛋白表达，但通透活性低在以谷氨酸为底物的细胞中氮源。(A类)野生型单元格表达GAP1-HA型（CKY465）在含有硫酸铵、尿素、谷氨酸或谷氨酰胺作为唯一的氮来源。标记的数量通过SDS-PAGE和抗HA抗体免疫印迹法。每个数量相等蛋白质测定的提取物将分析结果加载到凝胶上。(B类)野生型细胞（CKY443）在含有不同氮的合成培养基中呈指数增长来源。通过过滤收获细胞并悬浮在SFD中，4μM[14C] 添加瓜氨酸。在30秒间隔，并测定与细胞体相关的标记。透皮酶活性表示为瓜氨酸吸收速率相对于氨培养细胞的速率。氨吸收瓜氨酸的绝对速率为31 pmol/min/OD600. (C类)测定了Gap1p非依赖性氨基酸摄取间隙1-Δ1个突变株（CKY445）在补充的合成培养基上生长后加入硫酸铵或谷氨酸。（如上所述，测定野生型菌株的瓜氨酸摄取率。）吸收[14C] -标记的氨基酸脯氨酸、色氨酸、亮氨酸、组氨酸和赖氨酸按上述方法测定。绝对速率氨生长细胞对每种氨基酸的摄取如下：脯氨酸，4.7 pmol/min/OD600; 色氨酸，2.0 pmol/min/OD600; 亮氨酸，2.4 pmol/min/OD600; 组氨酸，18 pmol/min/OD600; 和赖氨酸，36pmol/min/OD600.
图1
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Gap1蛋白表达，但通透活性低在以谷氨酸为底物的细胞中氮源。(A类)野生型单元格表达GAP1-HA型（CKY465）在含有硫酸铵、尿素、谷氨酸或谷氨酰胺作为唯一的氮来源。标记的数量通过SDS-PAGE和抗HA抗体免疫印迹法。每个数量相等蛋白质测定的提取物将分析结果加载到凝胶上。(B类)野生型细胞（CKY443）在含有不同氮的合成培养基中呈指数增长来源。细胞通过过滤收集并悬浮在SFD中，4μM[14C] 添加瓜氨酸。在30秒间隔，并测定与细胞体相关的标记。透皮酶活性表示为瓜氨酸吸收速率相对于氨培养细胞的速率。氨吸收瓜氨酸的绝对速率为31 pmol/min/OD600. (C类)测定了Gap1p非依赖性氨基酸摄取间隙1-Δ1个突变株（CKY445）在补充的合成培养基上生长后加入硫酸铵或谷氨酸。（如上所述，测定野生型菌株的瓜氨酸摄取。）吸收[14C] -标记的氨基酸脯氨酸、色氨酸、亮氨酸、组氨酸和赖氨酸按上述方法测定。绝对速率氨生长细胞对每种氨基酸的摄取如下：脯氨酸，4.7 pmol/min/OD600; 色氨酸，2.0 pmol/min/OD600; 亮氨酸，2.4 pmol/min/OD600; 组氨酸，18pmol/min/OD600; 和赖氨酸，36 pmol/min/OD600.
图1
图1
Gap1蛋白表达，但通透活性低在以谷氨酸为底物的细胞中氮源。(A类)野生型单元格表达GAP1-HA型（CKY465）在含有硫酸铵、尿素、谷氨酸或谷氨酰胺作为唯一的氮来源。标记的数量通过SDS-PAGE和抗HA抗体免疫印迹法。每个数量相等蛋白质测定的提取物将分析结果加载到凝胶上。(B类)野生型细胞（CKY443）在具有不同氮的合成培养基中指数生长来源。细胞通过过滤收集并悬浮在SFD中，4μM[14C] 添加瓜氨酸。在30秒间隔，并测定与细胞体相关的标记。透皮酶活性表示为瓜氨酸吸收速率相对于氨培养细胞的速率。氨吸收瓜氨酸的绝对速率为31 pmol/min/OD600. (C类)测定了Gap1p非依赖性氨基酸摄取间隙1-Δ1个突变株（CKY445）在补充的合成培养基上生长后用硫酸铵或谷氨酸盐。（如上所述，测定野生型菌株的瓜氨酸摄取率。）吸收[14C] -标记的氨基酸脯氨酸、色氨酸、亮氨酸、组氨酸和赖氨酸按上述方法测定。绝对速率氨生长细胞对每种氨基酸的摄取如下：脯氨酸，4.7 pmol/min/OD600; 色氨酸，2.0 pmol/min/OD600; 亮氨酸，2.4 pmol/min/OD600; 组氨酸，18 pmol/min/OD600; 和赖氨酸，36 pmol/min/OD600.
图2
图2
(A类)谷氨酸生长后Gap1p迅速激活细胞转移到尿素培养基。野生型细胞（CKY443）生长在谷氨酸或谷氨酰胺和在转移到尿素。渗透活性通过[14C] 瓜氨酸摄入如上所述。(B类)处理野生型细胞至于A类，但转移到含有1.5μg/ml尿素的培养基中环己酰亚胺。
图3
图3
在生长于谷氨酸的细胞中，Gap1p-HA位于内质网和高尔基体中，但不位于质膜中。(A类)来自野生型的细胞裂解物（CKY465）生长在谷氨酸上，在含有10 mM EDTA的20–60%蔗糖的密度梯度上进行分级。的相对水平通过Western blotting和密度测定法。GDPase（高尔基标记物）通过酶法测定每个组分。每个峰分数的位置标记（这些分数至少包含梯度上总标记的80%）。(B类)野生型细胞裂解物（CKY465）生长在谷氨酸上，然后转移到尿素培养基中，在含有10 mM EDTA的密度梯度上进行分级。(C类)生长在谷氨酸上的野生型（CKY465）细胞裂解物按上述方法进行分级，但密度梯度为2 mM镁2+.
图4
图4
Gap1p向质膜的转运需要分泌小泡。(A类)野生型（CKY443）和秒6-1突变体（CKY517）菌株在24°C的谷氨酸中生长，转移至36°C保持10分钟，然后转移到预热的尿素介质中。Gap1p活性通过[14C] 瓜氨酸吸收。(B类)A类秒6突变体（CKY518）在谷氨酸中生长24°C，切换至36°C 10分钟，然后切换至预热尿素培养基培养20分钟。从该培养物制备的裂解物为在含有20–60%蔗糖的密度梯度上分馏10 mM乙二胺四乙酸。Gap1p-HA和不同亚细胞标记物对每一组分的隔室进行评估，如图2。
图5
图5
Gap1p稳定性第四人民党,秒6和野生型菌株谷氨酸。等基因野生型（CKY520），秒6（CKY518），以及pep4Δ（CKY519）菌株表达间隙1公顷生长于24°C下的谷氨酸。将培养物移到36°C下10分钟，并且细胞蛋白在7分钟脉冲期间被放射性标记[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸后追逐过剩未标记的蛋氨酸和半胱氨酸。免疫沉淀了Gap1p HA，并且标记的Gap1p HA在用磷光成像仪测定不同的追踪时间。
图6
图6
秒13-1突变体大大降低Gap1p活性，但不降低蛋白质水平。(A类)同基因野生型（CKY443）和秒13-1（CKY 444）菌株在24°C的合成培养基中生长，培养基中添加硫酸铵或谷氨酸作为唯一的氮源。Gap1p活性由[14C] 瓜氨酸摄入。(B类)通过CPY成熟动力学分析ER向高尔基体的转运。野生型（CKY443）和秒13-1（CKY444）菌株在24°C的氨水最小培养基中生长。培养物标记为[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸作用5分钟，然后加入过量的未标记蛋氨酸和半胱氨酸。CPY从标记的提取物中进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE进行解析。用荧光成像仪测定p1 CPY和总CPY的数量。将p1 CPY转换为p2和M形式给出了ER的传输速率(C类)的表达式间隙1p英寸秒13-1由α-半乳糖苷酶的表达测定间隙1–lacZ同基因野生型报告融合（pMS29）（CKY522）和秒13-1（CKY523）菌株在24°C氨水培养基中生长。(D类)等基因野生型中的Gap1p HA蛋白水平（CKY465）和秒13-1（CKY466）菌株在24℃氨水培养基中生长，用抗HA抗体进行Western blotting检测。调整装载的提取物量，以获得Gap1p-HA带的等效强度。
图6
图6
秒13-1突变体大大降低Gap1p活性，但不降低蛋白质水平。(A类)同基因野生型（CKY443）和秒13-1（CKY 444）菌株在24°C的合成培养基中生长，培养基中添加硫酸铵或谷氨酸作为唯一的氮源。Gap1p活性由[14C] 瓜氨酸摄入。(B类)通过CPY成熟动力学分析ER向高尔基体的转运。野生型（CKY443）和秒13-1（CKY444）菌株在24°C的氨水最小培养基中生长。培养物标记为[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸作用5分钟，然后加入过量的未标记蛋氨酸和半胱氨酸。从标记提取物中免疫沉淀CPY，并通过SDS-PAGE进行解析。用荧光成像仪测定p1 CPY和总CPY的数量。将p1 CPY转换为p2和M形式给出了ER的传输速率(C类)的表达式间隙1p英寸第13-1节由α-半乳糖苷酶的表达测定间隙1–lacZ同基因野生型报告融合（pMS29）（CKY522）和秒13-1（CKY523）菌株在24°C氨水培养基中生长。(D类)等基因野生型Gap1p-HA蛋白水平（CKY465）和秒13-1（CKY466）菌株在24℃氨水培养基中生长，用抗HA抗体进行Western blotting检测。调节所负载的提取物的量以得到Gap1p HA带的等效强度。
图6
图6
秒13-1突变体大大降低Gap1p活性，但不降低蛋白质水平。(A类)等基因野生型（CKY443）和秒13-1（CKY 444）菌株在24°C的合成培养基中生长，培养基中添加硫酸铵或谷氨酸作为唯一的氮源。Gap1p活性由[14C] 瓜氨酸摄入。(B类)通过CPY成熟动力学分析ER向高尔基体的转运。野生型（CKY443）和秒13-1（CKY444）菌株在24°C的氨水最小培养基中生长。培养物标记为[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸作用5分钟，然后加入过量的未标记蛋氨酸和半胱氨酸。从标记提取物中免疫沉淀CPY，并通过SDS-PAGE进行解析。用荧光成像仪测定p1 CPY和总CPY的数量。将p1 CPY转换为p2和M形式给出了ER的传输速率(C类)的表达式间隙1p英寸秒13-1由α-半乳糖苷酶的表达测定间隙1–lacZ同基因野生型报告融合（pMS29）（CKY522）和秒13-1（CKY523）菌株在24°C氨水培养基中生长。(D类)等基因野生型Gap1p-HA蛋白水平（CKY465）和秒13-1（CKY466）菌株在24℃氨水培养基中生长，用抗HA抗体进行Western blotting检测。调整装载的提取物量，以获得Gap1p-HA带的等效强度。
图6
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秒13-1突变体大大降低Gap1p活性，但不降低蛋白质水平。(A类)同基因野生型（CKY443）和秒13-1（CKY 444）菌株在24°C的合成培养基中生长，培养基中添加硫酸铵或谷氨酸作为唯一的氮源。Gap1p活性由[14C] 瓜氨酸摄入。(B类)通过CPY成熟动力学分析ER向高尔基体的转运。野生型（CKY443）和秒13-1（CKY444）菌株在24°C的氨水最小培养基中生长。培养物标记为[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸作用5分钟，然后加入过量的未标记蛋氨酸和半胱氨酸。从标记提取物中免疫沉淀CPY，并通过SDS-PAGE进行解析。用荧光成像仪测定p1 CPY和总CPY的数量。将p1 CPY转换为p2和M形式给出了ER的传输速率(C类)的表达式间隙1p英寸秒13-1由α-半乳糖苷酶的表达测定间隙1–lacZ同基因野生型报告融合（pMS29）（CKY522）和秒13-1（CKY523）菌株在24°C氨水培养基中生长。(D类)等基因野生型Gap1p-HA蛋白水平（CKY465）和秒13-1（CKY466）菌株在24℃氨水培养基中生长，用抗HA抗体进行Western blotting检测。调整装载的提取物量，以获得Gap1p-HA带的等效强度。
图7
图7
在秒13-1突变体，Gap1p退出ER，但未被传输到质膜。(A类)野生型（CKY465）和秒13-1（CKY466）表达Gap1p-HA的菌株为在24°C的氨水介质中生长，细胞裂解物在20–60%蔗糖的密度梯度含10 mM EDTA。间隙p1p-HA以及不同亚细胞的标记对隔间进行评估每个分数如图3所示。(B类)野生型（CKY465）和秒13-1表达Gap1p-HA的（CKY466）菌株在氨培养基中生长在24°C下，细胞裂解物在20–60%的密度梯度上分馏含1 mM Mg的蔗糖2+.
图8
图8
Gap1p-HA的间接免疫荧光显微镜定位秒13-1,shr3Δ和野生型菌株。野生型（CKY465），秒13-1（CKY466），以及shr3Δ从着丝粒质粒表达Gap1p-HA的（PLY134）菌株在氨中生长培养基，固定在甲醛中，用抗HA和抗Kar2p抗体双重标记。用可视化方法显示小鼠抗HA用罗丹明偶联二抗观察FITC-偶联二抗和兔抗-Kar2p。棒材，2.5μm。
图9
图9
Gap1p从高尔基体运输到液泡秒13-1突变体。(A类)野生型（CKY520），秒13-1（CKY521），和秒13-1 pep4Δ（CKY467）菌株在24°C下生长到指数阶段。培养物标记为[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸作用10分钟，并通过添加过量的未标记的蛋氨酸和半胱氨酸。Gap1p-HA从标记提取物中进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE进行解析使用磷光成像仪进行量化。(B类)Gap1p活性通过[14C] 野生型瓜氨酸摄取（CKY443），秒13-1（CKY444），秒13-1 pep12Δ::TRP1号机组（CKY455），第13-1节结束3-1（CKY456），以及秒13-1 pep4Δ::LEU2级（CKY457）株。(C类)单元格野生型裂解物（CKY465），秒13-1（CKY466），以及秒13-1pep12Δ::TRP1号机组（CKY468）菌株在含有10 mM EDTA的20%–60%蔗糖的密度梯度上进行分离。分数合并含有Pma1p的组分，这些组分中含有Gap1p-HA用抗HA抗体进行Western blotting检测。这个通过Pma1p的定量测定每个提取物中质膜的相对含量。对于A–C，所有菌株均已培养在氨介质中。
图9
图9
Gap1p从高尔基体运输到液泡秒13-1突变体。(A类)野生型（CKY520），第13-1节（CKY521），和秒13-1 pep4Δ（CKY467）菌株在24°C下生长到指数阶段。培养物标记为[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸作用10分钟，并通过添加过量的未标记的蛋氨酸和半胱氨酸。Gap1p-HA从标记提取物中进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE进行解析使用磷光成像仪进行量化。(B类)Gap1p活性通过[14C] 野生型瓜氨酸摄取（CKY443），秒13-1（CKY444），秒13-1 pep12Δ::TRP1号机组（CKY455），第13-1节结束3-1（CKY456），以及秒13-1 pep4Δ::LEU2级（CKY457）菌株。(C类)单元格野生型裂解物（CKY465），秒13-1（CKY466），以及秒13-1pep12Δ::TRP1号机组（CKY468）菌株在含有10 mM EDTA的20%–60%蔗糖的密度梯度上进行分离。分数合并含有Pma1p的组分，这些组分中含有Gap1p-HA用抗HA抗体进行Western blotting检测。这个通过Pma1p的定量测定每个提取物中质膜的相对含量。对于A–C，所有菌株都已生长在氨介质中。
图10
图10
可供选择的运输路线模型晚高尔基体Gap1p的生理调控来源和遗传第13页和政治公众人物12。在生长于无论是氨还是尿素，Gap1p都被包装成Golgi-derived通向质膜的小泡。谷氨酸或秒13-1突变体Gap1p被转移到液泡。这个模型是基于一类特殊的囊泡携带Gap1p的想法到质膜，不受调节的渗透和其他质膜蛋白由一个囊泡类。或者，将Gap1p加载到通用分泌囊泡可以通过Sec13p和氮源调节。
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参考文献

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