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。1997年6月24日；94(13):6658-63.
doi:10.1073/pnas.94.13.6658。

LDH-A的c-Myc反式激活对肿瘤代谢和生长的影响

H垫片 1, C杜德, B C刘易斯, C S吴, G Dang公司, R A Jungmann先生, R Dalla Favera公司, C V党
附属公司

LDH-A的c-Myc反式激活对肿瘤代谢和生长的影响

H垫片等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

癌细胞能够有氧地过量生产乳酸，而正常细胞只有在缺氧时才能进行厌氧糖酵解。肿瘤需氧糖酵解大约在70年前被认识；然而，其分子基础仍然难以捉摸。乳酸脱氢酶-A基因（LDH-A）被鉴定为c-Myc反应基因，其产物参与正常厌氧糖酵解，在人类癌症中经常增加。稳定转染Rat1a成纤维细胞，其仅过度表达LDH-A或经c-Myc转化的成纤维细胞过度产生乳酸。c-Myc介导的转化需要LDH-A的过度表达，因为通过反义LDH-A表达降低其水平会降低c-Myc转化的Rat1a成纤维细胞、c-Myc转换的人类淋巴母细胞和Burkitt淋巴瘤细胞的软琼脂克隆原性。尽管LDH-A的反义表达并不影响c-Myc转化的成纤维细胞在常氧条件下粘附在培养皿上的生长，但这些粘附细胞在缺氧条件下的生长受到抑制。这些观察结果表明，LDH-A水平的增加是转化的球形细胞团生长所必需的，该细胞团具有缺氧的内部微环境。我们的研究将c-Myc与LDH-A的诱导联系在一起，LDH-A表达增加乳酸生成，并且是c-Myc介导的转化所必需的。

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数字

图1
图1
低密度脂蛋白-A是c-Myc的直接靶基因。(A类)核糖核酸酶保护试验显示升高乳酸脱氢酶-A在非粘附Rat1a-Myc（R1a-Myc）和Rat1a（R1a）细胞中的表达（320-bp保护带）。(B类)用来自非粘附细胞的分离细胞核进行的核连续分析表明乳酸脱氢酶-A与Rat1a细胞相比，Rat1a-Myc中的细胞。(C类)Northern blots显示单独接触CHX后表达Myc–ER融合蛋白的细胞系中LDH-A的表达(顶部)或接触CHX和4-HOTM(中部)对于所指示的时间。LDH-A表达相对于波形蛋白mRNA控制的倍数变化如下：1.0，0h；0.9，1小时；2.5小时；2.5小时，8小时。
图2
图2
放松调控的c-Myc表达可提高淋巴细胞中LDH-A mRNA和活性。(A类)显示了CB33淋巴母细胞（第一bar）、c-Myc转化的CB33细胞（第二bar）、Ramos（第三bar）、ST486（第四bar）和DW6（第五bar）Burkitt淋巴瘤细胞系的相对LDH酶活性（a.u.，任意单位）。(B类)显示了通过免疫印迹分析测定的每个细胞系的相应c-Myc蛋白水平。(C类)Northern blot显示所示细胞系中LDH-A mRNA（1.7 kb）水平（如图底部所示）；每条通道装载15μg总RNA，并显示带有18S核糖体RNA带的溴化乙锭染色凝胶作为样本装载的对照。LDH-A mRNA（用18S RNA校正）的倍变化如下：CB33，1.0；CB33-Myc，2.0；拉莫斯，18.2；ST486，5.5；和DW6，10.6。(D类)免疫印迹分析显示每个细胞系的Bcl-2蛋白水平。请注意，与CB33淋巴母细胞（第1和第2道）和其他Burkitt细胞（第3和第5道）相比，ST486细胞系（第4道）显示出大量Bcl-2蛋白。
图3
图3
c-Myc能够反式激活大鼠乳酸脱氢酶-ANIH 3T3细胞中E盒依赖性启动子。上图描述了野生型乳酸脱氢酶-A带有两个电子盒子的启动子（E1和E2)以及E盒mE的相应突变1和mE2图中显示了野生型和突变型乳酸脱氢酶-A启动子-报告子对空载体（RSV）或c-Myc（RSVMyc）表达载体的反应。野生型LDH-A启动子对缺乏HLH区的Myc突变体（RSVMycΔHLH）和转录因子USF（RSVUSF）的反应也显示出来；没有激活双E-box突变报告子。空载体、Myc或USF表达质粒以每60-mm培养皿50 ng的剂量进行脂质感染。数据是四个实验的平均值，显示了标准误差。
图4
图4
c-Myc转化细胞中LDH-A表达降低抑制凤尾鱼非依赖性生长。(A类)混合Rat1a/C（R1a/C）嘌呤霉素耐药对照细胞的LDH-A酶活性（显示标准误差的四个实验的平均值），混合Rat1a-LDH-A（R1a-LDH-A）过度表达乳酸脱氢酶-A、共用Rat1a-Myc/C（R1a-Myc/C）耐嘌呤霉素对照细胞或共用Rat1a-MycAS-LDH-A（R1a-MycAS-LDH-A）与反义乳酸脱氢酶-A显示了表达式。(B类)免疫印迹法显示了与所示细胞系对应的混合细胞系中的人类c-Myc蛋白水平A类.反义表达乳酸脱氢酶-A不影响异位人类c-Myc蛋白水平（比较第三和第四通道）。CRM，交叉反应材料。(C类)该图显示了以下四种混合细胞系的粘附生长率：A类。纵坐标显示所示时间内每个60-mm培养皿的细胞数（显示标准误差的三次重复实验的平均值）。条形图的阴影对应于A类. (D类)Rat1a-Myc/C细胞和Rat1a-MyAS-LDH-A的锚定非依赖性生长试验（显微照片）表明，与LDH-A水平降低相关的菌落形成减少（图表）。数据是两个实验的平均值，显示了标准误差。(E类)核糖核酸酶保护试验证明乳酸脱氢酶-A反义转录物（AS-LDH-A；使用乳酸脱氢酶-A感测探针）；波形蛋白被用作内部控制。(F类)中描述的细胞系厌氧-好氧生长率的比较A类细胞在缺氧室或常规充氧条件下的100 mm塑料培养皿上贴壁生长48 h，并通过三次实验测定细胞数量。
图5
图5
（A） 反义乳酸脱氢酶-A表达降低了c-Myc转化的淋巴母细胞CB33-Myc的克隆形成性。对照组，空载体转染的CB33-Myc细胞接受软琼脂克隆形成试验。形成代表性菌落（克隆效率2×10−4)如上图所示。有了反义，乳酸脱氢酶-A-表达混合克隆CB33-MycAS-LDH-A后，克隆效率降低了4倍，克隆大小减小了。下部面板显示了具有代表性的微细视野。(B类)反义乳酸脱氢酶-A表达降低了DW6-Burkitt淋巴瘤细胞系的克隆原性。将混合、稳定转染的DW6细胞培养在软琼脂中。左边的两个面板代表了一张含有转染空载体（左边的一半）或反义的DW6细胞的培养皿一半的合成照片乳酸脱氢酶-A向量（右半部分）。右侧两个面板放大倍数较高，左侧两个面板显示相同细胞的软琼脂集落。(C类)测定悬浮培养的指示细胞系的生长速率。纵坐标显示了三次重复实验中指定时间内每个60-mm板的细胞数。
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