Endogenous serine protease inhibitor modulates epileptic activity and hippocampal long-term potentiation

doi:10.1523/JNEUROSCI.17-12-04688.1997

.1997年6月15日；17(12):4688-99.

doi:10.1523/JNEUROSCI.17-12-04688.1997。

内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂调节癫痫活动和海马长时程增强

A吕蒂¹, H范德普滕, F M Botteri公司, 我是Mansuy, M Meins公司, U弗雷, G桑西格, C端口, M施穆茨, M Schröder先生, C尼奇, J P Laurent公司, D莫纳德

附属公司

PMID： 9169529
预防性维修识别码： PMC6573330型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.17-12-04688.1997

内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂调节癫痫活动和海马长时程增强

A吕蒂等。神经科学. 1997.

.1997年6月15日；17(12):4688-99.

doi:10.1523/JNEUROSCI.17-12-04688.1997。

作者

A吕蒂¹, H范德普滕, F M Botteri公司, 我是Mansuy, M Meins公司, U弗雷, G桑西格, C端口, M Schmutz先生, M Schröder先生, C尼奇, J P Laurent公司, D莫纳德

附属

¹瑞士巴塞尔CH-4002 F.Hoffmann-La Roche有限公司临床前研究药物部。

PMID： 9169529
预防性维修识别码： PMC6573330型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.17-12-04688.1997

摘要

蛋白酶连接蛋白-1（PN-1）是蛇蛋白超家族的一员，控制细胞外丝氨酸蛋白酶的活性并在大脑中表达。在Thy-1启动子（Thy 1/PN-1）的控制下，大脑中过度表达PN-1或缺乏PN-1（PN-1-/-）的突变小鼠在体内和体外均表现出癫痫活性。Thy 1/PN-1小鼠海马脑片CA1区Theta burst-induced long-time potentiation（LTP）和NMDA受体介导的突触传递增强，PN-1-/-小鼠则减弱。Thy 1/PN-1小鼠GABA介导抑制的代偿性变化表明，大脑PN-1水平的改变导致兴奋性和抑制性突触传递之间的失衡。

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数字

**图1。**
PN-1转基因结构和mRNA和蛋白的神经元表达。A类,*顶部线条*，小鼠Thy 1基因的基因组结构，由四个外显子组成，描述为*实心盒子*.底线，将含有Thy 1/PN-1融合基因的8kb DNA片段引入小鼠生殖系的示意图。B类、大脑总RNA（10μg/lane）的Northern blot分析(B类)，肝脏(锂)，心脏(*H（H）*)，肾脏(*K（K）*)，肺(卢)，后腿肌肉(亩)，皮肤(*Sk公司*)，胃(圣)，睾丸(*Te公司*)，胸腺(*Th（第个）*)和小肠(硅)T1系的成年转基因雄性。为了进行比较，*车道M*含有10μg成年非转基因雄性小鼠的总脑RNA。Northern印迹用³²P标记的大鼠PN-1 cDNA（Sommer等人，1987年）。的位置*28秒*和*18秒*rRNA显示在左边.C类Northern blot分析显示了T1系Thy 1/PN-1和内源性Thy 1转录物的发育表达模式。较大的转录物代表杂交转基因mRNA。较小的mRNA编码内源性小鼠PN-1。用探针探测印迹³²P标记小鼠Thy 1外显子4探针。在出生后第0、2、4、7、11、14、21和90天，从15.5天龄胚胎的头部和解剖的大脑中分离出总RNA（10μg/lane）。的位置*28秒*和*18秒*rRNA显示在左边.D类对来自不同成人大脑区域的组织匀浆进行免疫印迹分析。相比之下，成年非转基因小鼠的蛋白匀浆(*M（M）*)和老鼠(对)也包括在内。45 kDa分子量标记显示在*正确的*.E类在微量凝血酶抑制试验中测试了转基因和非转基因成年小鼠（3只动物/品系）不同脑区蛋白匀浆中PN-1等效活性（丝氨酸蛋白酶抑制剂活性）。所示值是三次或四次测定±SEM的平均值。F类，成人非转基因矢状脑切片（10μm）(*顶部图片*)和转基因(*底部图片*; T2）系小鼠就地与a杂交³⁵S标记的PN-1 cRNA探针。在新皮质的几层中检测到转基因mRNA(数控)，嗅球(*产科医生*)、海马CA区(*HC公司*)，齿状回(*DG公司*)，脑桥(*P（P）*)，髓质(*M（M）*)，中脑(*MB（MB）*)和小脑(*CB（断路器）*). 用T1线获得的图案基本上无法区分（数据未显示）。克，成人非转基因海马体矢状位切片（10μm）(*顶部图片*)和T2系转基因(*底部图片*)用抗鼠PN-1单克隆抗体对小鼠进行免疫细胞化学处理。在中检测到强烈的PN-1免疫反应*CA1公司*转基因小鼠的神经元。T1线的结果基本上无法区分（数据未显示）。

**图2。**
PN-1过度表达小鼠（Thy 1/PN-1）表现出*在体外*癫痫样活动。A类，通过刺激Schaffer侧支诱发并记录在CA1区锥体层的场电位示例。通过重复刺激（1 Hz持续30秒），Thy 1/PN-1小鼠的切片显示多峰现象增加（即多个群体峰，箭头)与同窝对照小鼠相比。B类，Thy 1/PN-1切片中重复刺激期间多棘出现的时间进程（次级棘的面积表示为第一个群体棘的面积的百分比）(*实体符号*)和同窝对照小鼠(*打开的符号*;n个=8只动物/每组8片；方差分析，第页=0.01（对于面积测量）。

**图3。**
PN-1过度表达小鼠(*您的1/PN-1*)表现出增强的LTP和NMDA受体介导的EPSC的较慢衰变。中的数据A类和B类从场电位的细胞外记录中获得。中的数据*C–F*从诱发EPSCs的全细胞记录中获得。A类Thy 1/PN-1切片CA1层放射状记录的θ突发刺激（TBS）诱发的场EPSP的LTP(*实体符号*)和同窝对照小鼠(*打开的符号*;n个=6只动物/每组12片；方差分析，第页< 0.05). 调整基线刺激强度，以诱发fEPSP，其振幅等于其最大振幅的30%（没有叠加的群体峰）。通过使用TBS范式（Larson和Lynch，1986）诱导LTP，该范式由间隔8秒的两个序列组成。TBS期间刺激脉冲的持续时间增加了一倍。*地下一层*，TBS之前和之后50分钟记录的三个连续fEPSP的平均值(箭头)Thy 1/PN-1和同窝对照小鼠的切片。*地下二层*、Thy 1/PN-1切片中TBS诱发的重叠突触后爆发(箭头)和室友控制小鼠。C类，突触EPSC的非NMDA成分（双成分EPSC的初始斜率）与Thy 1/PN-1中CA1锥体细胞记录的保持电位的关系图(*实体符号*;n个=8个细胞/6只动物）和来自同窝对照小鼠(*开放符号；n个*=7个细胞/6只动物）。将所有值归一化为在−60 mV下获得的测量值。D类，NMDA受体介导的EPSCs峰值振幅与Thy 1/PN-1中CA1锥体细胞记录的保持电位的关系图(*实体符号*)和室友控制小鼠(*打开的符号*;n个=7个细胞/每组6只动物）。将所有值归一化为在−60 mV下获得的测量值。在50μV的条件下记录NMDA受体介导的EPSC米CNQX，可被25μ米d日（−）-2-氨基-5-磷酸(d日-AP5）。E类，峰值NMDA受体介导的EPSCs与峰值突触EPSCs（主要代表非NMDA成分）的比值，记录在−40 mV(n个=7个细胞/6只动物）。这个*顶部记录道*显示NMDA受体介导的EPSC，以及*底部痕迹*显示Thy 1/PN-1和同窝对照小鼠在−40 mV时记录的突触EPSCs（连续六次扫描的平均值）。F类，NMDA受体介导的EPSC（−40 mV）衰减至其峰值振幅的50%所需的时间(n个=7个细胞/6只动物；学生的t吨测试，第页<0.05）在野生型和Thy 1/PN-1小鼠中的表达(*打开的符号*和*实体符号*分别代表单个值和平均值±SEM）。样品踪迹是Thy 1/PN-1切片中在−40 mV下记录的六次连续扫描的平均值(箭头)和室友控制小鼠。

**图4。**
PN-1过度表达小鼠（Thy 1/PN-1）表现出配对脉冲抑制减少，电压依赖正常，快速IPSC衰退更快。数据是通过不连续单电极电压灯模式下的传统细胞内记录获得的。A类，第二个IPSC的振幅图，作为Thy 1/PN-1中CA1锥体细胞记录的第一个IPSC百分比(*实体符号*)和室友控制小鼠(*打开的符号*)保持电位为−55 mV(n个=每组7个细胞/6只动物；方差分析，第页< 0.05). 在50μ米CNQX和25μ米d日-灌注介质中的AP5。记录电极包含50米米QX-314阻止慢速IPSC。快速IPSC可以被50μ米苦毒毒素。B类，最大快速IPSC峰值振幅与保持电位的关系图。C类，快速IPSC（−55 mV）衰减至其峰值振幅的50%所需的时间(n个=7个细胞/6只动物；学生的t吨测试，第页< 0.05;*打开的符号*和*实体符号*分别代表单个值和平均值±SEM）。样品踪迹是Thy 1/PN-1切片中在−55 mV下记录的六次连续扫描的平均值(箭头)和室友控制小鼠。

**图5。**
通过ES细胞中的同源重组产生PN-1缺陷小鼠（PN-1−/−）。A类，野生型PN-1基因和靶向载体的结构。这个*自动液位计*PN-1基因的起始密码子被插入PyTKNeo表达盒破坏，该盒在ES细胞中产生G418耐药性。同时，外显子2的99 bp被删除。单纯疱疹病毒胸苷激酶(*TK公司*)在PN-1同源区的3′端添加表达盒，以便针对随机整合事件进行选择。将线性化的靶向载体电穿孔到E14 ES细胞中，并通过PCR分析筛选对G418和更昔洛韦均耐药的克隆进行同源重组。在80个单个ES细胞克隆中，有12个被证明是理想靶向事件的潜在候选细胞。使用靶向结构中未包含的PN-1基因组DNA探针进行Southern blot分析，结果显示12个克隆中有10个具有正确靶向的PN-1等位基因的预期结构（数据未显示）。尼奥、新霉素表达盒；*TK公司*，单纯疱疹病毒胸苷激酶表达盒；*蓝皮书*，矢量序列。PN-1编码区域表示为*填满的盒子*.B类Northern blot分析从纯合PN-1缺陷（−/−）、杂合（+/-）和野生型（+/+）成年小鼠大脑中提取的总RNA（10μg/lane）。Northern印迹用³²P标记的大鼠PN-1 cDNA（Sommer等人，1987年）。的位置*28秒*和*18秒*rRNA显示在*正确的*.C类，使用抗鼠PN-1单克隆抗体对纯合PN-1缺陷（−/−）、杂合（+/-）和野生型（+/+）成年小鼠的脑匀浆进行免疫印迹分析。45 kDa(*45千D*)分子量标记显示在*正确的*.

**图6。**
PN-1缺陷小鼠(*PN-1−/−*)展览*在体外*癫痫样活动。A类，通过刺激Schaffer侧支诱发并记录在CA1区锥体层的场电位示例。重复刺激（1 Hz持续30秒）后，PN-1−/−的切片显示多峰现象增加（即多个群体峰值，箭头)与同窝对照小鼠相比。B类，在PN-1−/−的切片中，重复刺激期间出现多峰的时间进程（次级峰的面积表示为第一个群体峰面积的百分比）(*实体符号*)和同窝对照小鼠(*打开的符号*;n个=每组5只动物/10片；方差分析，第页<0.05（对于面积测量）。

**图7。**
PN-1缺陷小鼠(*PN-1−/−*)表现出LTP降低和NMDA受体介导的EPSC成分减少。数据输入A类和B类从场电位的细胞外记录中获得。中的数据*C–F*从诱发EPSCs的全细胞记录中获得。A类PN-1−/−切片CA1层放射状记录的θ突发刺激（TBS）诱导的场EPSP的LTP(*实体符号*)和同窝对照小鼠(*打开的符号*;n个=9只动物/每组13片；方差分析，第页< 0.05). 调整基线刺激强度，以诱发fEPSP，其振幅等于其最大振幅的30%（没有叠加的群体峰）。如图3所示诱导LTP。*地下一层*，TBS之前和之后50分钟记录的三个连续fEPSP的平均值(箭头)切片，来自*PN-1−/−*和室友控制老鼠。*地下二层*、PN-1−/−和同窝对照小鼠脑片中TBS诱发的重叠突触后爆发(箭头).C类，突触EPSC的非NMDA成分（双成分EPSC的初始斜率）与PN-1−/−中CA1锥体细胞记录的保持电位的关系图(*实体符号*;n个=7个细胞/7只动物）和来自同窝对照小鼠(*开放符号；n个*=7个细胞/6只动物）。将所有值归一化为在−60 mV下获得的测量值。D类，NMDA受体介导的EPSCs峰值振幅与PN-1−/−中CA1锥体细胞记录的保持电位的关系图(*实体符号*;n个=7个细胞/7只动物）和来自同窝对照小鼠(*开放符号；n个*=7个细胞/6只动物）。将所有值归一化为在−60 mV下获得的测量值。在50μV的条件下记录NMDA受体介导的EPSC米CNQX和被25μ米d日-AP5。E类，峰值NMDA受体介导的EPSCs与峰值突触EPSCs（主要代表非NMDA成分）的比值，记录在−40 mV(n个=7个细胞/7只和6只动物；学生的t吨测试，第页< 0.01). 这个*顶部记录道*显示NMDA受体介导的EPSC，以及*底部痕迹*显示在−40 mV下记录的突触EPSC（连续六次扫描的平均值）*PN-1−/−*和室友控制老鼠。F类，NMDA受体介导的EPSC（−40 mV）衰减到其峰值振幅的50%所需的时间(n个=7个细胞/7和6只动物）*PN-1−/−*和室友控制老鼠(*打开的符号*和*实体符号*分别代表个体值和平均值±SEM）。样品踪迹是以−40 mV的电压在切片中记录的六次连续扫描的平均值*PN-1−/−*和室友控制老鼠。

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1. Anderson WW、Swartzwelder HS、Wilson WA。NMDA受体拮抗剂2-氨基-5-磷酸戊酸能阻止刺激性训练诱导的癫痫发生，但不能阻止大鼠海马脑片中的癫痫样发作。神经生理学杂志。1987;57:1–21.-公共医学
1. Baker JB、Low DA、Simmer RL、Cunningham DD。蛋白酶连接蛋白：一种连接凝血酶和纤溶酶原激活剂并调节其与细胞结合的细胞成分。单元格。1980;21:37–45.-公共医学
1. Blanton M，LoTurco J，Kriegstein A.从爬行动物和哺乳动物皮层切片中的神经元进行全细胞记录。神经科学方法杂志。1990;30:203–210.-公共医学
1. Bliss TVP，Collingridge GL。记忆的突触模型：海马体的长期增强。自然。1993;361:31–39.-公共医学

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[2] Alger BE和Nicoll RA。体外研究大鼠海马锥体细胞的前馈树突状抑制。生理学杂志（伦敦）1982；328:105–123.-项目管理咨询公司-公共医学

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[5] Baker JB、Low DA、Simmer RL、Cunningham DD。蛋白酶连接蛋白：一种连接凝血酶和纤溶酶原激活剂并调节其与细胞结合的细胞成分。单元格。1980;21:37–45.-公共医学

[6] Baker JB、Low DA、Simmer RL、Cunningham DD。蛋白酶连接蛋白：一种连接凝血酶和纤溶酶原激活剂并调节其与细胞结合的细胞成分。单元格。1980;21:37–45.-公共医学

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