Multiple determinants direct the orientation of signal-anchor proteins: the topogenic role of the hydrophobic signal domain

doi:10.1083/jcb.137.3.555

.1997年5月5日；137(3):555-62.

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多个决定簇指导信号锚定蛋白的定位：疏水信号域的拓扑学作用

J M Wahlberg（J M沃尔伯格）¹, M间谍

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PMID： 9151664
预防性维修识别码： PMC2139883型
内政部： 10.1083/jcb.137.3555

多个决定簇指导信号锚定蛋白的定位：疏水信号域的拓扑学作用

J M Wahlberg（J M沃尔伯格）等。 J细胞生物学. 1997.

.1997年5月5日；137(3):555-62.

doi:10.1083/jcb.137.3555。

作者

J M Wahlberg（J M沃尔伯格）¹, M间谍

附属

¹瑞士巴塞尔大学Biozentrum。

PMID： 9151664
预防性维修识别码： PMC2139883型
内政部： 10.1083/jcb.137.3555

摘要

内质网膜中信号锚定蛋白的取向在很大程度上取决于非极性、跨膜结构域两侧的带电残基，并受NH2末端序列折叠特性的影响。然而，这些特性通常不足以确保唯一的拓扑结构。通过在COS-7细胞中表达去唾液酸糖蛋白受体亚基H1的突变体，在体内研究了疏水信号结构域的拓扑形成作用。通过将野生型和突变H1的19-残基跨膜片段替换为7-25个亮氨酸残基，我们发现非极性序列的长度和疏水性显著影响蛋白质定向。NH2末端的易位受长的疏水性序列和短的COOH末端易位的影响。跨膜结构域、侧翼电荷和亲水NH2末端部分的拓扑贡献是相加的。这些决定因素的组合足以在任一方向上实现独特的膜插入。

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数字

图1
突变体H1ΔLeu19表达为两种不同的糖基化形式。(A类)如图所示，用H1、H1Δ、H1Leu19、H1△Leu19和HC（H1的外质部分带有流感病毒血凝素的可裂解信号序列）的cDNA转染COS-7细胞。将转染细胞标记30分钟[³⁵S] 蛋氨酸，溶解，并使用针对H1的COOH末端序列的抗血清进行免疫沉淀。免疫沉淀物通过凝胶电泳和荧光分析。(B类)免疫沉淀物在不使用（−）或使用内糖苷酶H的情况下处理(E类)在凝胶电泳分析之前。标记蛋白的位置以kD表示其分子量。星号表示的带代表部分糖基化物种（见正文）。

图2
突变体H1ΔLeu19的未糖基化形式以反向插入膜中。(A类)皂苷提取：用指示的构建物转染细胞，标记并用0.1%皂苷提取。皂苷提取物(*S公司*)和剩下的细胞(C类)分别进行免疫沉淀和凝胶电泳及荧光分析。将未处理的细胞溶解并免疫沉淀，作为总物质的测量(*TOT公司*)。(B类)碱提取：将转染和标记的细胞均匀化并在pH 11.5下培养。样品要么直接免疫沉淀(*TOT公司*)或分离成颗粒后(*P（P）*)和上清液部分(*S公司*)。(C类)蛋白酶保护：标记转染细胞，使其均质，并在无（−）或有胰蛋白酶的情况下培养(T型)或在洗涤剂存在下使用胰蛋白酶(*技术总监*)。免疫沉淀物通过SDS-凝胶电泳和荧光法进行分析。星号表示的带代表部分糖基化的物种。(D类)结构体H1Δ和H1△Leu19的膜方向示意图。H1序列显示为黑色，Leu₁₉域作为一个空矩形。糖基化位点如开放圆圈所示，N-连接聚糖如闭合正方形所示。

图4
不同疏水结构域对H1、H1Δ和H1△Q膜插入的影响。构造H1(A类)，H1Δ(B类)和H1ΔQ(C类)具有野生型跨膜结构域H1（lane1)或具有由7–25个亮氨酸残基组成的疏水段（lanes2–8)在COS-7细胞中表达，标记、免疫沉淀，并通过凝胶电泳和荧光分析。通过皂苷提取评估膜整合(D类)和蛋白酶敏感性(E类)所示为具有7个亮氨酸的最短疏水段的结构体（参见图2的图例）。指出了29和35 kD标记蛋白的位置。

图3
H1突变结构体信号锚定域的氨基酸序列。列出了疏水性跨膜片段及其侧翼序列。H1-4g和H1-4gLeu#与H1-4和H1-4Leu#相同，除了在NH中天冬酰胺-13之后插入三肽序列MTM₂末端部分，它产生一个潜在的糖基化位点。

图6
不同疏水结构域对H1-4和H1-4g膜插入的影响。构造H1-4(A类)和H1-4g(B类)具有野生型跨膜结构域H1（车道1和2)或具有由7–25个亮氨酸残基组成的疏水段（lanes3–14)在COS-7细胞中表达，标记并免疫沉淀。样品在不使用（−）或使用内糖苷酶H的情况下进行处理(E类)在凝胶电泳和荧光分析之前。

图7
量化构造H14Leu#和H1-4gLeu#的拓扑。插入实验，包括图6所示的插入实验。6通过荧光图的密度扫描进行量化。一次糖基化蛋白质的部分，即含N_{外显（exo）}/C类_细胞周期方向，表示为图5图例中所述的所有形状总数的百分比。H14Leu#的值代表三个或更多实验的平均值，具有标准偏差；H1-4gLeu#代表同时进行的单个测定。

图5
信号锚突变体的拓扑结构。插入实验，包括图4所示的实验，通过荧光仪的密度扫描进行量化。未糖基化蛋白质的分数，即含N_{外显（exo）}/C类_细胞周期方向，以所有形式的总数的百分比表示。带有多亮氨酸结构域的构建物的值绘制为该片段中亮氨酸数量的函数(卢#)。与野生型H1跨膜段对应的结构如右图所示(重量)。这些值表示三个或多个实验的平均值和标准偏差。

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1. 带正电残基是膜蛋白拓扑结构的重要决定因素。生物化学科学趋势。1990;15:253–257.-公共医学
1. Denzer AJ，Nabholz CE，Spiess M.信号锚定蛋白的跨膜取向受折叠状态的影响，但不受N末端结构域的大小的影响。欧洲微生物生物器官杂志，1995年；14:6311–6317.-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Andrews DW、Young JC、Mirels LF、Czarnta GJ。N区在信号序列和信号锚定功能中的作用。生物化学杂志。1992;267:7761–7769。-公共医学

[2] Andrews DW、Young JC、Mirels LF、Czarnta GJ。N区在信号序列和信号锚定功能中的作用。生物化学杂志。1992;267:7761–7769。-公共医学

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[4] Beltzer JP、Fiedler K、Fuhrer C、Geffen I、Handschin C、Wessels HP、Spiess M。带电残基是信号锚定序列跨膜取向的主要决定因素。生物化学杂志。1991;266:973–978.-公共医学

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[6] Cullen BR。真核表达技术在克隆基因功能分析中的应用。方法酶制剂。1987;152:684–704.-公共医学

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[8] 带正电残基是膜蛋白拓扑结构的重要决定因素。生物化学科学趋势。1990;15:253–257.-公共医学

[9] Denzer AJ，Nabholz CE，Spiess M.信号锚定蛋白的跨膜取向受折叠状态的影响，但不受N末端结构域的大小的影响。欧洲微生物生物器官杂志，1995年；14:6311–6317.-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Denzer AJ，Nabholz CE，Spiess M.信号锚定蛋白的跨膜取向受折叠状态的影响，但不受N末端结构域的大小的影响。欧洲微生物生物器官杂志，1995年；14:6311–6317.-项目管理咨询公司-公共医学

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