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.1997年5月13日；94(10):5113-8.
doi:10.1073/pnas.94.10.5113。

抗凋亡蛋白Bcl-2的通道形成

S L Schendel公司 1, Z Xie（音译）, M O蒙塔尔, S松山, M蒙塔尔, J C里德
附属公司

抗凋亡蛋白Bcl-2的通道形成

S L Schendel公司等。 美国国家科学院程序. .

摘要

Bcl-2是凋亡调节蛋白大家族的原型成员，由细胞死亡的阻滞剂和促进剂组成。Bcl-2同源物Bcl-XL的三维结构表明，它与白喉毒素和细菌性大肠杆菌素的成孔域极为相似，这促使人们探索Bcl-2是否能够在脂质膜中形成孔。以KCl负载的单层脂质囊泡的氯化物流出为检测手段，纯化的重组Bcl-2蛋白表现出与细菌毒素、白喉毒素和大肠杆菌素类似的成孔活性，即对低pH值和酸性脂质膜的依赖性。相反，缺乏两个核心疏水性α螺旋（螺旋5和6）的Bcl-2突变体，被预测为膜插入和通道形成所需，只产生非特异性作用。在可以检测到单个通道的平面脂质双层中，Bcl-2形成了离散的离子导电、阳离子选择性通道，而Bcl-2（Deltah5，6）突变体没有。观察到的最常见电导（在pH 7.4的0.5 M KCl中18+/-2 pS）与Bcl-2二聚体产生的四螺旋束结构一致。然而，也检测到较大的通道电导（41+/-2 pS和90+/-10 pS），发生率逐渐降低，这意味着在膜中逐步形成较大的Bcl-2低聚物。因此，这些发现提供了Bcl-2在脂质膜中形成通道的生物物理证据，表明这种抗凋亡蛋白具有新的功能。

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图1
图1
Bcl-2在含有酸性脂质体的脂质体中形成依赖于pH的孔隙。(A类)他的6-Bcl-2（ΔTM）蛋白(左边)和变种人His6-Bcl-2（Δh5，6）（ΔTM）蛋白(正确的)用Ni-亲和层析纯化。His的考马斯染色SDS/PAGE凝胶6-Bcl-2（ΔTM）和他的6-显示Bcl-2（Δh5，6）（ΔTM）蛋白，表明完整重组蛋白的纯度>95%（分子质量标记以千道尔顿为单位）。(B类)将Bcl-2和大肠杆菌素E1蛋白质与Cl进行对比−pH 4.0条件下，含KCl的70%DOPC/30%DOPG脂质体流出。伊斯6-Bcl-2（ΔTM）(b条)或大肠杆菌素E1(一)已在添加t吨0在戊二酸二甲酯缓冲液中，分别为≈350ng/ml和50ng/ml。箭头表示添加0.1%的Triton X-100以释放残留的Cl−从小泡中。(C)Bcl-2介导的（300 ng/ml）Cl−比较了不同pH值（包括pH 4.0）下的流出量(一), 4.5 (b条), 5.0 (c（c）), 5.5 (d日)、和6.0(e（电子）). (D类)野生型(一,b条)和突变型(c（c）,d日)评估Bcl-2蛋白诱导Cl的能力−酸性70%DOPC/30%DOPG流出(一,c（c）)和中性100%DOPC(b条,d日)小泡。箭头表示添加0.1%Triton X-100以诱导释放残余Cl−(E类)野生型His6-Bcl-2（ΔTM）(一,b条)和变种人His6-Bcl-2（Δh5，6）（ΔTM）(c（c）,d日)比较70%DOPC/30%DOPG脂质体中的蛋白质（300 ng/ml）。氯−在pH 4.0下测量流出量(一,c（c）)和5.5(b条,d日).
图2
图2
Bcl-2在平面脂质双层中形成离散的通道。在添加1 mM CaCl的对称0.5 M KCl中，从预成型脂质双层中获得单通道记录2和10 mM Hepes，添加50μg/ml His后pH值为7.46-Bcl-2（ΔTM）蛋白。闭合（C）和开放（O）状态的电流由实线表示。虚线定义了用于区分状态之间转换的范围集，并基于信噪比测量（33）。对于在+100 mV下获得的记录(A类–F类)，向上偏转表示通道开口，而向下偏转表示−100 mV时的通道开口(G公司–我). 当前直方图和高斯拟合(C,F类,我,我)反映在−100 mV≤V≤100 mV范围内从持续几分钟的记录的连续段中获得的结果。(A类–C)选择用于演示41±2 pS通道的记录，其中A类和B类是具有代表性的当前记录C是数据高斯拟合的当前直方图，显示了打开（O）和关闭（C）信道状态的相对发生率。该记录来源于在不存在20pS通道的情况下发生的40pS通道活性的突发。通道关闭的概率(P（P）c（c）)≥0.9，在这些实验条件下。明渠寿命（τo（o）)对于γ=41 pS电导通道，由两个指数τ的和很好地拟合o1=6.4±1毫秒，τ氧气=11.2±3 msec，关闭时间为τc1级= 0.6 ± 0.2, τ二氧化碳=17.7±3.0毫秒(n个= 3).D类–F类演示18±2 pS通道，其中D类显示了通道大部分关闭的记录（在所呈现的时间过程中有五个开口），E类通道在所示时间内大部分打开的示例（注意≈250毫秒后第二≈20 pS通道的瞬态打开），以及F类表示当前直方图。数据来源于纯≈20 pS通道活性的突发。选择用于直方图准备的记录区域偏向于高频通道打开的一段时间，即使对于这个≈20 pS的小通道，也要显示高信噪比。(G公司–我)在−100 mV（向下偏转）下记录的≈40 pS（用实线和侧面虚线标记）和≈20 pS（未标记）地震道的示例，显示出与+100 mV下记录相似的特性。本记录中显示的≈20 pS和≈40 pS通道活性的混合物比表1中显示的单电导通道活性更为典型的Bcl-2通道形成A类–F类为了便于说明。当前直方图(我)注意到≈20 pS（O）的开路状态的发生频率1)约40 pS（O2)通道，代表≈20 pS和≈40 pS通道占据闭合和开放状态的相对时间。(J型–我)不太常见的90±10 pS通道。注意散布的≈20 pS和≈40 pS电导。（≈40 pS通道用实线表示以进行比较。）当前直方图(我)表明≈20 pS（O1)，≈40 pS（O2)，且≈90 pS（O三)频道。≈90 pS通道出现次数太少，无法在图中直观地识别。提交的特定记录(J型,K（K）)偏向于显示这种较大电导通道活动的示例。
图3
图3
pH5.4时脂质双层中的Bcl-2通道。在对称的0.5 M KCl，1 mM CaCl中，脂双层显示出单通道记录2加入50μg/ml His后将pH调节至5.46-Bcl-2（ΔTM）蛋白。(A类–C)样本记录获取于V（V）=100 mV，显示26 pS通道的出现。D类-F类与记录对应V（V）=−100 mV，显示10 pS和20 pS的通道。其他条件如图2所示。
图4
图4
Bcl-2（Δh5，6）突变体不能形成通道。含有His的脂质双层膜的膜电流6-Bcl-2（ΔTM）(A类)缺失螺旋5和6的缺失突变体(B类). 最终蛋白质浓度为50μg/ml。在100 mV的对称0.5 M KCl、1 mM CaCl中记录的电流2，5 mM Hepes，pH 7.4。注意，与野生型Bcl-2产生的方形事件相比，缺失突变体产生的膜电流出现了杂散、不稳定的波动。七个实验的数据代表。
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