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。1997年4月7日；137(1):231-45.
doi:10.1083/jcb.137.1.231。

整合素阻断抗体在三维培养和体内逆转人乳腺细胞恶性表型

V M织布 1, O W彼得森, F王, C A拉拉贝尔, P Briand公司, C Damsky公司, M J Bissell先生
附属公司

整合素阻断抗体在三维培养和体内逆转人乳腺细胞恶性表型

V M织布等。 J细胞生物学。 。

摘要

在一个最近开发的人类乳腺癌模型中，用抑制性β-整合素抗体或其Fab片段在三维培养基中治疗肿瘤细胞，导致显著的形态和功能恢复到正常表型。刺激性β-整合素抗体被证明无效。新形成的回复腺泡重新组装了基底膜，重新建立了E-钙粘蛋白-连环蛋白复合物，并重新组织了它们的细胞骨架。同时，他们下调细胞周期蛋白D1，上调p21（cip，wat-1），并停止生长。用相同抗体处理的肿瘤细胞注射到裸鼠体内后，裸鼠体内肿瘤的数量和大小都显著减少。其他整合素的组织分布也被标准化，表明不同整合素途径和粘附连接之间存在密切的相互作用。另一方面，当用α6或β4功能改变抗体治疗时，非恶性细胞继续生长，并且具有类似于未治疗肿瘤集落的紊乱集落形态。这表明α6/β4异二聚体在指导极性和组织结构方面具有重要作用。当细胞分离并去除抗体时，观察到的表型是可逆的。我们的结果表明，细胞外基质及其受体决定了乳腺上皮细胞的表型，因此在这个模型系统中，组织表型占主导地位，而细胞基因型占主导地位。

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图1
图1
HMT-3522人类乳腺癌模型的特征。(一和一′）非恶性S-1细胞集落的相差显微照片(一)和致瘤T4-2细胞集落(一'）直接在EHS内观察形态：S-1细胞形成球形结构，使人联想到真正的腺泡(一)而T4-2细胞形成不规则的大菌落(一′). (b条和b条′）基底膜成分的免疫染色：S-1腺泡(b条)细胞外基质连接处的基底膜蛋白染色如预期，而肿瘤集落中的基底膜沉积(b条（′）明显杂乱无章，不再两极分化。层粘连蛋白获得了类似结果（未显示）。(c（c）和c（c）冷冻切片集落共聚焦荧光显微镜下E-cadherin:S-1腺泡免疫染色(c（c）)E-cadherin主要在细胞-细胞连接处染色，这在正常乳腺切片中常见。T4-2菌落(c（c）′）呈点状、弥散膜状和细胞内染色。(d日)β-catenin–E-cadherin相互作用比率作为粘附连接组装的测量指标：与S-1腺泡相比，T4-2细胞中与E-cadherin共沉淀的β-catenin蛋白减少了50%。数据表示为来自两个单独实验副本的β-catenin和E-cadherin密度测量值的比率。α-catenin也观察到类似结果（未显示）。(e（电子）)E-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素总水平的免疫印迹：S-1腺泡和T4-2菌落中三种粘附蛋白的水平相当。(（f）和克)S-1腺泡和T4-2菌落中胸腺嘧啶和Ki-67标记的百分比，表示为3~4个单独实验中的胸腺嘧啶和Ki-67标记指数：超过90%的S-1腺瘤生长受阻(（f）)，并已退出细胞周期(克)而T4-2菌落仍在积极生长(（f）)并继续循环(克). 在EHS中10–12天后对所有培养物进行分析。条形图：(一和一′）16μm；(b条和b条′）25μm；(c（c）和c（c）′）8μ。
图2
图2
HMT-3522细胞三维培养中整合素的免疫荧光特性。(a–d)S-1腺泡和(一′–d日′）T4-2菌落，免疫染色并用共焦荧光显微镜检查β1-的定位(一和一′), β4- (b条和b条′), α6- (c（c）和c（c）′）和α3-整合素(d日和d日′）定位：β1-、β4-和α6-整合素靶向S-1腺泡的细胞-ECM连接(a–c)相反，在T4-2菌落中(一′–c（c）′）这种极化基态分布消失了。S-1腺泡显示基底外侧α-3整合素(d日)，而T4-2菌落(d日)显示该整合素的质膜和胞浆表达紊乱。所有培养物在EHS内10-12天后进行分析。条形图：(a–d和一′–d日′）16μm。
图3
图3
HMT3522细胞三维培养后整合素的生化特性。(一和b条)β1-和β4-整合素的西方分析：S-1和T4-2菌落的总细胞裂解物显示β1-的表达升高(一)和β4-整合素(b条)在肿瘤细胞集落中。(c（c）和d日)使用生物素化的β1-和β4-整合素异二聚体的细胞表面表达：肿瘤集落的β1-质膜水平高12.5%(c（c）)但β4整合素异二聚体水平降低了60%(d日)S-1腺泡。(e（电子）)相对扫描单位（RSU）显示β1-和β4-整合素异二聚体的相对菌落表面水平：与S-1腺泡相比，T4-2菌落细胞表面的β1-整合素与β4-整整素的比率相对增加了2.8倍。在EHS中10–12天后对所有细胞进行分析。
图3
图3
HMT3522细胞三维培养后整合素的生化特性。(一和b条)β1-和β4-整合素的西方分析：S-1和T4-2菌落的总细胞裂解物显示β1-的表达升高(一)和β4-整合素(b条)在肿瘤细胞集落中。(c（c）和d日)使用生物素化的β1-和β4-整合素异二聚体的细胞表面表达：肿瘤集落的β1-质膜水平高12.5%(c（c）)但β4整合素异二聚体水平降低了60%(d日)S-1腺泡。(e（电子）)相对扫描单位（RSU）显示β1-和β4-整合素异二聚体的相对菌落表面水平：与S-1腺泡相比，T4-2菌落细胞表面的β1-整合素与β4-整整素的比率相对增加了2.8倍。在EHS中10–12天后对所有细胞进行分析。
图4
图4
抑制性β1-整合素功能阻断抗体诱导HMT-3522细胞凋亡。用抑制性β1-整合素抗体处理S-1和T4-2培养物4d后，在三维培养物中计算凋亡标记指数：70%以上的S-1细胞在用β1-整整素功能阻断抗体（S-1β1）孵育4d内发生凋亡而同型对照组（S-1IgG）的基础细胞凋亡水平低于5%。相比之下，经类似处理的T4-2细胞（T4β1）是难治性的，其凋亡率与基础水平（T4-2 IgG）相当。结果是3-6个重复试验的平均值和SE。
图5
图5
β1抑制性抗体治疗肿瘤细胞可导致腺泡回复。(a–a肌动蛋白的共聚焦荧光显微镜图像：S-1(一)和T4-β1还原的腺泡(一′′）显示基底定位细胞核（碘化丙啶）和有组织的丝状F-actin（FITC），而T4-2模拟处理集落（T4-2 IgG）则有无组织、孵化的肌动蛋白束和多形核(一′). (b–b“”）E-cadherin（FITC）和β-catenin（德克萨斯红）的共焦免疫荧光显微镜图像：In S-1(b条)和T4-β1还原的腺泡(b条′′）、E-cadherin和β-catenins在细胞-细胞连接处共定位和重叠。(c（c）)β1-整合素功能阻断抗体对肿瘤细胞转化效率的定量分析：大于95%的S-1和T4-β1菌落被评为有组织，而97%的T4-2 IgG菌落被视为无组织。其他逆转标准，如肌动蛋白和钙粘蛋白组织的评分也产生了可比较的结果（未显示）。(d日)3-5次实验中S-1腺泡、T4-2 IgG集落和T4β1腺泡中的每集落细胞数：S-1和T4-β1回复性腺泡均含有6-8个细胞，而T4-2-IgG肿瘤集落在10-12天后得分时含有18-22个细胞(d日). (e（电子）)S-1、T4-2 IgG和T4-β1菌落中胸腺嘧啶标记细胞的百分比：虽然T4-2免疫球蛋白菌落的高百分比（大于30%）仍在积极生长，但T4-2β1回复性腺泡的生长速度大大降低，与S-1腺泡中观察到的生长速度相似。(（f）)S-1、T4-2、T4-2-IgG和T4-β1菌落中细胞周期蛋白D1水平的免疫印迹：经β1抑制性抗体治疗后，D1细胞周期蛋白水平明显降低至S-1腺泡水平。(克和克Ⅳ型胶原沉积作为基底膜组织的指标：T4-β1还原腺泡(克′）在细胞与ECM的连接处沉积了一个有组织的含IV型胶原的BM，类似于在S-1腺泡中观察到的情况（见图1b条). 注意与T4-2模拟治疗肿瘤集落的对比(克). （未显示层粘连蛋白的比较结果。）所有培养物在EHS内10–12天后进行分析。条形图：(a–a''和b–b〃）16μm；(克和克′）25μm。
图6
图6
表型逆转与选择相反。在EHS内直接观察到的存在抗β1整合素功能阻断抗体（T4β1）、模拟抗体（非特异性IgG）（T4-2-IgG）或无抗体（T4-2）的情况下生长的T4-2细胞的相差显微照片：尽管进行了两轮治疗，这些抗体回复细胞在没有抗体的情况下培养时能够恢复其原有的致瘤表型。在EHS中10–12天后对所有培养物进行分析。棒材，50μm。
图7
图7
S-1细胞中α6/β4-整合素信号的改变导致无组织集落的形成。(一和一′）α6-（德克萨斯红）和β4-整合素（FITC）双重免疫染色的共焦荧光显微镜：T4-β1回复性腺泡(一′）显示基本极化的α6-和β4-整合素，而T4-2模拟治疗（T-4IgG）菌落(一)表现出无组织、无极化的表达。(b条)使用生物素化的β4-整合素异二聚体的细胞表面表达：相对于S-1腺泡，肿瘤集落的β4-整合素异二聚体细胞表面水平较低（低60%）（见图3d日)，在T4-β1恢复的腺泡中恢复（比T4-2集落高40%）。(c（c）)p21的免疫印迹cip、waf-1T4-2 IgG和T4-β1菌落中的水平：在T4-β1逆转的腺泡中，p21蛋白水平明显升高。(d日和d日′）S-1非恶性腺泡的相衬显微照片(d日)和致瘤T4-2菌落(d日’）直接在EHS:S-1细胞形成球形结构(d日)而T4-2细胞形成不规则的大菌落(d日′). (e（电子）和e（电子）′）经功能改变β4-整合素抗体处理的S-1非恶性细胞的相差显微镜(e（电子）)和用功能阻断β1-整合素抗体治疗的致瘤T4-2细胞(e（电子）直接在EHS内观察：经β4整合素抗体处理的S-1细胞形成了不规则的大菌落(e（电子）)而用β1-整合素功能阻断抗体处理T4-2细胞(e（电子）′）形成类似于S-1腺泡的球形结构（见图1一). 在EHS中10–12天后对所有培养物进行分析。棒材，16μm。
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