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.1997年4月7日；137(1):51-65.
doi:10.1083/jcb.137.1.51。

Ii链控制主要组织相容性复合体Ii类分子往返溶酶体的运输

V Brachet公司 1, G拉波索, S阿米戈雷纳, I梅尔曼
附属公司

Ii链控制主要组织相容性复合体Ii类分子往返溶酶体的运输

V Brachet公司等。 J细胞生物学. .

摘要

主要组织相容性复合体II类分子合成为一种非聚合物复合体，由三个α-β二聚体与三个不变（II）链结合而成。在离开TGN后，Ii链细胞质域中的靶向信号将复合物引导至内胚体，在内胚体中Ii链被蛋白质水解处理并去除，允许Ii类分子在到达细胞表面之前结合抗原肽。Ii链解离和肽结合被认为发生在与内体（指定为CIIV）或溶酶体（指定为MIIC）相关的一个或多个内体后位点。我们现在发现，除了最初将α-β二聚体靶向内体外，Ii链还调节Ii类分子的后续转运。在正常条件下，小鼠A20 B细胞将所有新合成的II类I-A（B）α-β二聚体运输至质膜，几乎没有到达溶酶体室。然而，半胱氨酸/丝氨酸蛋白酶抑制剂leupeptin对Ii加工的抑制阻止了向细胞表面的转运，并导致溶酶体中I-a（b）类Ii分子的显著但选择性的积累。在leupeptin中，I-A（b）二聚体与10-kD NH2-末端的Ii链片段（Ii-p10）形成稳定的络合物，通常是Ii链加工中的一种瞬态中间产物。去除leupeptin后，Ii-p10被降解并释放，I-A（b）二聚体结合抗原肽，肽载二聚体缓慢地从溶酶体运输到质膜。我们的结果表明，Ii链处理速度或效率的改变可以改变Ii类分子的后体内分选，导致类溶酶体MIIC中α-β二聚体的积累增加。因此，Ii链处理的简单差异可能解释了在不同细胞类型或不同发育阶段的溶酶体室中发现的高度可变的Ii类数量。

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数字

图1
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白蛋白肽诱导SDS抗性I-A的积累b条Ii-p10复合物。(A类)亮肽诱导与I-A共沉淀的10-kD（Ii-p10）和70-kD（p70）蛋白质的积累b条.I-A类b条–将表达A20的细胞用[35S] 蛋氨酸，并在37°C下追逐指定时间，有或没有2 mM亮氨酸肽。分析后，I-Ab条使用Y3P单克隆抗体免疫沉淀分子。样品在SDS-PAGE前未煮沸。追踪30分钟前未检测到标记的II类分子，因为用于免疫沉淀的Y3P单克隆抗体未检测到与完整II链复合的未成熟αβ二聚体。(B类)p70代表含有II类α和β链以及10-kD蛋白的SDS稳定复合物。在20分钟脉冲和4小时追逐后，使用或不使用2 mM leupeptin（通道磅和C类使用Y3P单克隆抗体免疫沉淀II类分子，并煮沸样品(B类)或者没有煮熟(注)SDSPAGE之前。煮沸后，p70定量分解为对应于αβ和Ii-p10的单体。(C类)p70代表SDS-stable I-Ab条αβ–Ii-p10络合物。在leupeptin存在下，经过20分钟脉冲和4小时追踪后，II类分子被抗I-a免疫沉淀b条（Y3P）或抗-Ii链胞质域（IN-1）单克隆抗体。虽然两种抗体都沉淀了p70复合物，但只有抗II类mAb沉淀了60 kD SDS稳定的紧密二聚体。因此，p70而非紧密二聚体与包含Ii链细胞质结构域的Ii链或Ii链片段（即Ii-p10）络合。(D类)Ii-p10和I-A之间的结合动力学b条或I-Ad日如上所述，使用仅表达I-A的A20细胞进行脉冲相实验d日或同时表达I-Ad日和I-Ab条.I-Ad日或I-Ab条然后使用特异性单克隆抗体（Y3P和MKD6）免疫沉淀含–的复合物，并通过磷光成像定量与Ii类分子相关的Ii-p10的数量。Ii-p10与I-A的关联b条在整个追捕期内一直坚持，而Ii-p10–I-Ad日复合物只是短暂出现的。
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亮肽诱导SDS抗性I-A的积累b条Ii-p10复合物。(A类)白蛋白肽诱导与I-A共沉淀的10kD（Ii-p10）和70kD（p70）蛋白的积累b条.I-A类b条–将表达A20的细胞用[35S] 蛋氨酸，并在37°C下追逐指定时间，有或没有2 mM亮氨酸肽。分析后，I-Ab条使用Y3P单克隆抗体免疫沉淀分子。样品在SDS-PAGE前未煮沸。追踪30分钟前未检测到标记的II类分子，因为用于免疫沉淀的Y3P单克隆抗体未检测到与完整II链复合的未成熟αβ二聚体。(B类)p70代表含有II类α和β链以及10-kD蛋白的SDS稳定复合物。在20分钟脉冲和4小时追逐后，使用或不使用2 mM leupeptin（通道磅和C类使用Y3P单克隆抗体免疫沉淀II类分子，并煮沸样品(B类)或者没有煮熟(注)SDSPAGE之前。煮沸后，p70定量分解为对应于αβ和Ii-p10的单体。(C类)p70代表SDS-stable I-Ab条αβ–Ii-p10络合物。在leupeptin存在下，经过20分钟脉冲和4小时追踪后，II类分子被抗I-a免疫沉淀b条（Y3P）或抗-Ii链胞质域（IN-1）单克隆抗体。虽然两种抗体都能沉淀p70复合物，但只有抗II类单抗能沉淀60-kD SDS稳定的致密二聚体。因此，p70而非紧密二聚体与包含Ii链细胞质结构域的Ii链或Ii链片段（即Ii-p10）络合。(D类)Ii-p10与I-A缔合动力学b条或I-Ad日如上所述，使用仅表达I-A的A20细胞进行脉冲相实验d日或同时表达I-Ad日和I-Ab条.I-A类d日或I-Ab条然后使用特异性单克隆抗体（分别为Y3P和MKD6）对含–的复合物进行免疫沉淀，并通过荧光成像对与Ii类分子相关的Ii-p10的量进行定量。Ii-p10与I-A的关联b条在整个追捕期内一直坚持，而Ii-p10–I-Ad日复合物只是短暂出现的。
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亮肽诱导SDS抗性I-A的积累b条Ii-p10复合物。(A类)亮肽诱导与I-A共沉淀的10-kD（Ii-p10）和70-kD（p70）蛋白质的积累b条.I-A类b条将表达A20的细胞用脉冲处理20分钟[35S] 蛋氨酸，并在37°C下追逐指定时间，有或没有2 mM亮氨酸肽。分析后，I-Ab条使用Y3P单克隆抗体免疫沉淀分子。样品在SDS-PAGE前未煮沸。追踪30分钟前未检测到标记的II类分子，因为用于免疫沉淀的Y3P单克隆抗体未检测到与完整II链复合的未成熟αβ二聚体。(B类)p70代表含有II类α和β链以及10-kD蛋白的SDS稳定复合物。在20分钟脉冲和4小时追逐后，使用或不使用2 mM leupeptin（通道磅和C类使用Y3P单克隆抗体免疫沉淀II类分子，并煮沸样品(B类)或者没有煮熟(注)SDSPAGE之前。煮沸后，p70定量分解为对应于αβ和Ii-p10的单体。(C类)p70代表SDS-stable I-Ab条αβ–Ii-p10络合物。在leupeptin存在下，经过20分钟脉冲和4小时追踪后，II类分子被抗I-a免疫沉淀b条（Y3P）或抗-Ii链胞质域（IN-1）单克隆抗体。虽然两种抗体都能沉淀p70复合物，但只有抗II类单抗能沉淀60-kD SDS稳定的致密二聚体。因此，p70而非紧密二聚体与包含Ii链细胞质结构域的Ii链或Ii链片段（即Ii-p10）络合。(D类)Ii-p10和I-A之间的结合动力学b条或I-Ad日如上所述，使用仅表达I-A的A20细胞进行脉冲追逐实验d日或同时表达I-Ad日和I-Ab条.I-A类d日或I-Ab条然后使用特异性单克隆抗体（Y3P和MKD6）免疫沉淀含–的复合物，并通过磷光成像定量与Ii类分子相关的Ii-p10的数量。Ii-p10与I-A的关联b条在整个追逐期内持续存在，而Ii-p10–I-Ad日复合物只是短暂出现的。
图1
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亮肽诱导SDS抗性I-A的积累b条Ii-p10复合物。(A类)亮肽诱导与I-A共沉淀的10-kD（Ii-p10）和70-kD（p70）蛋白质的积累b条.I-A类b条–将表达A20的细胞用[35S] 蛋氨酸，并在37°C下追逐指定时间，有或没有2 mM亮氨酸肽。裂解后，I-Ab条使用Y3P单克隆抗体免疫沉淀分子。样品在SDS-PAGE前未煮沸。追踪30分钟前未检测到标记的II类分子，因为用于免疫沉淀的Y3P单克隆抗体未检测到与完整II链复合的未成熟αβ二聚体。(B类)p70代表含有II类α和β链以及10-kD蛋白的SDS稳定复合物。在20分钟脉冲和4小时追逐后，使用或不使用2 mM leupeptin（通道磅和C类使用Y3P单克隆抗体免疫沉淀II类分子，并煮沸样品(B类)或者没有煮熟(注)SDSPAGE之前。煮沸后，p70定量分解为对应于αβ和Ii-p10的单体。(C类)p70代表SDS-stable I-Ab条αβ–Ii-p10络合物。在leupeptin存在下，经过20分钟脉冲和4小时追踪后，II类分子被抗I-a免疫沉淀b条（Y3P）或抗-Ii链胞质域（IN-1）单克隆抗体。虽然两种抗体都能沉淀p70复合物，但只有抗II类单抗能沉淀60-kD SDS稳定的致密二聚体。因此，p70而非紧密二聚体与包含Ii链细胞质结构域的Ii链或Ii链片段（即Ii-p10）络合。(D类)Ii-p10和I-A之间的结合动力学b条或I-Ad日如上所述，使用仅表达I-A的A20细胞进行脉冲相实验d日或同时表达I-Ad日和I-Ab条.I-A类d日或I-Ab条然后使用特异性单克隆抗体（Y3P和MKD6）免疫沉淀含–的复合物，并通过磷光成像定量与Ii类分子相关的Ii-p10的数量。Ii-p10与I-A的关联b条在整个追捕期内一直坚持，而Ii-p10–I-Ad日复合物只是短暂出现的。
图2
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Ii-p10相关Ii类分子的细胞内滞留。在存在或不存在2 mM亮氨酸肽的情况下，对细胞进行20分钟的脉冲处理，并追踪指定的时间（h）。在每个时间点，细胞在裂解前被表面生物素化。使用单克隆抗体Y3P和链霉亲和素琼脂糖依次免疫沉淀总的和细胞表面生物素化的II类分子。然后在电泳前不用煮沸，用SDS-PAGE对样品进行分析。在未经处理的对照细胞中(顶部)，肽负载，60-kD紧密αβ二聚体（“C类”）开始出现在总溶解物中，并在追逐0.5小时后出现在表面上。少量Ii-p10–αβ二聚体的p70复合物在追逐0.5小时时短暂出现。在亮氨酸蛋白酶处理的细胞中(底部)到0.5h时，p70开始在总裂解物中积累，但在质膜上几乎没有恢复。肽负载的致密二聚体仅在2–4小时后才开始出现在裂解物和细胞表面。
图3
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通过自由流电泳分离leupeptin处理的A20细胞。(A类)A20细胞被脉冲标记20分钟，并在亮氨酸蛋白酶存在下追踪2小时，然后用FFE进行分离。通过离心法造粒每个组分中收集的膜，并在Triton X-100和I-A中溶解b条使用单克隆抗体MKD6免疫沉淀II类分子。然后在不煮沸的情况下，用SDS-PAGE对样品进行分析。紧密二聚体的位置（“C类“）、α、β链、Ii-p10和未知来源的p12蛋白与主要蛋白峰（质膜）、内切体/溶酶体（β-己糖胺酶）和阳极移位的含CIIV组分的标记物位置相关。(左侧)阳极；(正确的)阴极。(B类)I-A公司b条表达–的A20细胞被脉冲标记20分钟，并在存在亮氨酸蛋白酶的情况下追踪4小时，然后用FFE进行分离。指出了p70（Ii-p10–αβ复合物）、60-kD肽负载的紧密二聚体、游离α链和β链以及Ii-p0的位置。(C类)FFE图谱中质膜（碱性磷酸二酯酶）和内体/溶酶体（β-己糖胺酶）标记酶的位置如所示B。p70主要与溶酶体标志物β-己糖胺酶共配。
图3
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通过自由流电泳分离leupeptin处理的A20细胞。(A类)A20细胞被脉冲标记20分钟，并在亮氨酸蛋白酶存在下追踪2小时，然后用FFE进行分离。通过离心法造粒每个组分中收集的膜，并在Triton X-100和I-A中溶解b条使用mAb MKD6对II类分子进行免疫沉淀。然后在不煮沸的情况下，用SDS-PAGE对样品进行分析。紧密二聚体的位置（“C类“）、α、β链、Ii-p10和未知来源的p12蛋白与主要蛋白峰（质膜）、内切体/溶酶体（β-己糖胺酶）和阳极移位的含CIIV组分的标记物位置相关。(左侧)阳极；(正确的)阴极。(B类)I-A公司b条表达–的A20细胞被脉冲标记20分钟，并在存在亮氨酸蛋白酶的情况下追踪4小时，然后用FFE进行分离。指出了p70（Ii-p10–αβ复合物）、60-kD肽负载的紧密二聚体、游离α链和β链以及Ii-p0的位置。(C类)FFE图谱中质膜（碱性磷酸二酯酶）和内体/溶酶体（β-己糖胺酶）标记酶的位置如所示B。p70主要与溶酶体标记物β-己糖胺酶共分布。
图3
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通过自由流电泳分离leupeptin处理的A20细胞。(A类)A20细胞被脉冲标记20分钟，并在亮氨酸蛋白酶存在下追踪2小时，然后用FFE进行分离。通过离心法造粒每个组分中收集的膜，并在Triton X-100和I-A中溶解b条使用单克隆抗体MKD6免疫沉淀II类分子。然后在不煮沸的情况下，用SDS-PAGE对样品进行分析。紧密二聚体的位置（“C类“）、α、β链、Ii-p10和未知来源的p12蛋白与主要蛋白峰（质膜）、内切体/溶酶体（β-己糖胺酶）和阳极移位的含CIIV组分的标记物位置相关。(左侧)阳极；(正确的)阴极。(B类)I-A公司b条表达–的A20细胞被脉冲标记20分钟，并在存在亮氨酸蛋白酶的情况下追踪4小时，然后用FFE进行分离。指出了p70（Ii-p10–αβ复合物）、60-kD肽负载的紧密二聚体、游离α链和β链以及Ii-p0的位置。(C类)FFE图谱中质膜（碱性磷酸二酯酶）和内体/溶酶体（β-己糖胺酶）标记酶的位置如所示B。p70主要与溶酶体标记物β-己糖胺酶共分布。
图4
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通过免疫荧光显微镜观察，亮肽治疗导致MHC II类分子在含有lgp的结构中积聚。对照或亮蛋白肽处理（3小时，2 mM亮蛋白肽）I-Ab条–表达A20的细胞被固定、渗透，然后进行MHC II类染色（FITC，使用单克隆抗体Y3P，两个上部面板)vs lgp-B（TRITC，使用单克隆抗体GL2A7，下部两个面板). 在对照细胞中，少量细胞内MHC II类定位于lgp-B通常为阴性的结构。这些可能代表CIIV和早期内体。然而，白肽治疗诱导了II类和lgp-B的广泛共定位。
图5
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Percoll梯度离心法分析新合成的MHC II类分子在leupeptin处理的细胞中向溶酶体的选择性再分配。(A类)白肽不影响分别含有β-己糖胺酶和Tfn-HRP（溶酶体和内体标记物）的腔室密度。在加入或不加入2 mM亮氨酸肽培养3小时后，允许细胞在37°C（有或无亮氨酸肽）下内化耦合至HRP的Tfn 30分钟，然后在Percoll密度梯度上进行均质和分级。测定单个组分中的β-己糖胺酶和HRP活性。高密度组分（梯度底部）含有大部分β-己糖胺酶活性，而Tfn-HRP主要存在于低密度组分中。leupeptin处理的细胞和对照细胞之间没有观察到差异。(B类)新合成的MHC II类分子在leupeptin处理的细胞中重新分布为高密度部分。在一个脉冲之后[35S] 蛋氨酸和1、2或4小时追逐(左边)或存在(正确的)亮肽的I-Ab条在Percoll梯度上分离表达A20的细胞。通过离心法造粒每个梯度组分中的膜，在Triton X-100中溶解，然后使用单克隆抗体对I-A进行免疫沉淀b条（Y3P）。通过SDS-PAGE对样品进行分析，并通过磷光成像和光学密度测定法对II类β链对应的条带进行定量。在leupeptin存在的情况下进行4小时追踪后，还对Ii-p10的强度进行了量化(左下角). 亮肽导致II类物质强烈重新分布到高密度组分中。大多数Ii-p10也存在于溶酶体组分中。正如预期的那样，Ii-p10在对照细胞中几乎检测不到，因此没有显示出来。
图5
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Percoll梯度离心法分析新合成的MHC II类分子在leupeptin处理的细胞中向溶酶体的选择性再分配。(A类)白肽不影响分别含有β-己糖胺酶和Tfn-HRP（溶酶体和内体标记物）的腔室密度。在加入或不加入2 mM亮氨酸肽培养3小时后，允许细胞在37°C（有或无亮氨酸肽）下内化耦合至HRP的Tfn 30分钟，然后在Percoll密度梯度上进行均质和分级。测定单个组分中的β-己糖胺酶和HRP活性。高密度组分（梯度底部）含有大部分β-己糖胺酶活性，而Tfn-HRP主要存在于低密度组分中。leupeptin处理的细胞和对照细胞之间没有观察到差异。(B类)新合成的MHC II类分子在leupeptin处理的细胞中重新分布为高密度部分。在一个脉冲之后[35S] 蛋氨酸和1、2或4小时追逐(左边)或存在(正确的)亮肽的I-Ab条在Percoll梯度上分离表达A20的细胞。通过离心法造粒每个梯度组分中的膜，在Triton X-100中溶解，然后使用单克隆抗体对I-A进行免疫沉淀b条（Y3P）。通过SDS-PAGE对样品进行分析，并通过磷光成像和光学密度测定法对II类β链对应的条带进行定量。在leupeptin存在的情况下进行4小时追踪后，还对Ii-p10的强度进行了量化(左下角). 亮肽导致II类物质强烈重新分布到高密度组分中。Ii-p10的大部分也在含有溶酶体的组分中发现。正如预期的那样，Ii-p10在对照细胞中几乎检测不到，因此没有显示出来。
图5
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Percoll梯度离心法分析新合成的MHC II类分子在leupeptin处理的细胞中向溶酶体的选择性再分配。(A类)白肽不影响分别含有β-己糖胺酶和Tfn-HRP（溶酶体和内体标记物）的腔室密度。在加入或不加入2 mM亮氨酸肽培养3小时后，允许细胞在37°C（有或无亮氨酸肽）下内化耦合至HRP的Tfn 30分钟，然后在Percoll密度梯度上进行均质和分级。测定单个组分中的β-己糖胺酶和HRP活性。高密度组分（梯度底部）含有大部分β-己糖胺酶活性，而Tfn-HRP主要存在于低密度组分中。leupeptin处理的细胞和对照细胞之间没有观察到差异。(B类)新合成的MHC II类分子在leupeptin处理的细胞中重新分布为高密度部分。在[35S] 蛋氨酸和1、2或4小时追逐(左边)或存在(正确的)左旋肽，I-Ab条在Percoll梯度上分离表达A20的细胞。通过离心法造粒每个梯度组分中的膜，在Triton X-100中溶解，然后使用单克隆抗体对I-A进行免疫沉淀b条（Y3P）。通过SDS-PAGE对样品进行分析，并通过磷光成像和光学密度测定法对II类β链对应的条带进行定量。在leupeptin存在的情况下进行4小时追踪后，还对Ii-p10的强度进行了量化(左下角). 亮肽导致II类物质强烈重新分布到高密度组分中。大多数Ii-p10也存在于溶酶体组分中。正如预期的那样，Ii-p10在对照细胞中几乎检测不到，因此没有显示出来。
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Percoll梯度离心法分析新合成的MHC II类分子在leupeptin处理的细胞中向溶酶体的选择性再分配。(A类)白肽不影响分别含有β-己糖胺酶和Tfn-HRP（溶酶体和内体标记物）的腔室密度。在加入或不加入2 mM亮氨酸肽培养3小时后，允许细胞在37°C（有或无亮氨酸肽）下内化耦合至HRP的Tfn 30分钟，然后在Percoll密度梯度上进行均质和分级。测定单个组分中的β-己糖胺酶和HRP活性。高密度组分（梯度底部）含有大部分β-己糖胺酶活性，而Tfn-HRP主要存在于低密度组分中。leupeptin处理的细胞和对照细胞之间没有观察到差异。(B类)新合成的MHC II类分子在leupeptin处理的细胞中重新分布为高密度部分。在[35S] 蛋氨酸和1、2或4小时追逐(左边)或存在(正确的)左旋肽，I-Ab条在Percoll梯度上分离表达A20的细胞。通过离心法造粒每个梯度组分中的膜，在Triton X-100中溶解，然后使用单克隆抗体对I-A进行免疫沉淀b条（Y3P）。通过SDS-PAGE对样品进行分析，并通过磷光成像和光学密度测定法对II类β链对应的条带进行定量。在亮蛋白肽存在下进行4小时追逐后，也对Ii-p10强度进行了定量(左下角). 亮肽导致II类物质强烈重新分布到高密度组分中。大多数Ii-p10也存在于溶酶体组分中。正如预期的那样，Ii-p10在对照细胞中几乎检测不到，因此没有显示出来。
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Percoll梯度离心法分析新合成的MHC II类分子在leupeptin处理的细胞中向溶酶体的选择性再分配。(A类)白肽不影响分别含有β-己糖胺酶和Tfn-HRP（溶酶体和内体标记物）的腔室密度。在加入或不加入2 mM亮氨酸肽培养3小时后，允许细胞在37°C（有或无亮氨酸肽）下内化耦合至HRP的Tfn 30分钟，然后在Percoll密度梯度上进行均质和分级。测定单个组分中的β-己糖胺酶和HRP活性。高密度组分（梯度底部）含有大部分β-己糖胺酶活性，而Tfn-HRP主要存在于低密度组分中。亮蛋白肽处理的细胞和对照细胞之间没有观察到差异。(B类)新合成的MHC II类分子在leupeptin处理的细胞中重新分布为高密度部分。在一个脉冲之后[35S] 蛋氨酸和1、2或4小时追逐(左边)或存在(正确的)左旋肽，I-Ab条在Percoll梯度上分离表达A20的细胞。通过离心法造粒每个梯度组分中的膜，在Triton X-100中溶解，然后使用单克隆抗体对I-A进行免疫沉淀b条（Y3P）。通过SDS-PAGE对样品进行分析，并通过磷光成像和光学密度测定法对II类β链对应的条带进行定量。在leupeptin存在的情况下进行4小时追踪后，还对Ii-p10的强度进行了量化(左下角). 亮肽导致II类物质强烈重新分布到高密度组分中。大多数Ii-p10也存在于溶酶体组分中。正如预期的那样，Ii-p10在对照细胞中几乎检测不到，因此没有显示出来。
图6
图6
亮氨酸肽处理细胞中MHC II类分子的免疫金定位。超薄冰冻切片用免疫金标记抗II类单克隆抗体M5.114和蛋白A金（PAG-10）。(A类)在对照细胞中，MHC II类分子位于质膜上，位于以内膜存在为特征的细胞内隔间。(B类)在leupeptin处理的细胞（18小时处理）中，在质膜上检测到MHC II类分子，并在显示内膜的电子致密隔间中积聚。棒，120纳米。
图7
图7
白介素处理细胞中MHC II类、II链和lgp-B的分布。(A类)对照细胞和leupeptin处理细胞中MHC II类、II类和lgp-B的定量。定量是在Ii链标记的超薄冰冻切片免疫金（抗-Ii胞浆尾mAb IN1）和MHCⅡ类（兔抗-I-A胞浆域血清）或lgp-B标记的免疫金（单抗GL2A7）和MHC-Ⅱ类（家兔抗-IA胞浆域血清）或Igp-B标签的免疫金上进行的和MHC II类（兔抗I-A细胞质域血清）。在每种情况下，分析了40个细胞图谱。(B类)亮氨酸肽处理细胞中Ii链、lgp-B和I-A的免疫金定位。(上部面板)超薄冰冻切片用Ii链抗体IN-1（抗-Ii胞浆结构域；Ii中青旅)和兔抗I-A细胞溶质尾多克隆抗体。Ii链堆积在I-A阳性隔间中，显示内部囊泡和电子密度含量。(下部面板)超薄冰冻切片用抗-lgp-B单克隆抗体GL2A7和兔抗-I-A细胞溶质尾多克隆抗体双重免疫金标记。II类分子在电子密度高、lgp-B阳性的隔间中可见。显示了金颗粒的大小。棒，120纳米。
图7
图7
白介素处理细胞中MHC II类、II链和lgp-B的分布。(A类)对照细胞和leupeptin处理细胞中MHC II类、II类和lgp-B的定量。定量是在Ii链标记的超薄冰冻切片免疫金（抗-Ii胞浆尾mAb IN1）和MHCⅡ类（兔抗-I-A胞浆域血清）或lgp-B标记的免疫金（单抗GL2A7）和MHC-Ⅱ类（家兔抗-IA胞浆域血清）或Igp-B标签的免疫金上进行的和MHC II类（兔抗I-A细胞质域血清）。在每种情况下，分析了40个细胞轮廓。(B类)亮氨酸肽处理细胞中Ii链、lgp-B和I-A的免疫金定位。(上部面板)超薄冰冻切片用Ii链抗体IN-1（抗-Ii胞浆结构域；Ii中青旅)和兔抗I-A细胞溶质尾多克隆抗体。Ii链堆积在I-A阳性隔间中，显示内部囊泡和电子密度含量。(下部面板)超薄冰冻切片用抗-lgp-B单克隆抗体GL2A7和兔抗-I-A细胞溶质尾多克隆抗体双重免疫金标记。II类分子在电子密度高、lgp-B阳性的隔间中可见。显示了金颗粒的大小。棒材，120 nm。
图8
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leupeptin阻滞的逆转导致MHCⅡ类从溶酶体转运到细胞表面。(A类)leupeptin对I-A细胞内滞留作用的可逆性b条II类分子。细胞被代谢标记20分钟，然后在亮氨酸肽的持续存在下追逐4小时。然后去除亮氨酸肽，培养细胞0–24小时。细胞表面生物素化后，细胞被裂解，总(左边)或表面(正确的)I-A公司b条分子依次进行免疫沉淀。去除leupeptin后，p70（Ii-p10–αβ复合物）的总量缓慢下降，而肽负载的、SDS稳定的致密二聚体（“C类”）增加。Ii-p10在这段时间里完全消失了。滞后后（参见B类)细胞表面开始出现致密的二聚体。(B类)致密二聚体形成和转运到细胞表面的动力学。通过磷光成像定量了与总二聚体和表面致密二聚体相对应的谱带。致密二聚体的形成与随后在细胞表面出现的时间间隔为3-4小时。
图8
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亮蛋白肽阻断的逆转导致MHC II类从溶酶体转运到细胞表面。(A类)leupeptin对I-A细胞内滞留作用的可逆性b条II类分子。细胞被代谢标记20分钟，然后在亮氨酸肽的持续存在下追逐4小时。然后去除亮氨酸肽，培养细胞0–24小时。细胞表面生物素化后，细胞被裂解，总(左边)或表面(正确的)I-A公司b条分子按顺序免疫沉淀。去除leupeptin后，p70（Ii-p10–αβ复合物）的总量缓慢下降，而肽负载的、SDS稳定的致密二聚体（“C类”）增加。Ii-p10在这段时间里完全消失了。滞后后（参见B类)细胞表面开始出现致密的二聚体。(B类)致密二聚体形成和转运到细胞表面的动力学。通过磷光成像定量了与总二聚体和表面致密二聚体相对应的谱带。致密二聚体的形成与随后在细胞表面出现的时间间隔为3-4小时。
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leupeptin阻滞的逆转导致MHCⅡ类从溶酶体转运到细胞表面。(A类)leupeptin对I-A细胞内滞留作用的可逆性b条II类分子。细胞被代谢标记20分钟，然后在亮蛋白胨的持续存在下追逐4小时。然后去除亮蛋白胨，将细胞孵育0-24小时。细胞表面生物素化后，裂解细胞(左边)或表面(正确的)I-A公司b条分子按顺序免疫沉淀。去除leupeptin后，p70（Ii-p10–αβ复合物）的总量缓慢下降，而肽负载的、SDS稳定的致密二聚体（“C类”）增加。Ii-p10在这段时间里完全消失了。滞后后（参见B类)细胞表面开始出现致密的二聚体。(B类)致密二聚体形成和转运到细胞表面的动力学。通过磷光成像定量了与总二聚体和表面致密二聚体相对应的谱带。致密二聚体的形成与随后在细胞表面出现的时间间隔为3-4小时。
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